Питательная среда для культуры животной клетки (варианты) и способ получения белка с использованием среды

 

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена питательная среда для культуры животной клетки, содержащая вместо компонентов, полученных из млекопитающих, экстракт из мяса рыб или продукт ферментативного разложения мяса рыб. Также предложен способ получения белка путем культивирования животной клетки на такой среде. Предложенная питательная среда позволяет культивировать животные клетки стабильно, без применения дорогостоящего белка, который значительно варьируется по качеству, такого как фетальная бычья сыворотка, а также позволяет исключить риск загрязнения аномальными прионами или вирусами и получать безопасные технологические продукты. Предложенный способ получения белка позволяет упростить выделение и очистку желаемого белка, продуцируемого животной клеткой, из питательной среды. 4 с. и 8 з.п.ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к питательной среде для культуры животной клетки и способу получения белка с ее использованием. Более конкретно, изобретение относится к питательной среде для культуры животных клеток, причем эта питательная среда содержит экстракт из мяса рыб или продукт ферментативного разложения мяса рыб, но не содержит компонента, полученного из млекопитающих, такого как белок или продукт его разложения; и к способу получения белка с использованием этой питательной среды.

При культивировании животной клетки для получения природного белка, продуцируемого животной клеткой, или при культивировании животной клетки, включающем кодирование геном желаемого белка, чтобы получить желаемый белок и т.д., в питательную среду добавляют необходимые питательные вещества, такие как основания, сахара, аминокислоты и витамины. Кроме того, обычно добавляют экстракт, выделенный из млекопитающих, конкретно сыворотку, такую как фетальную телячью сыворотку, в количестве от 5 до 20% для пролиферации животной клетки. Однако такая сыворотка, выделенная из млекопитающих, имеет ряд недостатков. Ее стоимость составляет от 75 до 95% стоимости питательной среды, и из-за существующих различий по качеству между отдельными партиями не удается достичь стабильной пролиферации. Кроме того, сыворотку, полученную из млекопитающих, нельзя стерилизовать в автоклаве и т.п., и поэтому она может быть загрязнена вирусами или микоплазмой. Хотя большинство этих вирусов или микоплазм не являются патогенными, они могут стать дополнительными неизвестными факторами с точки зрения стабильности производства. К тому же сыворотка содержит более 500 типов белков, что усложняет выделение и очистку желаемого белка, продуцируемого клеткой, из питательной среды. Чтобы решить такие проблемы, связанные с достижением стабильности производства, применяли способы, в которых вместо сыворотки использовали выделяемый из сыворотки очищенный белок, такой как фетуин, инсулин или трансферрин. Кроме того, делались попытки применять способы, в которых использовали компоненты питательной среды, выделяемые из млекопитающих, для снижения стоимости получения белков.

В последние годы выражалась озабоченность в отношении взаимосвязи компонентов, выделяемых из млекопитающих, с коровьим бешенством, бычьей губчатой энцефалопатией (БГЭ), передающейся губчатой энцефалопатией (ПГЭ) и болезнью Крейтцфельда - Якоба (БКЯ). С точки зрения безопасности, потребовалась разработка питательной среды для культуры животных клеток, чтобы такая среда не содержала этих компонентов, выделенных из млекопитающих.

При культивировании животных клеток невозможность добавлять описанные выше компоненты, выделяемые из млекопитающих, в питательную среду вызывает заметное снижение выживаемости клеток и уменьшение количества жизнеспособных клеток в питательном бульоне на ранней стадии культивирования. Это делает невозможным длительное культивирование культуры или культивирование в промышленном масштабе. Настоящее изобретение имеет целью создать питательную среду для культуры животных клеток, так чтобы эта среда не содержала никаких получаемых из млекопитающих компонентов и была свободна от описанных выше проблем, и обеспечить способ получения белка с применением этой питательной среды.

Для достижения указанной выше цели были удалены компоненты, получаемые из млекопитающих, из обычной питательной среды, применяемой для культивирования животных клеток. В полученную питательную среду были добавлены различные вещества, и проведено интенсивное изучение с использованием СНО-клетки (клетки яичника китайского хомячка), трансформированные геном, кодирующим белок антител. Цель этого изучения состояла в том, чтобы получить вещество, которое стимулирует пролиферацию СНО-клеток, в результате чего будет вырабатываться белок антител в высокой концентрации. В результате изучения было обнаружено, что этой цели можно достичь путем добавления экстракта из мяса рыб или продукта ферментативного разложения мяса рыб, и на основе этих результатов было сделано настоящее изобретение.

