Способ определения скорости гидролиза липидов липазой в почвах

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и почвоведению, а именно к методам оценки биологической активности и почвенного плодородия по ферментативной активности почв. Способ заключается в определении скорости образования жирных кислот при взаимодействии липидов с почвой. Перед внесением в почву липиды переводят в порошкообразное состояние загущением гидрофильным аэросилом при содержании последнего 70-80 вес.%. Изобретение позволяет оценивать биологическую активность липазы и скорость ферментативной реакции в реальных почвенных условиях. 1 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и почвоведению, а именно к методам оценки биологической активности и почвенного плодородия по ферментативной активности почв.

Известен способ определения липазной активности почв [1], заключающийся в гидролизе трибутирина в водном растворе суспензии почвы. Согласно методу В. Покорной к навеске (0,5 г) почвы добавляют 1,5 мл толуола, через 15 минут - 9 мл дистиллированной воды и 1 мл трибутирина. Смесь инкубируют в течение 72 часов при 37С, добавляют 40 мл спиртоэфирной смеси (1:1) и взбалтывают. Суспензию отстаивают или фильтруют. В фильтрате определяют содержание образовавшейся масляной кислоты щелочным титрованием. Активность липазы выражают в мл 0,05 н. раствора гидрооксида натрия в пересчете на 0,5 г почвы.

Основным недостатком данного способа является определение скорости ферментативной реакции гидролиза трибутирина не в реальных почвенных условиях (влажность почвы, рН, состав почвенного поглощающего комплекса, содержание свободных солей, содержание органики и т.д.), в которых она протекает, а в суспензии почвы в растворе трибутирина. Такой подход позволяет с определенным приближением характеризовать количество ферментов в почве [2, 3], но не дает возможности определять активность липазы в почвенных условиях и делать выводы о скорости ферментативной реакции в реальности.

Наиболее близким к заявляемому является метод, основанный на изучении гидролиза растительного масла [1]. В соответствии с этим методом 5 г почвы помещают в колбу, обрабатывают 2 мл толуола и оставляют на 15 минут. Затем добавляют 5 мл дистиллированной воды, 5 мл ацетатного буфера (рН 7,0) и 2,5 мл растительного масла. Смесь помещают в термостат для инкубации на 72 часа при 30С. После инкубации к суспензии добавляют 10 мл 96% этанола, фильтруют и 10 мл субстрата титруют 0,1 н. спиртовым раствором гидрооксида калия в присутствии индикатора фенолфталеина. Активность липазы выражают в мл 0,1 н. раствора гидрооксида калия на 1 г почвы.

Недостатки данного метода также заключаются в проведении опыта в суспензии почвы, а не в самой почве, что не позволяет изучать влияние состава и физико-химических свойств почв на активность липазы в почвах и скорость ферментативной реакции. Отметим, что в отличие от концентрации активность ферментов может в десятки раз меняться при изменении рН или ионной силы почвенных растворов, степени иммобилизации и других факторов, обусловленных свойствами почв. Поэтому получение данных, характеризующих концентрацию ферментов недостаточно информативно, не позволяет однозначно характеризовать биологическую активность почв.

Целью изобретения является определение скорости гидролиза липидов липазой в реальных почвенных условиях. Данный параметр является одной из характеристик почвенной биологической активности и почвенного плодородия [4, 5].

Технической задачей изобретения является диспергирование липидов и равномерное распределение их в почве.

Поставленная задача решается введением в липид гидрофильного аэросила при его содержании 70-80 вес. % и переводе липида в порошкообразное состояние.

Техническая сущность изобретения заключается в переводе липида в порошок, обладающий большей степенью гидрофильности по сравнению с липидом, путем загущения его гидрофильным аэросилом при содержании аэросила в смеси 70-80 вес. % и тщательной гомогенизации полученной смеси в ступке. После приготовления навеска аэросильной смеси помещается в емкость, в которой уже находится почва, и перемешивается с ней. Отбор проб из смеси берут через 72 часа и определяют содержание органических кислот по стандартной для почв методике. Скорость гидролиза липидов липазой в почвах выражают в мл 0,1 н. раствора гидрооксида калия на 1 г почвы за 72 часа.

