Средство, способ его получения и способ для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, касается производства медицинских иммунобиологических препаратов и лабораторной диагностики возбудителя инфекционного заболевания человека, в частности средства и способа экспресс-диагностики (индикации) вируса клещевого энцефалита.

Известно средство и способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита путем иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием приготовленного иммуноглобулина против клещевого энцефалита и его конъюгата с пероксидазой хрена [1].

Однако данный способ длителен по времени (6-7 часов), трудоемок, так как необходимо выполнение пяти этапов исследования, а также при выполнении способа требуется дорогостоящее оборудование.

Ближайшим по технологической сущности (прототипом) к предлагаемому нами способу экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита является способ путем проведения реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) ближайшим средством и способом для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита (прототипом) служит эритроцитарный диагностикум и способ его получения. Эритроцитарный диагностикум представляет собой 3%-ную взвесь эритроцитов барана, фиксированных формалином или акролеином, обработанных танином и сенсибилизированных иммуноглобулином к вирусу клещевого энцефалита [2, 3].

Эритроцитарный диагностикум получают следующим образом:

3%-ную взвесь фиксированных акролеином или формалином и тонизированных бараньих эритроцитов сенсибилизируют 0,05-0,1%-ным иммуноглобулином против клещевого энцефалита при 56°С в течение 30 минут. Затем центрифугируют 10 минут при 2000 оборотах в минуту, дважды отмывают в 1%-ной НКС с последующим центрифугированием, осадок ресуспендируют наполнителем: ФБР рН 7,2, пептон - 3%, сахароза - 1%.

Сенсибилизированные эритроциты специфически связываются с антигеном возбудителя в исследуемом материале, что визуально выражается в проявлении феномена гемагглютинации в РНГА.

Способ РНГА ставят микрометодом в общем объеме 75 мкл, используя пластины U системы "Такачи" фирмы "Мэтримпэкс" или любые другие планшеты, предназначенные для серологических анализов.

Способ РНГА ставят следующим образом:

Во все лунки планшета раскапывают по 25 мкл 1%-ного раствора НКС. В первую лунку каждого ряда вносят по 25 мкл антигена (К+, К-, исследуемый материал). Перемешивают и последовательно переносят во все лунки соответствующих рядов. Получают разведения антигенов с коэффициентом 2, затем во все лунки добавляют по 25 мкл 1%-ной НКС и 1%-ную взвесь эритроцитарного диагностикума. Проводят контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию: в 2-3 лунки вносят по 50 мкл 1%-ной НКС и по 25 мкл 1%-ной взвеси эритроцитарного диагностикума. Планшет встряхивают в горизонтальной плоскости для перемешивания ингредиентов и помещают при температуре (20±2)°С на 2-2,5 часа или на 1-1,5 часа при температуре (37±2)°С.

При отсутствии агглютинации в контролях эритроцитов реакцию учитывают по 4-крестовой системе визуально. Положительным результатом в РНГА считают агглютинацию эритроцитов на +3 +4. За титр антигена принимают его максимальное разведение, давшее гемагглютинацию на +3 +4. РНГА с К+ должна быть положительной, с К- - отрицательной.

Однако данное средство, способ его получения и способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита имеет следующие недостатки:

- длительность приготовления эритроцитарного диагностикума, чувствительность которого зависит от многих факторов: физиологического состояния эритроцитов барана, чистоты акролеина (или формалина), танина, температурных режимов каждого этапа технологического процесса и, наконец, от чистоты, специфической активности и авидности иммуноглобулина;

- выполнение способа РНГА занимает несколько часов, при этом теряется время и падает эффективность экстренной серопрофилактики пострадавшим, которая наиболее высока в первые сутки после укуса инфицированного клеща;

- способ РНГА недостаточно чувствителен и тем самым не дает желаемого результата, что является одним из важных условий для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита.

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является сокращение времени, повышение чувствительности, доступность и экономичность способа при сохранении высокой его специфичности.

Поставленная задача решается средством для экспресс-диагностики, содержащим 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем добавления к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту равного количества 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита, проведения сенсибилизации в течение 1-1,5 часов при температуре 25-30°С, ресуспендирования осадка в 0,15 М растворе хлорида натрия рН 5,4-5,5 и доведения полученного коагглютинирующего реагента до 2%-ного содержания и способом экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита путем нанесения на предметное стекло 15-20 мкл исследуемого материала и добавления в него равного количества средства, для экспресс-диагностики, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, тщательного перемешивания посредством покачивания предметного стекла и визуального определения через 2-7 минут по феномену коагглютинации наличия антигена вируса клещевого энцефалита и его количества по 3-х балльной системе.

