Диагностическая подложка с многослойным аналитическим полем для проведения анализа и способ определения объекта анализа с ее помощью

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике с помощью диагностической подложки. Проводят определения объекта анализа из цельной крови с помощью содержащейся в подложке для проведения анализа системы реактивов, которая включает цветообразующий реактив, при этом диагностическая подложка имеет аналитическое поле, имеющее сторону, на которую подается проба крови, и индикационную сторону, на которой имеет место оптически обнаруживаемое изменение вследствие реакции объекта анализа с системой реактивов и которое выполнено таким образом, что содержащиеся в пробе эритроциты не попадают на индикационную сторону. Согласно изобретению аналитическое поле содержит прозрачную пленку и первый и второй, наложенные на нее, расположенные друг над другом пленочные слои, причем находящийся на прозрачной пленке первый слой во влажном состоянии имеет значительно более слабую светорассеивающую способность, чем расположенный над ним второй слой, причем сторона пленки, противоположная стороне пленки, на которую нанесен первый слой, является индикационной стороной, а сторона второго слоя, противоположная стороне, которой второй слой наложен на первый, является стороной подачи пробы. Кроме того, предметом изобретения является способ определения объекта анализа из цельной крови с помощью диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению. Диагностическая подложка проста в изготовлении, а способ, в котором используется данная подложка, обеспечивает простое и быстрое определение объекта анализа. 2 с. и 14 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл.

Изобретение относится к диагностической подложке для проведения анализа в целях определения объекта анализа из цельной крови с помощью содержащейся в подложке для проведения анализа системы реактивов, которая включает цветообразующий реактив, с аналитическим полем, которое имеет сторону подачи пробы, на которую подается проба крови, и индикационную сторону, на которой имеет место обнаруживаемое вследствие реакции объекта анализа с системой реактивов изменение и которая выполнена таким образом, что содержащиеся в пробе эритроциты не попадают на индикационную сторону. Изобретение относится, кроме того, к способу определения объекта анализа из цельной крови с помощью диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению.

Для качественного или количественного аналитического определения составных частей жидкостей из тела, в частности, крови, часто используют так называемый анализ на подложке. При этих анализах реактивы находятся на или в соответствующих слоях твердой подложки, которая приводится в контакт с пробой. Реакция между жидкой пробой и реактивом приводит к образованию констатируемого сигнала, в частности, к изменению окраски, которое можно оценить визуально или с помощью прибора, большей частью, с помощью рефлектофотометрического метода.

Подложки для проведения анализа часто выполнены в виде полос для проведения анализа, которые состоят в основном из продолговатого несущего слоя из синтетического материала и нанесенных на него аналитических полей с одним или более индикаторными слоями. Известны также, однако, подложки для проведения анализа, имеющие форму квадратных или прямоугольных листочков.

Испытания на подложке отличаются, в частности, простотой их проведения. Тем досаднее, что при многих известных до настоящего времени подложках для проведения анализа кровь, как испытуемую жидкость, нельзя применять непосредственно в виде цельной крови. Вначале требуется отделить красные кровяные тельца (эритроциты), чтобы получить бесцветную плазму или сыворотку. Обычно это осуществляют с помощью центрифуги. С этим связаны, однако, дополнительные предписания, которые требуют относительно большого количества крови и дорогостоящей аппаратуры.

Поэтому не было недостатка в попытках предоставить в распоряжение подложку для проведения анализа, которая позволяет производить аналитические определения непосредственно из крови. При этом можно различить две различающиеся в своей основе возможности решения.

При первой группе решений визуальную или аппаратную (с помощью приборов) оценку изменения окраски осуществляют на той же стороне аналитического поля, на которую подается проба. При этом аналитическое поле построено таким образом, чтобы объект анализа из пробы попадал через поверхность аналитического поля к реактивам, в то время, как эритроциты задерживались бы. Через определенное время пробу крови стирают или смывают с поверхности аналитического поля и наблюдают изменение окраски. Примеры таких подложек для проведения анализа описаны в заявке на патент США US-A-3 630 957 и в Европейском патенте ЕР-А-0 217 246.

При второй группе решений пробу подают на одну сторону аналитического поля (сторона подачи пробы), а изменение окраски регистрируют с другой стороны (индикационная сторона). Значительное преимущество этого способа состоит в том, что кровь не нужно стирать или смывать. Такую подложку для проведения анализа называют также не подлежащей смыванию подложкой для проведения анализа (non-wipe test carriers).

Со стиранием отпадает не только обременительный шаг в применении, но также возможный источник ошибок, которые могут произойти от того, что момент времени, когда кровь нужно удалить, выдерживается не точно. С другой стороны, эту группу решений особенно трудно реализовать. Требуется фильтр для эритроцитов, который, с одной стороны, надежно удерживал бы интенсивно окрашивающие составляющие части крови, а, с другой стороны, позволял бы объекту анализа проходить (через него) полностью и достаточно быстро. Оказалось чрезвычайно трудным найти такое построение аналитического поля, которое выполняло бы эти требования.