Предлагаемый способ исключает неопределенность перенесения данных по активности липазы в суспензии почвы на активность липазы в почве, так как позволяет проводить испытания непосредственно в почвах. Еще более важным достоинством способа является возможность проводить изучение влияния на скорость ферментативной реакции и биологическую активность почв различных внешних воздействий, что по существующим методикам невозможно в принципе.

Нижеследующие примеры раскрывают суть предлагаемого изобретения.

Пример 1

Эксперименты показывают, что при содержании аэросила А-380 (размер частиц 10-40 нм) в аэросильной смеси меньше 70% не удается равномерно распределить липиды в почве. В результате получаются заниженные значения по скорости ферментативной реакции.

Пример 2

При содержании аэросила А-380 в аэросильной смеси больше 80% количество аэросильной смеси при одном и том же отношении липид - почва становится слишком большим. Это искажает структуру почвы, изменяет ее насыпной вес. Проведение испытаний в таких смесях теряет смысл, так как это уже не почвы.

Пример 3

При содержании аэросила А-380 в аэросильной смеси 70-80 вес. % удается получить гомогенные смеси с почвой при незначительном изменении насыпного веса почвы. Для определения активности липазы в тепличном грунте брали 20 г почвы, помещали в чашку Петри. Туда же помещали навеску АС 0,83 (70%) или 1,25 (80%) г, соответствующую одинаковому содержанию липида (0,25 г) в почвенной смеси. Аэросильные смеси готовили введением аэросила А-380 в растительное масло и тщательно перетирали в ступке. Образцы тепличного грунта, содержащие аэросильные смеси, оставляли на 72 часа при комнатной температуре 23-24С. После этого проводили определение содержания органических кислот в почве по стандартной методике. Для сравнения определили липазную активность тепличного грунта по методике, являющейся ближайшим аналогом, и для возможности их сравнения отнесли полученные данные на 1 г субстрата (см. таблицу).

Полученные результаты свидетельствуют, что между скоростью ферментативной реакции, определенной в реальных почвенных условиях (заявляемый способ) и в суспензии (ближайший аналог), существует более чем трехкратное расхождение, причем в суспензии реакция протекает медленнее, несмотря на то, что проводится не при комнатной температуре, а при 30С. Это позволяет сделать вывод о том, что суспензионный метод определения активности липазы позволяет получать только оценочные данные по скорости ферментативной реакции в почве.

Таким образом, изобретение позволяет:

1. определять активность липазы и скорость ферментативной реакции в реальных почвенных условиях, а следовательно, корректно оценивать их биологическую активность;

2. изучать влияние свойств почв на скорость гидролиза липидов липазой в них;

3. определять влияние внешних факторов воздействия на скорость ферментативной реакции.

Литература

1. Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв. М.: Наука, 1976. 179 с.

2. Хазиев Ф.Х. Системно-экологический анализ ферментативной активности почв. М.: Наука, 1982, 203 с.

3. Звягинцев Д.Г. Проблемы биохимии почв. - Вестн. МГУ. Сер. 17, 1977, №1, с.74-84.

4. Кольцова О.М., Стекольников К.Е., Казанджьян П.К. Ферментативная активность как метод диагностики плодородия почв. - Мелиорация и водное хозяйство. 1993, №2, с.29-31.

5. Михайловская Н.А. Ферментативная активность как показатель плодородия дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы. Автореф. дис. канд. с-х наук. Минск, 1988, 17 с.

Формула изобретения

Способ определения скорости гидролиза липидов липазой в почвах, заключающийся в определении скорости образования жирных кислот при взаимодействии липидов с почвой, отличающийся тем, что липиды перед внесением в почву переводят в порошкообразное состояние загущением гидрофильным аэросилом при содержании последнего 70-80 вес.%.