Таким образом, это изобретение относится к питательной среде для культуры животных клеток, причем эта среда содержит экстракт из мяса рыб или продукт ферментативного разложения мяса рыб, и к способу получения белка с применением этой среды.

Фиг. 1 представляет собой график, показывающий плотность жизнеспособных клеток для СНО-клеток, культивируемых в питательной среде, содержащей продукт ферментативного разложения мяса рыб в концентрации Brix 1% и Brix 2% и 10 г/л гидролизата говядины соответственно.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий выживаемость (%) СНО-клеток, культивируемых в питательной среде, содержащей продукт ферментативного разложения мяса рыб в концентрации Brix 1% и Brix 2% и 10 г/л гидролизата говядины соответственно.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий концентрации (мг/л) белка антител, продуцируемого в питательной среде СНО-клетками, которые культивировались в питательной среде, содержащей продукт ферментативного разложения мяса рыб при концентрации Brix 1% к Brix 2% и 10 г/л гидролизата говядины соответственно.

На фиг. 4 (a-e) показаны результаты культивирования клеток с использованием устройства для культивирования клеток типа качающейся колбы (shaker flask), описанного в примере 5. Вертикальные оси на графиках фиг.4 представляют плотность жизнеспособных клеток, выживаемость клеток и количество продуцируемого белка антител, соответственно. Каждая из горизонтальных осей представляет число дней культивирования после начала культивирования с использованием питательной среды В.

Описание лучшего варианта осуществления изобретения Настоящее изобретение будет подробно описано ниже. Все документы, описанные здесь, будут цитироваться здесь посредством ссылок.

Питательная среда этого изобретения является питательной средой для культивирования животных клеток, причем эта среда содержит экстракт из мяса рыб или продукт ферментативного разложения мяса рыб. Согласно изобретению животные клетки можно удовлетворительно культивировать без добавления компонентов, полученных из млекопитающих, в питательной среде, которая обычно использовалась в качестве питательной среды для культивирования животных клеток.

Примерами рыб, мясо которых используется в этом изобретении, являются рыбы с красным мясом, такие как пеламида, макрелевый тунец, тунец, скумбрия, сайра, сардина, каранкс и лосось, и рыбы с белым мясом, такие как треска, японский морской окунь, камбала с правым глазом, камбала с левым глазом и морской лещ. Предпочтительными примерами являются пеламида, макрелевый тунец, треска, скумбрия, лосось и сардина.

Экстракт из мяса рыб, используемый в этом изобретении, можно получить путем разрезания мяса рыб на подходящие куски или путем измельчения мяса рыб до пастообразного состояния, и экстрагирования растворимых компонентов из кусочков или пасты горячей водой, например горячей водой при температуре от 90 до 95^oС, в течение времени от нескольких десятков минут до нескольких десятков часов. Конкретными примерами являются биомасса, приготовленная из вареной пеламиды для получения сушеной пеламиды, и отвар, остающийся во время изготовления консервов.

Продукт ферментативного разложения мяса рыб можно получить, например, следующим образом: добавляют соответствующее количество воды к отварному мясу рыб в виде кусков или к мясу рыб, измельченному в пасту, или к упомянутому выше экстракту из мяса рыб, после этого, если необходимо, смесь нагревают для денатурации белков, затем обрабатывают этот материал протеазой и, по желанию, центрифугируют или фильтруют обработанный материал, чтобы удалить масла и нерастворимые вещества. У полученного в результате экстракта из мяса рыб или продукта ферментативного разложения мяса рыб желательно для использования довести рН до от 7 до 7,4.