Из Европейского патента ЕР-А-0045476 известно, что для получения сыворотки или плазмы на подложке для проведения анализа используют стекловолокна. Это решение хотя и может иметь универсальное применение, однако, слои стекловолокон требуется размещать соответствующим образом на подложке для проведения анализа. Благодаря этому, получается относительно сложное строение подложки для проведения анализа и дорогостоящий способ (ее) изготовления. Кроме того, слой стекловолокон абсорбирует жидкость, которая затем не поступает в индикаторный слой. Это обусловливает потребность в относительно большом объеме пробы.

В Европейском патенте ЕР-А-0302287 представлено аналитическое поле, которое имеет композицию слоев, полученную путем покрытия жидкостью индикаторного слоя, содержащего вызывающий окрашивание реактив, нанесенного на слой основания, обращенный к стороне подачи пробы. Слой основания содержит полимерный пленкообразователь, кизельгур и пигмент. Индикаторный слой содержит пленкообразователь, который при покрытии жидкостью частично проникает в слой основания и образует переходную зону, в которой задерживаются эритроциты. Как получается из примеров, содержащий пигмент слой, однако, имеет толщину, которая составляет до 10-кратной толщины индикаторного слоя. Это обусловливает увеличение объема, требуемого для такого аналитического поля. Так как в качестве удерживающей эритроциты зоны служит лишь переходная зона между слоем, содержащим пигмент, и индикаторным слоем, то прежде, чем индикаторный слой заполнится жидкостью, должен заполниться ею относительно большой объем (слой, содержащий пигмент).

Так как никакие известные ранее реализации NW-подложки для проведения анализа с отделением эритроцитов не обеспечивали удовлетворительных свойств ни в каком отношении, то имеющиеся на рынке варианты реализаций таких подложек выполнены с полным отказом от отделения эритроцитов, а помехи из-за интенсивного окрашивания компенсируют с помощью измерительной техники, производя измерения при двух различных длинах волн. При этом, однако, очень возрастают затраты на аппаратуру и становится невозможным визуальный контроль преобразования цвета.

В основе изобретения лежит задача предоставить в распоряжение простую в изготовлении подложку для проведения анализа, с помощью которой можно проводить простое и быстрое определение объекта анализа из цельной крови. Это определение должно обходиться, по возможности, меньшим объемом крови и тем не менее не зависеть от гематокрита. Простое определение должно включать возможность визуальной оценки концентрации объекта анализа.

Эта задача решается с помощью изобретения, более подробно охарактеризованного в пунктах формулы изобретения.

Предметом изобретения является диагностическая подложка для проведения анализа для определения объекта анализа из цельной крови с помощью содержащейся в подложке для проведения анализа системы реактивов, которая включает реактив, дающий окрашивание. Эта подложка для проведения анализов содержит аналитическое поле, которое имеет сторону подачи пробы, на которую подается проба крови, и кроме того, имеет индикационную сторону, на которой происходит обнаруживаемое оптически изменение вследствие реакции объекта анализа с системой реактивов. Содержащиеся в крови эритроциты не попадают на индикационную сторону. Согласно изобретению, аналитическое поле включает прозрачную пленку, на которую последовательно наносят друг на друга первый и второй пленочные слои. Важно, что находящийся на прозрачной пленке первый слой является значительно менее светорассеивающим, чем расположенный над ним второй слой. Не покрытую сторону прозрачной пленки называют индикационной стороной, а сторону второго слоя, противоположную стороне, которой второй слой наложен на первый, называют стороной подачи пробы.

Кроме того, предметом изобретения является способ определения объекта анализа из цельной крови с помощью диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению. Для этого кровь подают на сторону подачи пробы аналитического поля и наблюдают индикационную сторону в отношении цветообразования, причем интенсивность цветообразования является мерой количества объекта анализа в исследуемой пробе крови.

Пленочные слои подложки для проведения анализа изготовляют из дисперсий или эмульсий полимерных пленкообразователей. Дисперсионные пленкообразователи содержат микроскопические, не растворимые в жидкости-носителе (большей частью, вода) частички полимера, которые диспергированы в жидкости-носителе с тончайшим распределением. Когда при пленкообразовании жидкость удаляется путем испарения, то частички сближаются и, наконец, соприкасаются. Благодаря возникающим при этом большим усилиям и получающемуся с пленкообразованием выигрышу в поверхностной энергии, частички срастаются в достаточно закрытый слой пленки. Альтернативно можно использовать эмульсию пленкообразователя, в которой он растворен в растворителе. Растворенный полимер эмульгирует в жидкость-носитель, которая несмешиваема с растворителем.

В качестве полимеров таких пленкообразователей особенно пригодны сложный поливиниловый эфир, поливинилацетаты, сложный полиакриловый эфир, полиметакриловая кислота, поливиниламиды, полиамиды и полистирол. Наряду с гомополимерами, используют также смешанные полимеризаты, например, бутадиена, стирола или сложного эфира малеиновой кислоты.

