Способ определения скорости разложения пероксида водорода каталазой в почвах

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и почвоведению, а именно к методам оценки биологической активности и почвенного плодородия по ферментативной активности почв. Способ включает определение скорости выделения кислорода при взаимодействии пероксида водорода с почвой. Пероксид водорода перед внесением в почву переводят в порошкообразное состояние загущением аэросилом при содержании последнего 38-42 вес.%. Способ позволяет определять скорость разложения пероксида водорода каталазой в реальных почвенных условиях. 1 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и почвоведению, а именно к методам оценки биологической активности и почвенного плодородия по ферментативной активности почв.

Известен способ определения каталазной активности почв [1], заключающийся в помещении в эрленмейеровскую колбу емкостью 100 мл 5 г почвы с последующей заливкой в колбу 25 мл 2%-ного раствора пероксида водорода и установке колбы в емкость с тающим льдом. Через определенные промежутки времени (0,5, 1 и 2,5 часа) из системы отбирают пробы по 5 мл, смешивают с 5 мл 10%-ной серной кислоты и титруют 0,1 н. раствором марганцевокислого калия до слабо розовой окраски. Каталазную активность почвы выражают в мл 0,1 н. раствора перманганата калия, пошедшего на титрование пробы, отобранной через 2,5 часа.

Основным недостатком данного способа является определение скорости ферментативной реакции разложения пероксида водорода не в реальных почвенных условиях (влажность почвы, рН, состав почвенного поглощающего комплекса, содержание свободных солей, содержание органики и т.д.), в которых она протекает, а в суспензии почвы в растворе пероксида водорода. Такой подход позволяет с определенным приближением характеризовать количество ферментов в почве [2, 3], но не дает возможности определять активность каталазы в почвенных условиях и делать выводы о скорости ферментативной реакции в реальности.

Наиболее близким к заявляемому является газометрический метод А.Ш. Галстяна [4], заключающийся в определении количества кислорода, выделившегося при распаде пероксида водорода в единицу времени. В соответствии с этим навеску (1 г) почвы вносят в колбу емкостью 100 мл, добавляют 0,5 г углекислого кальция для стабилизации рН на нейтральном уровне. На дно колбы с помощью пинцета помещают стаканчик с 5 мл 3%-ного раствора пероксида водорода. Колбу плотно закрывают каучуковой пробкой со стеклянной трубкой, которая соединена с измерительной системой. Опыт проводят при температуре 18-20С. Начало опыта отмечают по секундомеру в тот момент, когда сосуд с раствором пероксида водорода опрокидывают, и содержимое колбы встряхивают. Взбалтывание смеси проводят в течение всего опыта. Выделяющийся кислород вытесняет воду, уровень которой отмечают через 0,5, 1 и 2 мин. Активность каталазы выражают в мл кислорода, выделившегося за 1 минуту на 1 г почвы.

Недостатки данного метода также заключаются в проведении опыта в суспензии почвы, а не в реальной почве, что не позволяет изучать влияние состава и физико-химических свойств почв на активность каталазы в почвах. Отметим, что в отличие от концентрации активность ферментов может в десятки раз меняться при изменении рН или ионной силы почвенных растворов, степени иммобилизации и других факторов, обусловленных свойствами почв. Поэтому получение данных, характеризующих концентрацию ферментов, недостаточно информативно и не позволяет однозначно характеризовать активность ферментов и скорость ферментативных реакций.

Целью изобретения является определение скорости разложения пероксида водорода каталазой в реальных почвенных условиях. Данный параметр является важной характеристикой почвенной биологической активности и почвенного плодородия [5, 6].

Технической задачей изобретения является равномерное распределение пероксида водорода в почве при минимальном его разложении каталазой в процессе гомогенизации смеси.

Поставленная задача решается введением в раствор пероксида водорода гидрофильного аэросила при содержании аэросила 38-42% весовых и переводе пероксида водорода в порошкообразное состояние. Гидрофильный аэросил обладает размером частиц 10-40 нм, которые сорбируют на своей поверхности воздух. Для смачивания необходимо вытеснение воздуха с поверхности, поэтому смачивание слоя этих частиц происходит замедленно, что позволяет, варьируя толщину слоя, варьировать время смачивания.

Техническая сущность изобретения заключается в переводе раствора пероксида водорода в порошкообразное состояние путем загущения жидкости гидрофильным аэросилом при содержании аэросила в смеси 38-42% весовых и тщательной гомогенизации полученной смеси в ступке. После этого навеска аэросильной смеси (аэросил - раствор пероксида водорода) помещается в колбу, в которой уже находится навеска почвы, и перемешивается с ней 40-50 сек. Последующие операции полностью совпадают с прототипом. Колба подсоединяется к измерительной системе через 60 сек после контакта аэросильной смеси с почвой. Этого времени вполне хватает для перемешивания. Выделение кислорода фиксируется за 0,5, 1 и 2 мин. Скорость разложения пероксида водорода каталазой в почвах выражается в мл кислорода за 1 мин на 1 г почвы.