Протеаза, используемая в этом изобретении, представляет собой, например, протеиназу и/или пептидазу. В этом изобретении термин "протеиназа" обозначает фермент, который гидролизует белок (протеин), используемый в качестве субстрата, в то время как термин "пептидаза" обозначает гидролазу, гидролизующую пептидную связь в пептиде, который является субстратом. То есть активность протеазы по отношению к белковому (протеиновому) субстрату можно отличать как активность протеиназы, тогда как активность протеазы по отношению к пептидному субстрату можно отличить как активность пептидазы. При катализе расщепления цепи из пептидных связей в ее промежуточном участке в результате активности протеиназы по отношению к белковому субстрату используется термин "протеиназа". Следовательно, эндопептидаза используется здесь как одна из протеиназ.

Примерами используемых ферментов являются ферменты растительного происхождения, такие как папаин, химопапаин, бромелаин и фицин, и ферменты из микроорганизмов, таких как плесени, бактерии и дрожжи. Они включают эндопептидазу, экзопептидазу, амниопептидазу, карбоксипептидазу и дипептидазу. Эти ферменты можно использовать каждый в отдельности или в сочетании друг с другом. Когда они используются в сочетании, их можно добавлять одновременно или последовательно.

Продукт ферментативного разложения мяса рыб в настоящем изобретении предпочтительно представляет собой продукт ферментативного разложения мяса рыб, полученный путем обработки протеиназой с последующей обработкой пептидазой.

Условия обработки ферментов различаются в соответствии с типом используемого фермента. Обычно обработку ферментом проводят в течение времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 3 до 24 часов, при рН от 2 до 12, предпочтительно при рН от 4 до 8, при температуре от 30 до 90^oС, предпочтительно от 40 до 65^oС. Фермент используют в количестве примерно от 0,01 до 10%, предпочтительно от 0,5 до 5%, более предпочтительно от 1 до 3% от количества белка, используемого в качестве субстрата.

Фермент в полученном продукте ферментативного разложения мяса рыб инактивируют путем нагревания и т.п., и проводят центрифугирование или фильтрование, чтобы удалить масла и нерастворимые вещества, в результате чего можно получить продукт ферментативного разложения.

В качестве других компонентов питательной среды этого изобретения можно по желанию использовать различные компоненты, обычно используемые в питательной среде для животных клеток. Они включают аминокислоты, витамины, липидные факторы, источники энергии, осморегуляторы, источники железа и регуляторы рН. Помимо этих компонентов можно добавлять микроэлементы (металлы), поверхностно-активные вещества (ПАВ), кофакторы роста и нуклеозиды.

Примерами являются аминокислоты, такие как L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-цистеин, L-цистин, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-орнитин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин, предпочтительно L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-цистин, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин L-валин; витамины, такие как i-инозит, биотин, фолиевая кислота, липоевая кислота, никотинамид, никотиновая кислота, п-аминобензойная кислота, пантотенат кальция, пиридоксал гидрохлорид, пиридоксин гидрохлорид, рибофлавин, тиамин гидрохлорид, витамин В₁₂ и аскорбиновая кислота, предпочтительно биотин, фолиевая кислота, липоевая клслота, никотинамид, пантотенат кальция, пиридоксал гидрохлорид, рибофлавин, тиамин гидрохлорид, витамин B₁₂ и аскорбиновая кислота; липидные факторы, такие как холин хлорид, холин тартрат, линолевая кислота, олеиновая кислота и холестерин, предпочтительно холин хлорид; источники энергии, такие как глюкоза, галактоза, манноза и фруктоза, предпочтительно глюкоза; осморегуляторы, такие как хлорид натрия, хлорид калия и нитрат калия, предпочтительно хлорид натрия; источники железа, такие как железо-ЭДТА, цитрат железа (III), хлорид железа (II), хлорид железа (III), сульфат железа (II), сульфат железа (III), и нитрат железа (III), предпочтительно хлорид железа (III), железо-ЭДТА и цитрат железа (III); и регуляторы рН, такие как бикарбонат натрия, хлорид кальция, одноосновный фосфат натрия, HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-гидроксипропансульфоновая кислота) и MOPS, предпочтительно бикарбонат натрия. Питательные среды, содержащие любой из этих компонентов, могут быть приведены в качестве примеров.

