Способ выявления жизнеспособных сальмонелл

Изобретение может быть использовано в медицине и микробиологии. Сущность изобретения сводится к тому, что исследуемый материал помещают в лунки планшета, поверхность которых покрыта специфическими иммуноглобулинами, инкубируют, отмывают и окрашивают флуоресцирующими Fab-фрагментами иммуноглобулинов к сальмонеллам группы А, В, С, D, Е. Далее планшеты инкубируют, отмывают и подсчитывают жизнеспособные сальмонеллы в поле зрения люминесцентного микроскопа. При увеличении количества жизнеспособных сальмонелл в 10 и более раз по сравнению с контролем без среды обогащения выявляют жизнеспособные сальмонеллы. Использование способа позволяет повысить специфичность и чувствительность выявления сальмонелл. 3 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно микробиологии, и может быть использовано в практическом здравоохранении для выявления сальмонелл в пищевых продуктах, объектах внешней среды, а также в экскрементах от больных сальмонеллезом взрослых и детей.

Известно обнаружение сальмонелл с помощью бактериологического метода в пищевых продуктах, объектах внешней среды, а также выделениях от больных детей и взрослых (В.И.Покровский, Черкасский Б.Л. Сальмонеллезы. Методические рекомендации, М.: Медицина, 1995, с. 108-176; Медицинская микробиология. /Под ред. В.И. Покровского, О.К. Поздеева. М., Медицина, 1999, с. 363-378).

Недостатки: метод недостаточно чувствителен (10-50%) и специфичен, продолжителен во времени (окончательный результат получают через 3-5 суток).

Наиболее близким аналогом выявления сальмонелл в пищевых продуктах и экскрементах от больных людей является прямой метод флуоресцирующих антител (пМФА), проводимый с предварительным обогащением исследуемого материала (Левина Е.Н. Метод иммунолюминесценции в бактериологии. //Иммунолюминесценция в медицине. М.: 1977, с. 46-60).

Недостатком его является невысокая чувствительность при исследовании нативного материала, а также материала, обсемененного посторонней микрофлорой; недостаточная специфичность, обусловленная наличием перекрестных реакций с общими антигенными детерминантами других представителей кишечной группы.

Важно, что при применении пМФА нельзя отдифференцировать жизнеспособные сальмонеллы от убитых сальмонелл, полученных с обсемененной возбудителем пищей.

Изобретение направлено на решение задач: повышения чувствительности и специфичности способа.

Решение указанных задач достигается путем помещения исследуемого материала в дифференциальную питательную среду, внесение смеси в лунки планшета, поверхность которых покрыта иммуноглобулинами к сальмонеллам групп A, B, C, D, E. Размножившиеся сальмонеллы взаимодействуют с этими иммуноглобулинами и удерживаются на поверхности лунок, их окрашивают флуоресцирующими Fab-фрагментами иммуноглобулинов к сальмонеллам групп A, B, C, D, E, подсчитывают в поле зрения люминесцентного микроскопа и при увеличении количества сальмонелл по сравнению с количеством сальмонелл, инкубированных без среды обогащения в 10 и более раз констатируют наличие в материале жизнеспособных сальмонелл.

Способ осуществляют следующим образом. В лунки 24 ячеечных планшетов вносят по 1 мл иммуноглобулинов к сальмонеллам групп A, B, C, D, E, разведенных карбонатно-бикарбонатным буферным раствором рН 9,5 до концентрации 1 мг/мл, и выдерживают при температуре (Т) 4-6С в течение 16-18 часов. По истечении времени инкубации содержимое лунок удаляют, а лунки промывают путем внесения 2 мл калий-фосфатного буферного раствора с твином-20 рН 7,4 (промывающий раствор), встряхивания в течение 1-2 мин и последующего удаления раствора из лунок. Такую процедуру повторяют еще 2 раза. Сенсибилизированные таким образом планшеты можно хранить при Т 4-6С в течение 1 месяца.

В 2-е лунки вертикального ряда сенсибилизированного планшета вносят по 1 мл исследуемого материала без дифференциальной среды (среда обогащения), в другие 2-е лунки этого ряда вносят по 1 мл смеси дифференциальной среды и исследуемого материала, взятых в соотношении 1:1, и инкубируют при 37С в течение 4 часов. После инкубации содержимое из лунок удаляют, а лунки промывают 2 мл промывающего раствора трехкратно.

В промытые лунки вносят флуоресцирующие Fab-фрагменты иммуноглобулинов к сальмонеллам групп A, B, C, D, E, взятые в рабочем разведении, и выдерживают при 37С в течение 30 мин. Затем содержимое лунок удаляют к лунки промывают 2 мл промывающего раствора трехкратно.

После последнего промывания планшеты просматривают в поле зрения люминесцентного микроскопа и подсчитывают количество сальмонелл, увеличение их количества по сравнению с количеством сальмонелл, инкубированных без среды обогащения в 10 и более раз указывает на наличие жизнеспособных сальмонелл.

Примеры конкретного применения.

Исследование пищевых продуктов и полуфабрикатов из них предлагаемым методом и методом-аналогом (табл. 1 и 2).

Как следует из данных, представленных в таблице, предлагаемый метод превышает по выявляемости сальмонелл метод-аналог.

Из представленных в таблице данных видно, что предлагаемый способ обладает большей чувствительностью как при выявлении сальмонелл в чистой культуре (в 10 раз), так и в обсемененной посторонней микрофлорой (E.coli) культуре сальмонелл (в 100 раз), чем метод-аналог.

По данным, представленным в таблице, предлагаемый метод специфичнее метода-аналога, так как выявляет только сальмонеллы и не взаимодействует с изученными гетерогенными представителями кишечной группы, кроме того, не выявляет стафилококки, поскольку для индикации сальмонелл используют флуоресцирующие Fab-фрагменты иммуноглобулинов, лишенные Fc-фрагмента, обладающего эффекторным центром, ответственным за связывание со стафилококком.

Положительный эффект предлагаемого способа заключается в повышении чувствительности в 10 раз, высокой специфичности по сравнению с методом-аналогом. Кроме того, использование полигрупповых (групп А, В, С1, D, Е, С2) флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов к сальмонеллам обеспечивает выявление не только групп А, В, D, но и других представителей основных групп сальмонелл (С1, С2, Е).

Формула изобретения

Способ выявления жизнеспособных сальмонелл в предварительно обогащенном исследуемом материале с помощью прямого метода флуоресцирующих антител с последующим выявлением сальмонелл в поле зрения люминесцентного микроскопа, отличающийся тем, что исследуемый материал помещают к лунки планшета, поверхность которых покрыта специфическими иммуноглобулинами к сальмонеллам групп A, B, C, D, E, инкубируют, отмывают и окрашивают флуоресцирующими Fab-фрагментами иммуноглобулинов к сальмонеллам групп A, B, C, D, E, инкубируют, отмывают и подсчитывают сальмонеллы в поле зрения люминесцентного микроскопа и по увеличению их количества в 10 и более раз по сравнению с количеством сальмонелл, инкубированных без среды обогащения, выявляют жизнеспособные сальмонеллы.