В аналитическом поле диагностической подложки для проведения анализа два указанных слоя пленки находятся на прозрачной пленке. Для этих целей особенно может идти речь о таких пластмассовых пленках, которые непроницаемы для жидкости. Особенно пригодной оказалась поликарбонатная пленка.

Оба слоя пленки можно изготовить из масс для покрытия, которые содержат один и тот же полимерный пленкообразователь, или они могут изготовляться из масс для покрытия, содержащих различные полимерные пленкообразователи.

В то время, как первый слой содержит средство для набухания и, в случае необходимости, содержит слабо рассеивающий свет наполнитель, второму слою нужно средство для набухания и в любом случае, по меньшей мере, один сильно рассеивающий свет пигмент. Наряду с этим, второй слой может содержать также непористые наполнители, а также пористые наполнители, как, например, кизельгур, в небольших количествах и при этом не становится проницаемыми для эритроцитов. Весовое соотношение пигмента к кизельгуру должно составлять, по меньшей мере, 2:1.

Благодаря добавке хорошо набухающего средства (т.е. вещества, увеличивающего свой объем при поглощении воды), получают не только слои, которые относительно быстро пропитываются жидкостью пробы, но и, несмотря на это раскрывающее действие средства для набухания, обладают хорошими свойствами отделения эритроцитов и, кроме того, также отделения красящих веществ крови. Свойства набухания должны быть настолько хорошими, чтобы для теста, при котором скорость цветообразования - как, например, реакции определения глюкозы - преимущественно зависит от проникания испытуемой жидкости через слой, оптически индицируемую реакцию можно было замерять, самое большое, через минуту. В качестве особенно пригодного средства для набухания зарекомендовали себя сополимер ангидрида малеиновой кислоты и метилвинилового эфира, ксантангум и сополимер метилвинилового эфира и малеиновой кислоты.

Кизельгур называют также диатомовой землей. Речь идет о возникших из каркаса кремневой кислоты диатомовых видов отложениях, которые откладываются в различных местностях. Предпочтительно применяемый кизельгур имеет средний диаметр частиц от 5 до 15 мкм, причем эти значения определяли с помощью лазерного гранулометра типа 715, который работает на фирме Пабиш, Мюнхен, ФРГ.

Сильно рассеивающая свет пигментная составляющая второго слоя содержится в количестве, по меньшей мере, 25 мас.% относительно сухого, готового к использованию двойного слоя аналитического поля. Так как слабо рассеивающие свет наполнители и сильно рассеивающие свет пигменты в значительной степени определяют оптические свойства пленочных слоев, то первый и второй пленочные слои имеют различные наполнители и пигменты.

Первый пленочный слой не должен содержать никаких наполнителей или содержать такие, коэффициент преломления которых близок к коэффициенту преломления воды. В качестве особенно пригодного для этого материала зарекомендовали себя двуокись кремния, силикаты и алюмосиликаты. Алюмосиликат натрия с торговым названием Транспафиль является особенно пригодным. Он имеет средний состав 66 мас.% SiO₂, 26 мас.% Al₂O₃, 7 мас.% Na₂O и 1 мас.% SO₃. Средняя величина зерна особенно предпочтительных первичных частиц составляет примерно 0,06 мкм.

Второй слой, согласно изобретению, должен обладать высокой светорассеивающей способностью. В идеальном случае коэффициент преломления пигмента во втором слое составляет примерно 2,5. Поэтому предпочтительно применяют двуокись титана. Частицы со средним диаметром примерно 0,2 до 0,8 мкм особенно предпочтительны. Легко обрабатываемые типы двуокиси титана в модификации Анатас особенно подходят для этого.

Системы реактивов для индикации определенных объектов анализа с помощью цветообразования известны специалистам. Является возможным, чтобы все компоненты системы реактивов находились в одном пленочном слое. Но также является возможным, чтобы компоненты системы реактивов были распределены на оба пленочных слоя. Предпочтительно, чтобы цветообразующие системы реактивов, по меньшей мере, частично находились в первом пленочном слое.

Под цветообразованием в рамках данного изобретения понимают не только переход от белого в цветной тон, но также любое изменение цвета, причем, разумеется, особенно предпочтительны такие изменения окраски, которые наступают с возможно большим смещением максимальной волновой характеристики абсорбции (_max).

Для оптимизации аналитического поля в диагностической подложке для проведения анализа согласно изобретению оказалось особенно предпочтительным, если оба пленочных слоя содержат не гемолизированное смачивающее средство. Особенно здесь пригодны нейтральные, т.е. не заряженные смачиватели. Чрезвычайно подходит для этого N-Октаноил-N-метил-глюкамид.