В проанализированной авторами патентной и научно-медицинской литературе не найдено данной совокупности отличительных признаков, приводящих к новому техническому результату, и они явным образом не следуют для специалиста из уровня техники. Способ, средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита и способ его получения были апробированы в лабораторных условиях. Таким образом, данные технические решения соответствуют критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".

Средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита готовят следующим образом:

Сухой 10%-ный стафилококковый реагент растворяют в дистиллированной деионизованной воде, выдерживают 1,5-2,0 часа при комнатной температуре для набухания и прибавляют к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту равное количество 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита и проводят сенсибилизацию в течение 1-1,5 часов при температуре 25-30°С, затем центрифугируют 20 минут при 3000 оборотах в минуту, осадок ресуспендируют в 0,15 М растворе хлорида натрия рН 5,4-5,5 до 2%-ного содержания коагглютинирующего реагента, добавляют мертиолят натрия до 0,001%-ного содержания и сохраняют при температуре (7±3)°С в течение 4-6 месяцев.

Способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита осуществляют следующим образом:

На предметное стекло наносят 15-20 мкл исследуемого материала и добавляют в него равное количество средства для экспресс-диагностики, содержащее 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, тщательно перемешивают посредством покачивания предметного стекла и визуально определяют через 2-7 минут по феномену коагглютинации наличие антигена вируса клещевого энцефалита по 3-х балльной системе.

“3+” - образование агглютината и интенсивное просвечивание реакционной смеси (реакция резко положительная);

“2+” - отчетливое просветление смеси (реакция положительная);

“+” - маловыраженное просветление смеси (реакция слабоположительная);

“-” - отсутствие просветления (реакция отрицательная).

Предлагаемый способ позволяет выявить как наличие, так и количественное содержание антигена вируса клещевого энцефалита в исследуемом материале. Для количественного определения делают разведения исследуемого материала на 0,15 М растворе хлорида натрия с коэффициентом 2 и наносят их по 15-20 мкл на предметное стекло, добавляют равное количество средства для экспресс-диагностики, содержащее 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, перемешивают путем покачивания предметного стекла и через 2-7 минут визуально по феномену коагглютинации определяют титр антигена вируса клещевого энцефалита в исследуемом материале по 3-х балльной системе.

Положительным результатом предлагаемого способа считают коагглютинацию на +3 +2. За титр антигена (1 коагглютинирующая единица - КОАЕ) принимают его последнее разведение, давшее интенсивную коагглютинацию (на +2).

Предлагаемый нами способ и средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита основаны на феномене коагглютинации при взаимодействии специфических антител и антигена.

Для подтверждения специфичности предлагаемого способа и средства для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита титровали материал (субстрат), содержащий и не содержащий антиген вируса клещевого энцефалита (см. табл.1).

Предлагаемый способ и средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита сравнивали по чувствительности, определяя количество (титр) антигена вируса клещевого энцефалита путем разведения с коэффициентом 2 исследуемого материала на 0,15 М растворе хлорида натрия со способами экспресс-диагностики ИФА и РНГА. При этом титровали один и тот же материал, содержащий антиген вируса клещевого энцефалита, тремя способами: путем ИФА, РНГА и предлагаемым (см. табл.2). Исследуемым материалом служила вакцина клещевого энцефалита на разных стадиях технологического процесса.

Из приведенного материала следует, что предлагаемый способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, выполненный с помощью средства, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, специфичен, по количеству выявленного антигена вируса клещевого энцефалита и минимальному количеству белка Е во много раз чувствительнее способа РНГА и в среднем в 2-4 раза чувствительнее способа ИФА.

Таким образом, предлагаемый способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, выполненный с помощью средства, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем добавления к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту равного количества 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита, проведения сенсибилизации в течение 1-1,5 часов при температуре 25-30°С, ресуспендирования осадка в 0,15 М растворе хлорида натрия рН 5,4-5,5 и доведения полученного коагглютинирующего реагента до 2%-ного содержания, как и способы ИФА и РНГА, специфичен, но превосходит их по чувствительности и во много раз по экспрессности (время выполнения по ИФА - 6-7 часов, по РНГА 1.5-2.5 часа, по предлагаемому способу 2-7 минут), при простоте выполнения и экономичности (табл.3).

Список литературы

1. Лаптакова М.М., Морякин А.В., Лаврова Н.А. Разработка и применение иммунопероксидазной тест-системы для индикации вируса клещевого энцефалита. Сб. Актуальные вопросы медицинской биотехнологии и прикладной иммунологии. - Томск. - 1990. – том 36. – с 50-65.