Помимо указанных выше компонентов, можно добавлять микроэлементы в виде таких соединений как сульфат меди, сульфат марганца, сульфат цинка, сульфат магния, хлорид никеля, хлорид олова, хлорид магния и субсиликат натрия, предпочтительно сульфат меди, сульфат цинка и сульфат магния; ПАВ, такие Tween 80 и Pluronic F68; кофакторы роста, такие как рекомбинантный инсулин, рекомбинантный IGF, рекомбинантный EGF, рекомбинантный FGF, рекомбинантный PDGF, рекомбинантный TGF-, этаноламин гидрохлорид, селенит натрия, ретиноевая кислота и путресцин дигидрохлорид, предпочтительно селенит натрия, этаноламин гидрохлорид, рекомбинантный IGF и путресцин дигидрохлорид; и нуклеозиды, такие как дезоксиаденозин, дезоксицитидин, дезоксигуанозин, аденозин, цитидин, гуанозин и уридин. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения в питательной среде могут содержаться антибиотики, такие как стрептомицин, калиевая соль пенициллина G и гентамицин, и индикаторы рН, такие как феноловый красный.

Конкретно, чтобы приготовить питательную среду этого изобретения, экстракт из мяса рыб или продукт ферментативного разложения мяса рыб можно добавить вместо компонентов, полученных из млекопитающих, к имеющейся в продаже питательной среде для культивирования животных клеток, например к среде ВМЕ, среде MEM, среде DMEM, среде F10 или среде F12.

В этом изобретении экстракт из мяса рыб или продукт ферментативного разложения мяса рыб добавляют к питательной среде до концентрации приблизительно Brix 5% или менее, предпочтительно до концентрации Brix от 0,5 до 3%, особенно предпочтительно до концентрации Brix от 1 до 2%. Эта концентрация (Brix) представляет собой концентрацию, определяемую по растворенным твердым веществам как индекс, измеренный на рефрактометре для содержания сахара.

Количество других компонентов в питательной среде составляет от 0,05 до 1500 мг/л для аминокислот, от 0,001 до 10 мг/л для витаминов, от 0 до 200 мг/л для липидных факторов, от 1 до 20 г/л для источников энергии, от 0,1 до 10000 мг/л для осморегуляторов, от 0,1 до 500 мг/л для источников железа, от 1 до 10000 мг/л для рН-буферов, от 0,00001 до 200 мг/л для микроэлементов, от 0 до 5000 мг/л для ПАВ, от 0,05 до 10000 мкг/л для кофакторов роста и от 0,001 до 50 мг/л для нуклеозидов. Количества этих компонентов можно определить, когда потребуется, в соответствии с типом животной клетки, которую необходимо культивировать, и типом желаемого белка.

Величина рН питательной среды различается в зависимости от культивируемых клеток, но обычно рН составляет от 6,8 до 7,6 или во многих случаях от 7,2 до 7,4.

Питательная среда этого изобретения может быть использована без всяких ограничений для предпочтительного культивирования различных животных клеток. Например, на ней можно культивировать COS-клетки или СНО-клетки, имеющие ген для продуцирования желаемого антитела или физиологически активного вещества, встроенный методом генной инженерии, или продуцирующую антитела клетку, полученную путем слияния клеток, называемую "гибридома", такую как гибридные клетки мышь-человек, мышь-мышь или мышь-крыса. Эта питательная среда особенно предпочтительна для культуры СНО-клеток. Излишне говорить, что питательная среда для культуры животных клеток согласно этому изобретению может быть использована при культивировании животных клеток для получения природного белка, продуцируемого животными клетками. Питательная среда может быть использована для культивирования клеток ВНК и клеток HeLa, а также для упомянутых выше клеток.

Условия культивирования различаются в зависимости от типа используемых клеток, и предпочтительные условия можно определить по желанию. Например, СНО-клетки обычно культивируют от 1 до 14 дней в атмосфере с концентрацией СО₂ в газовой фазе от 0 до 40%, предпочтительно от 2 до 10%, при температуре от 30 до 39^oС, предпочтительно около 37^oС.

Культивирование можно осуществлять используя различные устройства для культивирования животных клеток, например устройство для культивирования типа ферментера (бродильного аппарата), устройство для культивирования типа аэролифта, устройство для культивирования типа колбы с культурой, устройство для культивирования типа вращающейся колбы, устройство для культивирования типа микроносителя, устройство для культивирования типа псевдоожиженного слоя, устройство для культивирования типа полого волокна, устройство для культивирования типа вращающегося флакона (роллер-флакона) и устройство для культивирования типа уплотненного слоя.