При изучении скорости ферментативной реакции данный метод позволяет варьировать содержание субстрата (пероксида водорода) в почве, изменяя соотношение аэросильная смесь - почва, или путем использования для приготовления аэросильных смесей растворов пероксида водорода различных концентраций. В связи с тем, что целью является изучение скорости разложения каталазой пероксида водорода в реальных почвенных условиях, авторы старались вносить в почвы минимальные искажения, используя почвенные смеси, содержащие 2-5% весовых аэросильных смесей. При подобном соотношении насыпной вес почвенных смесей не отличается от насыпного веса почв.

Предлагаемый способ исключает неопределенность перенесения данных по активности каталазы в суспензии почвы на активность каталазы в почве, так как позволяет проводить испытания непосредственно в почвах. Еще более важным достоинством способа является возможность проводить изучение влияния на скорость ферментативной реакции различных внешних воздействий, что по существующим методикам невозможно в принципе.

Примеры раскрывают суть предлагаемого изобретения.

Пример 1

Эксперименты показывают, что при содержаниии аэросила А-380 (размер частиц 10-40 нм) в аэросильной смеси меньше 36-37% не удается ее равномерно перемешать с почвой. Контакт с почвой этих аэросильных смесей приводит к почти мгновенному втягиванию в них влаги из почв и комкованию, что не позволяет провести перемешивание аэросильных смесей с почвой. В этих случаях количества аэросила в смеси недостаточно, чтобы замедлить процесс взаимодействия с влагой почвы до временных интервалов, позволяющих провести перемешивание почвы с аэросильной смесью.

Пример 2

При содержании аэросила А-380 в аэросильной смеси больше 43-45% удается приготовить гомогенную смесь с почвой, но ферментативная реакция резко замедляется, и определить ее скорость газометрическим методом не представляется возможным. В этих условиях опудривающий слой аэросила слишком велик и практически полностью блокирует диффузию пероксида водорода в почву.

Пример 3

Наиболее мелкие частицы образуются при коцентрации аэросила 38-42%. Такое содержание аэросила позволяет получить гомогенные смеси с почвой при достаточно высокой скорости ферментативной реакции разложения пероксида водорода. Для определения активности каталазы в тепличном грунте брали 65 г почвы, помещали в колбу емкостью 350 мл. Туда же помещали 2 г поршкообразной аэросильной смеси, приготовленной загущением аэросилом А-380 50%-ного раствора пероксида водорода при содержании аэросила 40%. После перемешивания определяли скорость выделения кислорода. Для сравнения определили каталазную активность тепличного грунта по методике, являющейся ближайшим аналогом, и отнесли полученные данные на 1 мг субстрата (см. табл.).

Полученные результаты свидетельствуют, что между скоростью ферментативной реакции, определенной в реальных почвенных условиях (заявляемый способ) и в суспензии (ближайший аналог), существует двукратное расхождение, причем в суспензии реакция протекает медленнее. Это позволяет сделать вывод о том, что метод определения активности каталазы в суспензии позволяет получать только оценочные данные по скорости ферментативной реакции в почве.

Таким образом, изобретение позволяет:

1. определять скорость ферментативной реакции в реальных почвенных условиях, а следовательно, корректно оценивать их биологическую активность;

2. изучать влияние свойств почв на скорость разложения пероксида водорода каталазой в них;

3. определять влияние внешних факторов воздействия на скорость разложения пероксида водорода каталазой в почвах.

Источники информации

1. Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв. - М.: Наука, 1976, 179 с.

2. Хазиев Ф.Х. Системно-экологический анализ ферментативной активности почв. - М.: Наука, 1982, 203 с.

3. Звягинцев Д.Г. Проблемы биохимии почв. - Вестн. МГУ, сер. 17, 1977, №1, с.74-84.

4. Галстян А.Ш. Определение активности ферментов почв. Ереван, НИИ почвоведения и агрохимии, 1978, 55 с.

5. Кольцова О.М., Стекольников К.Е., Казанджьян П.К. Ферментативная активность как метод диагностики плодородия почв. - Мелиорация и водное хозяйство, 1993, №2, с.29-31.

6. Михайловская Н.А. Ферментативная активность как показатель плодородия дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы. Автореф. дис. канд. с-х наук. - Минск, 1988, 17 с.

Формула изобретения

Способ определения скорости разложения пероксида водорода каталазой, заключающийся в определении скорости выделения кислорода при взаимодействии пероксида водорода с почвой, отличающийся тем, что пероксид водорода перед внесением его в почву переводят в порошкообразное состояние загущением аэросилом при содержании последнего 38-42 вес.%.