2. Подоплекина Л.Е., Унгер Т.Н. Диагностикум эритроцитарный к вирусу клещевого энцефалита иммуноглобулиновый крысинный сухой для РНГА (эритроцитарный диагностикум к вирусу клещевого энцефалита). - ВФС 42. - 2874 - 97.

3. Подоплекина Л.Е., Унгер Т.Н. Экспериментально-производственный регламент № 527 - 95 Диагностикум эритроцитарный к вирусу клещевого энцефалита иммуноглобулиновый крысиный сухой для РНГА. НИИВС НПО “Вирион”.

Таблица 1.
№ п/п	ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ	ТИТР АНТИГЕНА ВИРУСА КЭ (в обр.ед.)
1	Вакцина КЭ “ЭнцеВир” сер. 10. с.г. 11.02. (производства ФГУП НПО “Вирион”)	512
2	Антиген вируса КЭ (К+) сер. 46 из набора эритроцитарного диагностикума. с.г. 2001 г. (производства ФГУП НПО “Вирион”)	256
3	Антиген мозга неинфицированных мышей (К-) сер.45 из набора эритроцитарного диагностикума с.г. 2001 г. (производства ФГУП НПО “Вирион”)	0
4	Антиген вируса КЭ (К+) сер. 55 из набора ИФА с.г. 30.10.02 (производства ФГУП НПО “Вирион”)	3200
5	Антиген мозга неинфицированных мышей (К-) сер.54 из набора ИФА с.г. 30.10.02 г. (производства ФГУП НПО “Вирион”)	0
Таблица 2.
№ п/п	ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ	ТИТР АНТИГЕНА ВИРУСА КЭ (в обр.ед.)
ИФА	РНГА	РКОА
1	Объединенный полуфабрикат вакцины КЭ (1)	32	<8	128
2	Концентрат вакцины КЭ (1)	1024	64	4096
3	Очищенный концентрат вакцины КЭ (1)	512	32	2048
4	Полуфабрикат вакцины КЭ (1)	128	<8	512
5	Объединенный полуфабрикат вакцины КЭ (2)	16	<8	32
6	Концентрат вакцины КЭ (2)	1024	64	2048
7	Очищенный концентрат вакцины КЭ (2)	512	32	512
8	Очищенный концентрат вакцины КЭ (3)	256	32	1024
9	Полуфабрикат вакцины КЭ до сорбции	256	32	256
Таблица 3. Чувствительность ИФА, РНГА, РКОА по белку Е.
№ п/п	ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ	СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКА Е (мкг/мл)	ИФА (обр.ед) БЕЛОК Е (нг)	РНГА (обр.ед.)	РКОА (обр.ед.)
БЕЛОК Е (нг)	БЕЛОК Е (нг)
1	Объединенный полуфабрикат вакцины КЭ(1)	0,06		<8
2	Концентрат вакцины КЭ(1)	11,93
3	Очищенный концентрат вакцины КЭ(1)	8,78
4	Полуфабрикат вакцины КЭ до сорбции (1)	4,13		<8
5	Концентрат вакцины КЭ(2)	2,48
6	Очищенный концентрат вакцины КЭ(2)	5,5
7	Очищенный концентрат вакцины КЭ(3)	6,93
8	Полуфабрикат вакцины КЭ до сорбции (2)	7,83

1. Средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, содержащее 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоочищенным и высокоавидным иммуноглобулином против клещевого энцефалита.

2. Способ приготовления средства для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, заключающийся в сенсибилизации, центрифугировании приготовленной взвеси, удалении надосадочной жидкости, ресуспендировании осадка и приготовлении реагента, отличающийся тем, что до сенсибилизации к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту добавляют высокоочищенный и высокоавидный иммуноглобулин против клещевого энцефалита, проводят сенсибилизацию в течение 1-1,5 ч, затем ресуспендируют осадок в 0,15 М растворе хлорида натрия и доводят полученный коагглютинирующий реагент до 2%-ного содержания.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что сенсибилизацию проводят при температуре 25-30°С.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту добавляют равное количество 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что осадок ресуспендируют в растворе 0,15 М хлорида натрия рН 5,4-5,5.

6. Способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита путем исследования материала, определения наличия и/или количественного содержания антигена вируса клещевого энцефалита путем разведения в 0,15 М растворе хлорида натрия, отличающийся тем, что на предметное стекло наносят исследуемый материал или его разведения в количестве 15-20 мкл, добавляют равное количество средства для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоочищенным и высокоавидным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, тщательно перемешивают путем покачивания предметного стекла и через 2-7 мин визуально определяют по феномену коагглютинации наличие и/или количество антигена вируса клещевого энцефалита.