В результате проведения культивирования в питательной среде для культуры животных клеток согласно этому изобретению белок, продуцируемый животными клетками, можно получить в питательной среде. Чтобы получить белок из животных клеток, может быть достаточно одного лишь культивирования или может потребоваться специальная процедура. Эту процедуру, условия и т.д. можно определить, когда потребуется, в соответствии с тем, какая животная клетка культивируется. В случае СНО-клеток, трансформированных вектором, содержащим ген, кодирующий химерное (гибридное) антитело мыши-человека, путем генно-инженерной операции, например, культивирование проводят при упомянутых выше условиях, и в результате можно получить желаемый белок в питательной среде в течение примерно от 1 до 14 дней, предпочтительно в течение примерно от 7 до 10 дней. Затем питательную среду подвергают операциям выделения и очистки обычными способами (см., например, Introduction to Antibody Engineering Chijin Sho Kan publishing company, pp. 102-104, Affinity Chromatography Principles and Methods, Amersham Pharmacia Bitech., pp. 56-60) и в результате можно получить желаемый белок.

Упомянутыми выше методами продуцирования можно получить белки на основе рекомбинантных генов, такие как рекомбинантные антитела, например антитела против человеческого рецептора IL-6 (включая химерные антитела, антитела, подобные человеческим, человеческие антитела), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующий фактор макрофагов гранулоцитов (GM-CSF), эритропоэтин, интерферон, интерлейкины (например, IL-1 и IL-6), t-PA, урокиназу, сывороточный альбумин и фактор свертывания крови VIII.

Промышленное применение Питательная среда для культуры животных клеток согласно настоящему изобретению содержит экстракт из мяса рыб или продукт ферментативного разложения мяса рыб и поэтому дает возможность культивировать животные клетки стабильно, без применения дорогостоящего белка, который значительно варьируется по качеству, такого как фетальная бычья сыворотка. Более того, при культивировании животных клеток в питательной среде для культуры животных клеток согласно этому изобретению, т.е. в питательной среде, содержащей экстракт из мяса рыб или продукт ферментативного разложения мяса рыб, можно исключить риск загрязнения аномальными прионами или вирусами - проблему, которая возникла в последние годы, и можно продуцировать и получать безопасные биотехнологические продукты.

Примеры Ниже будут приведены примеры для более подробного описания настоящего изобретения, но изобретение никоим образом не ограничивается этими примерами. Специалисты в данной области могут сделать различные видоизменения и модификации, и они также включаются в объем этого изобретения.

Пример 1: Приготовление экстракта из мяса рыб (сардины).

В качестве мяса рыб использовали коммерчески доступную сардину. К 500 г измельченного мяса рыб добавляли 2500 г воды, и мясо рыб экстрагировали в течение 90 минут при температуре 95^oС.

Затем экстракт центрифугировали и фильтровали для удаления нерастворимых веществ и масел. Остаток концентрировали и получили 64 г экстракта из мяса рыб (сардины).

Пример 2: Приготовление продукта ферментативного разложения мяса рыб (пеламиды).

В качестве мяса рыб использовали коммерчески доступную пеламиду. К 1000 г измельченной пеламиды добавляли 1500 г воды. Смесь инкубировали в течение 1 часа вместе с 4 г папаина растительного происхождения при рН 6,0 и 50^oС для ферментативного разложения. Затем дальнейшее ферментативное разложение проводили с 4 г экзопептидазы, полученной из плесени, в течение 20 часов в указанных выше условиях, после чего систему нагревали при 95^oС, чтобы инактивировать ферменты. Затем систему центрифугировали и фильтровали, чтобы удалить нерастворимые вещества и масла. Остаток концентрировали, и получили 500 г продукта ферментативного разложения мяса рыб (пеламиды) согласно этому изобретению.

Пример 3: Приготовление питательной среды.

Тимидин и гипоксантин удаляли из коммерчески доступной среды DMEM/F12 (фирма "GIBCO BRL Products" и Reference Guide, pp. 357-358). К полученной в результате этого среде добавляли следующие компоненты (эта смесь далее будет описываться как "питательная среда А"), и смесь использовали в качестве основной среды для культуры животных клеток.