Для изготовления аналитического поля подложки для проведения анализа согласно изобретению соответствующие пленочные слои получают соответственно друг за другом из гомогенной дисперсии указанных составных частей. Для этого в качестве основания для нанесения покрытия для первого пленочного слоя используют прозрачную пленку. После нанесения покрытия для первого пленочного слоя на определенную толщину слой высушивают. После этого на этот слой наносят покрытие для второго слоя также на малую толщину и высушивают. После сушки толщина первого и второго пленочных слоев вместе должна составлять максимально 0,20 мм, предпочтительно максимально 0,12 мм, особенно предпочтительно - максимально 0,08 мм. Предпочтительно, чтобы высушенный второй пленочный слой был примерно в 2-5 раз более толстым, чем первый.

Изготовленное таким образом аналитическое поле для лучшего пользования можно закрепить на несущем слое, причем для изготовления такого слоя можно рассматривать, в частности, такие материалы, которые не поглощают исследуемую жидкость. Это так называемые не впитывающие материалы, при этом особенно предпочтительны пленки из пластмассы, например, из полистирола, поливинилхлорида, сложного полиэфира, поликарбоната или полиамида. Можно, однако, импрегнировать водоотталкивающими средствами или покрыть водостойкой пленкой впитывающие материалы, как, например, дерево, бумага или картон, причем в качестве гидрофобизирующего средства можно использовать силиконы или отвержденные жиры, а в качестве пленкообразователя, например, нитроцеллюлозу или ацетат целлюлозы. В качестве других материалов несущего слоя пригодны металлическая фольга или стекло.

Для определения индицируемого в испытуемой жидкости объекта анализа, в данном случае, предпочтительно, цельная кровь, но, разумеется, можно исследовать также выделенные из крови пробы, как, например, плазму или сыворотку или также другие водные жидкости, в диагностической подложке для проведения анализа согласно изобретению индикационная сторона аналитического поля, которая подвергается наблюдению на цветообразование, должна быть видимой через несущий слой. Это обеспечивается с помощью прозрачного несущего слоя. Однако также можно снабдить несущий слой перфорацией, которая перекрывается индикационной стороной аналитического поля. Индикационная сторона в этом случае видна через перфорацию. В предпочтительном варианте выполнения диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению в несущем слое под индикационной стороной испытательного поля находится отверстие, через которое можно наблюдать индикационную сторону аналитического поля. Отверстие имеет несколько меньший диаметр, чем самая малая протяженность по длине аналитического поля, так что аналитическое поле накладывается на несущий слой вне отверстия и может там закрепляться.

Благодаря строению аналитического поля, в особенности, благодаря свойствам пленочных слоев не пропускать эритроциты, для определения объекта анализа требуется лишь незначительный объем. При величине аналитического поля 5х6 мм достаточно, например, уже 3 мкл цельной крови для определения глюкозы в этой жидкости. Для того чтобы можно было надежно работать также при применении больших объемов пробы примерно 15-20 мкл и предотвратить сливание жидкости с подложки для проведения анализа, оказалось особенно благоприятным вмонтирование аналитического поля в диагностическую подложку для проведения анализов, при котором эта подложка для проведения анализов содержит несущий слой и расположенное на нем аналитическое поле, а аналитическое поле прикрыто сеткой, которая больше, чем аналитическое поле, и закреплена на несущем слое вне аналитического поля. Сетка такой особенно предпочтительной диагностической подложки для проведения анализов согласно изобретению гидрофильна, но сама по себе не является капиллярно-активной. Над областью сетки, которая выступает за аналитическое поле, т.е. над областью сетки, которая не наложена на аналитическое поле, расположено инертное покрытие из не проницаемого для пробы материала таким образом, что на участке сетки, который расположен над аналитическим полем, поверхность для подачи пробы остается свободной.

Сетка этой особенно предпочтительной диагностической подложки согласно изобретению сама по себе не должна быть капиллярно-активной или способной впитывать, чтобы жидкость пробы, по возможности, полностью попадала на аналитическое поле. Пригодными показали себя такие сетки, которые при вертикальном окунании в воду допускают высоту подъема воды по сетке менее чем на 2 мм. Предпочтительно в качестве сетки используют крупноячеистую моноволоконную ткань, которая является гидрофильной. Для этого материал ткани должен быть сам по себе гидрофильным или его можно сделать гидрофильным, например, путем обработки смачивающим средством. В качестве особенно предпочтительного материала сетки используют сложный полиэфир, причем сетку из этого материала применяют с обработкой смачивающим средством.

Толщина сетки должна быть такой, чтобы лежащее на ней покрытие и расположенный под ним слой должны находиться на таком расстоянии друг от друга, чтобы остающаяся жидкость всасывалась под действием капиллярных сил в область под покрытием над насыщенным аналитическим полем и наполненными ячейками сетки и отводилась от места подачи пробы. Как правило, толщина сетки для этого составляет предпочтительно 50-400 мкм.

Сетка должна иметь достаточно большую ширину ячеек, чтобы жидкость попадала через сетку на аналитическое поле. Благодаря свойствам сетки, жидкость не растекается в сетке по поверхности сетки по горизонтали, а протекает по вертикали через сетку на аналитическое поле.

В вышеописанной особенно предпочтительной диагностической подложке для проведения анализа согласно изобретению перекрывающая аналитическое поле сетка по размеру больше расположенного под нею аналитического поля. Выступающая за аналитическое поле часть сетки закреплена на несущем слое. Крепление можно осуществить с помощью известных способов специалистам из технологии изготовления подложек для проведения анализа. Например, крепление можно осуществить с помощью плавкого клея или отверждаемого на холоде клея. Преимущества показали также двусторонние клейкие полосы. Во всех случаях, однако, важно, чтобы крепление сетки на несущем слое осуществлялось таким образом, чтобы был возможен капиллярно-активный перенос жидкости от аналитического поля в часть сетки, которая закреплена на несущем слое. Этот капиллярно-активный перенос жидкости должен быть возможным, в особенности, тогда, когда аналитическое поле насыщено жидкостью. Для обработки особенно пригодна клейкая лента с натуральным или синтетическим каучуком. Чрезвычайно благоприятно, если средство, которое служит для крепления сетки на несущем слое, имеет толщину, равную примерно толщине аналитического поля. Оно служит тогда как бы прокладкой, чтобы сетку также вне области аналитического поля держать в целом плоской на проходящей поверхности.

Над сеткой особенно предпочтительной диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению инертное покрытие из не проницаемого для пробы, как правило, водонепроницаемого и не способного впитываться материала расположено таким образом, что прикрыта область сетки вне аналитического поля. В идеальном случае покрытие даже еще немного выступает за область аналитического поля. В любом случае, однако, значительная часть сетки, которая покрывает аналитическое поле, остается, однако, свободной. Эту свободную часть сетки обозначают местом подачи пробы.

В качестве покрытия особенно предпочтительными оказались пленки из пластмассы. Если покрытие и сетка имеют различный цвет, например, белый и желтый, или белый и красный, можно, таким образом, сделать заметным место, на которое нужно подавать подлежащую исследованию жидкость пробы.

На покрытии можно также, например, с помощью одной или нескольких напечатанных стрелок обозначить, в каком направлении, т.е. каким концом диагностическая подложка для проведения анализа согласно изобретению должна вкладываться или вдвигаться в измерительный прибор.

Место подачи пробы может быть достигнуто особенно просто с помощью покрытия двумя пластмассовыми пленками в виде лент, которые оставляют свободной лентообразную область сетки, перекрывающей аналитическое поле. Используемая для покрытия пленка закреплена на сетке или в случае необходимости - на несущем слое. Для такого крепления годится плавкий клей или клейкие ленты, если пленка сама по себе является клейкой. В любом случае следует обратить внимание на то, чтобы под покрытием оставался капиллярный зазор, образованный сеткой, который может воспринимать избыток жидкости пробы из насыщенного жидкостью аналитического поля. Место подачи пробы находится предпочтительно над перфорацией в несущем слое, через которую можно наблюдать цветообразование в аналитическом поле.

Для осуществления способа определения объекта анализа из цельной крови с помощью диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению кровь подают на сторону подачи пробы аналитического поля и наблюдают на индикационной стороне цветообразование. Частой причиной неправильных замеров при диабетмониторинге, т.е. при регулярном контроле крови больного диабетом на содержание глюкозы, был до настоящего времени слишком малый объем пробы. Для диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению при величине аналитического поля примерно 5х6 мм достаточно уже 3 мкм цельной крови, чтобы можно было осуществить визуальную оценку результатов исследования. Благодаря тому, что второй пленочный слой аналитического поля обладает высокой светорассеивающей способностью, а первый слой, напротив, является слабо светорассеивающим, то образованное окрашивание, исходя от индикационной стороны, воспринимается с относительно высоким блеском и интенсивностью цвета. Это позволяет производить точные определения, несмотря на малое количество объекта анализа, обусловленное малым объемом пробы.

Разумеется, способ определения объекта анализа из цельной крови с помощью диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению можно осуществлять также с применением аппаратуры. Для получения возможно более точных результатов рекомендуется также такой способ. Для этого предпочтительно непрерывно или с интервалами наблюдают отражение индикационной стороны в отношении цветообразования. Проводят замеры отражения индикационной стороны аналитического поля с получением ряда замеров. После одно- или многократного снижения ниже определенного значения разности следующих друг за другом замеров и, в случае необходимости (по истечении), другого определенного времени реакции измерение заканчивается. Последнее значение отражения ряда замеров используют затем для математической оценки концентрации объекта анализа.

Так как этот способ работает с однозначным критерием для прерывания ряда замеров и для него не требуется установления момента нанесения пробы, то нанесение пробы может иметь место также вне измерительного прибора. При этом достаточно вставить полосу в прибор в любой момент в диапазоне максимально допустимого интервала времени после нанесения пробы.