Питательная среда А Тимидин и гипоксантин удаляли из коммерчески доступной среды DMEM/F12 и добавляли следующие компоненты: 30 мг/л аскорбиновой кислоты 10 мг/л дезоксиаденозина (1H₂О) 10 мг/л дезоксицитидина 10 мг/л дезоксигуанозина 5 мг/л аденозина
5 мг/л цитидина
5 мг/л гуанозина
5 мг/л уридина
4 мг/л этаноламина (НСl)
1000 мг/л Pluronic F-68
18,9 мг/л хлорида железа(III) (6Н₂О)
К упомянутой выше питательной среде А добавляли продукт ферментативного разложения, полученный в примере 2, в конечной концентрации Brix 1% или Brix 2%, и смесь стерилизовали путем фильтрования.

Пример 4: Влияние на количество продуцируемого антитела.

Испытание проводили используя штамм СНО-клеток, продуцирующий аналогичные человеческие антитела РМ-1 (антитела против человеческого рецептора IL-6), которые получали по методу, описанному в сравнительном примере 2 из Японской патентной выкладки 99902/1996, используя промотор человеческого фактора элонгации I, описанный в примере 10 публикации международной заявки WO 92/19759.

Упомянутые выше СНО-клетки (1,510⁵ клеток/мл) добавляли в питательную среду А, содержащую продукт ферментативного разложения мяса рыб, который получили в примере 2 этого описания, в конечной концентрации Brix 1% или Brix 2%. Эту систему культивировали в течение 10 дней при условиях инкубации 37^oС, 5% CO₂ в устройстве для культивирования клеток типа качающейся колбы.

Затем измеряли плотность жизнеспособных клеток, выживаемость клеток и количество продуцируемого белка антител, получаемого из питательной среды. Количество этого продукта измеряли используя жидкостную хроматографию высокого разрешения с обращенной фазой.

В качестве контроля готовили питательную среду, содержащую 10 г/л гидролизата говядины (Primatone, фирма "Quest", США) вместо продукта ферментативного разложения из примера 2, и культивировали на ней СНО-клетки таким же способом.

Полученные результаты показаны на фиг.1. По сравнению с контролем СНО-клетки, культивируемые в питательной среде, содержащей Brix 1% продукта ферментативного разложения мяса пеламиды, показывают рост клеток, сравнимый с ростом клеток в контрольной среде. СНО-клетки, культивируемые в питательной среде, содержащей Brix 2% продукта ферментативного разложения мяса пеламиды, вырабатывают большее количество белка антител, чем в контрольной среде.

Пример 5: Влияние питательных сред, в которых используются продукты ферментативного разложения мяса различных рыб, на количество продуцируемых антител.

Продукты ферментативного разложения мяса рыб из пеламиды, сардины, лосося, макрелевого тунца, трески и макрели добавляли в питательную среду, не содержащую компонентов, полученных из млекопитающих, и исследовали количество продуцируемого белка антител.

Получение продукта ферментативного разложения мяса рыб.

Продукт ферментативного разложения мяса указанных выше рыб получали по способу, описанному в примере 2. То есть мясо рыб измельчали и подвергали ферментативному разложению с папаином - эндопептидазой растительного происхождения. Затем материал подвергали дальнейшему ферментативному разложению экзопептидазой, полученной из плесени, после чего систему нагревали, чтобы инактивировать ферменты. Затем систему центрифугировали и фильтровали, чтобы удалить нерастворимые вещества и масла. Остаток концентрировали, и получили продукт ферментативного разложения мяса рыб.

Приготовление питательной среды и метод испытаний.

dhfr(-) СНО-клетки, трансформированные геном, кодирующим аналогичные человеческим антитела РМ-1 (антитела против IL-6-рецептора человека), описанные в примере 4, и dhfr-селективным маркерным геном, добавляли в питательную среду В, содержащую продукт ферментативного разложения пеламиды, сардины, лосося, макрелевого тунца, трески или макрели при конечной концентрации 10 г/л (Вriх 1%) или 15 г/л (Brix 1,5%). Систему культивировали в течение 10 дней при условиях инкубации 37^oС и 5% СO₂ при помощи устройства для культивирования клеток типа качающейся колбы. Затем измеряли плотность жизнеспособных клеток, выживаемость клеток и количество продуцируемого белка антител. Компоненты питательной среды В приведены ниже.