В данном случае способ определения в области значений гематокрита от 20 до более 60% не подвержен воздействию и может поэтому называться независимым от гематокрита, если определение проводится с помощью аппаратуры в соответствии с вышеуказанным способом. Для визуальной оценки следует подождать 2-3 мин, прежде, чем можно будет считать независимое от гематокрита значение.

На фиг.1-9 изобретение представлено схематически.

Фиг. 1 показывает поперечное сечение аналитического поля диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению.

Фиг. 2 показывает вид в перспективе особенно предпочтительного варианта выполнения диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению.

Фиг. 3 показывает вид на нижнюю сторону диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению по фиг.2.

Фиг. 4 показывает поперечное сечение диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению по фиг.2 вдоль линии А-А.

Фиг.5 показывает часть поперечного сечения по фиг.4 в увеличенном виде.

Фиг.6-9 показывают тарировочные кривые 1-4, получение которых поясняется более подробно в примере 2.

Используемые для фигур обозначения: 1 - аналитическое поле; 2 - прозрачная пленка; 3 - первый слой; 4 - второй слой; 5 - сторона подачи пробы; 6 - индикационная сторона; 7 - диагностическая подложка для проведения анализа; 8 - несущий слой; 9 - сетка;
10 - покрытие;
11 - часть сетки, выступающая за пределы аналитического поля;
12 - место нанесения пробы;
13 - перфорация;
14 - клейкая лента для аналитического поля;
15 - прокладка;
16 - капиллярно-активный зазор;
17 - испытуемая жидкость.

18 - позиционирующее отверстие.

Представленное на фиг.1 поперечное сечение аналитического поля 1 диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению показывает прозрачную пленку 2, на которую нанесен первый пленочный слой 3. Первый пленочный слой 3 накрыт вторым пленочным слоем 4. Благодаря способу изготовления аналитического поля 1 подложки для проведения анализа согласно изобретению, а именно нанесение на прозрачную пленку 2 влажного покрытия для первого пленочного слоя 3 и последующее нанесение на сухой первый пленочный слой 3 влажного покрытия для второго пленочного слоя 4, получается, что слои между собой и первый пленочный слой 3 на прозрачной пленке 2 связаны друг с другом всей поверхностью с хорошим сцеплением. Кровь, которую нужно исследовать на содержимые вещества, подается на сторону подачи пробы 5 аналитического поля 1 подложки для проведения анализа согласно изобретению. При присутствии объекта анализа в пробе на индикационной стороне б аналитического поля 1 подложки для проведения анализа согласно изобретению можно будет наблюдать цветообразование, интенсивность которого зависит от количества объекта анализа в пробе.

Показанная на фиг.2 в перспективе и на фиг.4 в поперечном сечении особенно предпочтительная диагностическая подложка 7 для проведения анализа согласно изобретению имеет форму испытательной полосы. На несущем слое 8 находится аналитическое поле 1, которое накрыто большей сеткой 9. Рядом с аналитическим полем 1 на несущем слое посредством прокладок 15 закреплена сетка 9. Эти прокладки 15 могут представлять собой поверхности с плавким клеем или клейкие с двух сторон ленты, которые фиксируют сетку 9 на несущем слое 8. В идеальном случае прокладки 15 имеют примерно одинаковую толщину с аналитическим полем 1. Служащие в качестве покрытия 10 слои закреплены на несущем слое 8 и сетке 9. Они расположены таким образом, что они перекрывают выступающую за аналитическое поле 1 область сетки 9. Покрытия 10 незначительно выступают также еще и за аналитическое поле 1. Эта область представляет собой место 12 нанесения пробы. На него наносят подлежащую исследованию жидкость 17. Позиционирующее отверстие 18 служит для того, чтобы испытательную полосу в случае исследования с помощью аппаратуры, например, при измерениях, производимых с помощью рефлектофотометра, устанавливать в точно определенном месте прибора. Это можно осуществить путем фиксирования подложки 7 для проведения анализа в определенном месте с помощью штифта, вставляемого в позиционирующее отверстие 18. Левое покрытие 10 содержит напечатанную на нем стрелку, которая указывает пользователю, каким концом нужно вкладывать или вдвигать подложку 7 для проведения анализа в аппарат.

Фиг.5 показывает в увеличенном виде поперечное сечение особенно предпочтительного варианта выполнения диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению, представленной на фиг.2 и 4. Из этой фигуры должно стать понятным, как протекает определение объекта анализа в жидкой пробе, например, глюкозы в цельной крови. Для такого определения кровь наносят на место 12 нанесения пробы на сетке 9. Жидкость проходит по вертикали через сетку 9 на аналитическое поле 1. Там, в случае применения крови в качестве испытуемой жидкости, удерживаются эритроциты, в то время, как плазма или сыворотка попадает в слои 3, 4 аналитического поля 1. Если нанесено достаточное количество испытуемой жидкости в виде цельной крови, то плазма или сыворотка распределяются в первом и втором пленочных слоях 3, 4 по всей поверхности аналитического поля 1. При очень малых объемах жидкости аналитическое поле может впитать ее, оставив расположенную над ним сетку 9 даже сухой, так как сетка 9 сама по себе не является капиллярно-активной. При объемах жидкости от среднего до большого вначале заполняются полые пространства сетки 9 над аналитическим полем 1, а затем капиллярные полые пространства под покрытиями 10. Для нормального функционирования этих капиллярных полых пространств необходимо, чтобы покрытия 10, по меньшей мере, немного перекрывали область аналитического поля 1 под сеткой 9. Благодаря перфорации 13, можно наблюдать индикационную сторону аналитического поля 1. Для этого аспекта на фиг. 3 представлен вид на нижнюю сторону диагностической подложки для проведения анализа согласно фиг.2, 4 и 5. В случае присутствия объекта анализа в нанесенной испытуемой жидкости изменяется окраска индикаторной стороны 6 аналитического поля 1. Образуется окраска, интенсивность которой является мерой количества объекта анализа в испытуемой жидкости.

Далее изобретение поясняется с помощью следующих примеров.

Пример 1.

Изготовление диагностической подложки для проведения анализа согласно изобретению.

На несущий слой из сложного полиэфира, содержащего двуокись титана, наносят двустороннюю клейкую ленту шириной 5 мм (носитель из сложного полиэфира и клей из синтетического каучука).

Эту композицию вместе перфорируют с расстоянием между отверстиями 6 мм, чтобы получить отверстия для измерений. Затем снимают защитную бумагу с двусторонней клейкой ленты.

Для изготовления аналитического поля, состоящего из двух пленочных слоев, поступают следующим образом:
А. В химический стакан вводят в виде чистых веществ или в форме концентрированных растворов следующие компоненты в следующем составе и смешивают путем перемешивания:
Вода - 820,0 г
1-гидрат лимонной кислоты - 2,5 г
2-гидрат кальция - 0,5 г
Гидроокись натрия - 1,4 г
Ксантан гум - 3,4 г
Тетраэтиловый хлористый аммоний - 2,0 г
N-Октаноил-N-метил-глюкамид - 2,1 г
Поливинилпирролидон (МЕ 25000) - 3,5 г
Транспафилл (алюмосиликат натрия) - 62,1 г
Дисперсия поливинил пропионата (50 мас.% в воде) - 60,8 г
Бис-(2-гидроксиэтил)-(4-гидроксиминоциклогекса-2,5-диэнилидин)-хлористый аммоний - 1,2 г
Гексанатриевая соль 2,18-фосфорномолибденовой кислоты - 16,1 г
Пирролохинолин-хинон - 32 мг
Глюкозодегидрогеназа rec/из Acinetobacter alcoaceticus - 1.7 MU
EC 1.1.99.17 - (2,4 г)
1-Гексанол - 1,6 г
1-Метокси-2-пропанол - 20,4 г
Во всей массе с помощью NаОН устанавливают рН около 6, а затем в количестве на единицу площади 89 г/м ее наносят на поликарбонатную пленку толщиной 125 мкм и высушивают.

Б. В химический стакан вводят следующие компоненты в виде чистых веществ или в форме концентрированных растворов и смешивают путем перемешивания:
Вода - 579,7 г
Гидроокись натрия - 3,4 г
Гантрез (сополимер метилвинилового эфира с малеиновой кислотой) - 3,8 г
N-Октаноил-N-метил-глюкамид - 3,6 г
Тетраэтиловый хлористый аммоний - 9,7 г
Поливинилпирролидон МЕ 25000) - 20,2 г
Двуокись титана - 177,1 г
Кизельгур - 55,3 г
Дисперсия поливинилпропионата (50 мас.% в воде) - 70,6 г
Гексанатриевая соль 2,18-фосфорно-молибденовой кислоты - 44,3 г
Гексацианоферрат (III) калия - 0,3 г
1-Гексанол - 1,6 г
1-Метокси-2-пропанол - 20,4 г
Во всей массе с помощью NаОН устанавливают рН около 6, а затем ее наносят в количестве на единицу площади 104 г/м на покрытую в соответствии с п. А поликарбонатную пленку и высушивают.

Полосу шириной 5 мм изготовленного таким образом индикаторного слоя наклеивают стороной с пленкой с точной подгонкой на перфорированную двустороннюю клейкую ленту на несущем слое.

Непосредственно, с примыканием к индикаторному слою на несущую пленку по обе стороны наклеивают двусторонние клейкие ленты (основа из ПВХ и клей из натурального каучука) в качестве прокладок. В данном примере одна прокладка имеет ширину 6 мм, а другая 9 мм. Затем снимают защитную пленку с обеих двусторонних клейких лент.