Питательная среда В
Тимидин и гипоксантин удаляли из коммерчески доступной среды DMEM/F12, и добавляли следующие компоненты:
12,5 мг/л аскорбиновой кислоты
2,5 мг/л дезоксиаденозина (1Н₂О)
2,5 мг/л дезоксицитидина
2,5 мг/л дезоксигуанозина
2,5 мг/л аденозина
2,5 мг/л цитидина
2,5 мг/л гуанозина
5,0 мг/л уридина
0,2 мг/л путресцина (2НСl)
0,975 мг/л этаноламина (НСl)
500 мг/л Pluronic F-68
10 мг/л цитрата железа (III)
Результаты
Полученные результаты показаны на фиг.4 (a-e). Имеются различия в количестве белка антител, полученного с гидролизатом мяса рыб. То есть, когда добавляли продукт ферментативного разложения мяса рыб при конечной концентрации Brix 1% (10 г/л), продуцируемые количества антител уменьшались в следующем порядке: пеламида > макрелевый тунец > треска > лосось > макрель > сардина. Когда продукт ферментативного разложения мяса рыб добавляли при конечной концентрации Brix 1,5% (15 г/л), продуцируемые количества антител уменьшались в следующем порядке: пеламида > макрелевый тунец > треска > макрель > лосось > сардина.

Описанные выше испытания показывают, что продукт ферментативного разложения мяса рыб оказывает различное влияние на количество продуцируемого белка антител в зависимости от типа используемого мяса рыб, но он эффективен для роста dhfr (-) СНО-клеток, трансформированных геном, кодирующим белок антител, и dhfr селективным маркерным геном, и он также эффективен для получения белка антител.

Формула изобретения

1. Питательная среда для культуры животной клетки, содержащая продукт ферментативного разложения мяса рыб или экстракт из мяса рыб и, кроме того, содержащая один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из аминокислот, витаминов, липидных факторов, источников энергии, осморегуляторов, источников железа и регуляторов рН.

2. Питательная среда для культуры животной клетки для продуцирования желаемого белка путем культивирования животной клетки, содержащая экстракт из мяса рыб и, кроме того, содержащая один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из аминокислот, витаминов, липидных факторов, источников энергии, осморегуляторов, источников железа и регуляторов рН.

3. Питательная среда для культуры животной клетки для продуцирования желаемого белка путем культивирования животной клетки, отличающаяся тем, что содержит продукт ферментативного разложения мяса рыб и, кроме того, содержащая один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из аминокислот, витаминов, липидных факторов, источников энергии, осморегуляторов, источников железа и регуляторов рН.

4. Питательная среда для культуры животной клетки по п.3, отличающаяся тем, что продукт ферментативного разложения мяса рыб получен путем обработки мяса рыб или экстракта из мяса рыб протеазой.

5. Питательная среда для культуры животной клетки по п.4, отличающаяся тем, что протеаза представляет собой протеиназу и/или пептидазу.

6. Питательная среда для культуры животной клетки по п.4, отличающаяся тем, что продукт ферментативного разложения мяса рыб получен путем обработки мяса рыб или экстракта из мяса рыб протеиназой и затем пептидазой.

7. Питательная среда для культуры животной клетки по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что является средой, не содержащей компонентов, полученных из млекопитающих.

8. Питательная среда для культуры животной клетки по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что мясо рыб получают из одного или более видов рыб, выбранных из группы, состоящей из пеламиды, макрелевого тунца, трески, скумбрии, лосося и сардины.

9. Способ получения желаемого белка, предусматривающий культивирование животной клетки на питательной среде, отличающийся тем, что культивирование осуществляют с применением питательной среды по п.1.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что животная клетка представляет собой животную клетку, в которую вводят путем трансдукции ген, кодирующий желаемый белок.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что желаемый белок является антителом или физиологически активным веществом.

12. Способ по любому из пп.9-11, отличающийся тем, что животная клетка представляет собой СНО-клетку.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4