На эту композицию накладывают пропитанную смачивающим средством желтую крупноячеистую моноволоконную ткань из сложного полиэфира Скринель РЕ 280 НС (Цюрихер Бойтельтухфабрик, Рюшликон, Швейцария) и приклеивают путем прижатия.

Две односторонние клейкие ленты (основа из ПВХ и клей из натурального каучука) наклеивают в качестве покрытия на желтую сетку таким образом, чтобы прокладки были полностью прикрыты и имело место еще, по меньшей мере, хотя бы незначительное перекрытие с реактивным участком. Таким образом, ленточное изделие готово.

Ленту разрезают на подложки для проведения анализа шириной 6 мм таким образом, чтобы отверстие для измерений в подложке для проведения анализа лежало посередине.

Пример 2
Независимость подложки для проведения анализа от гематокрита
На подложках для проведения анализа из примера 1 можно произвести измерения с помощью рефлектофотометра. Значения ремиссии, которые являются мерой интенсивности окраски, можно, при наличии тарировочной кривой, пересчитать в концентрацию глюкозы. Поскольку используют название "относительные ремиссии", то ремиссии приведены относительно сухой подложки для проведения анализа.

А. Тарировочные кривые получают благодаря тому, что замеряют большое число (проб) венозной крови с различными концентрациями глюкозы. По значениям ремиссии и полученным с помощью метода эталонов концентрациям глюкозы в этой венозной крови можно затем построить тарировочную кривую.

В первом варианте тарирования 10 мкл венозной крови нанесли на подложку для проведения анализа по примеру 1 и замерили ремиссии через 21 с. По полученным ремиссиям 10-ти подложек для проведения анализа и базовым значениям проб крови с помощью регрессивного расчета получили тарировочную кривую 1 (фиг.6).

Во втором варианте тарирования также 10 мкл венозной крови нанесли на подложку для проведения анализа по примеру 1 и замерили ремиссии через 30 с. По полученным ремиссиям 10-ти подложек для проведения анализа и базовым значениям проб крови получили путем регрессивного расчета тарировочную кривую 2 (фиг.7).

В третьем варианте тарирования также 10 мкл венозной крови нанесли на подложку для проведения анализа из примера 1 и замерили ремиссии с интервалом 3 с. Поскольку разница в ремиссиях дважды друг за другом была менее 0,3, то замеры прекратили и для оценки приняли значение ремиссии. По полученным ремиссиям 10-ти подложек для проведения анализа и базовым значениям проб крови с помощью регрессивного расчета построили тарировочную кривую 3 (фиг.8).

В 4-м варианте тарирования также 10 мкл венозной крови нанесли на подложку для проведения анализа из примера 1 и замерили ремиссии с интервалом 3 с. Поскольку разница в ремиссиях дважды друг за другом была меньше, чем 0,9, то измерения прекратили и значение ремиссии приняли к оценке. По полученным ремиссиям 10-ти подложек для проведения анализа и базовым значениям проб крови с помощью регрессивного расчета построили тарировочную кривую 4 (фиг. 9).

Б. В первом варианте измерений 10 мкл венозной крови нанесли на подложку для проведения анализа по примеру 1 и замерили ремиссии через 21 с. Отдельные ремиссии с помощью соответствующей тарировочной кривой из фиг.6 пересчитали в концентрацию глюкозы. По полученным концентрациям 10-ти подложек для проведения анализа и базовым значениям проб крови определили погрешности и представили в таблице 1.

Во втором варианте измерений также 10 мкл венозной крови нанесли на подложку для проведения анализа по примеру 1 и замерили ремиссии через 30 с. Отдельные ремиссии пересчитали с помощью соответствующей тарировочной кривой согласно фиг.7 в концентрацию глюкозы. По полученным значениям концентраций 10-ти подложек для проведения анализа и базовым значениям проб крови получили погрешности и представили в таблице 2.

В третьем варианте измерений также 10 мкл венозной крови нанесли на подложку для проведения анализа по примеру 1 и замерили ремиссии с интервалом 3 с. Поскольку дважды друг за другом разница в ремиссиях была меньше, чем 0,3, то измерения прекратили и приняли для оценки значение ремиссии. Отдельные ремиссии с помощью соответствующей тарировочной кривой по фиг. 8 пересчитали в концентрацию глюкозы. По полученным концентрациям 10-ти подложек для проведения анализа и базовым значениям проб крови получили погрешности и представили в таблице 3.

В четвертом варианте измерений также 10 мкл венозной крови нанесли на подложку для проведения анализов по примеру 1 и замерили ремиссии с интервалом 3 с. Поскольку разница в ремиссиях дважды друг за другом была менее чем 0,9, то измерения прекратили и для оценки приняли значение ремиссии. Отдельные ремиссии с помощью соответствующей тарировочной кривой по фиг.9 пересчитали в концентрацию глюкозы. По полученным концентрациям 10-ти подложек для проведения анализа и базовым значениям проб крови определили погрешности и представили в таблице 4.

Для 20% гематокрита с помощью вариантов измерений 3 и 4 получаются значения с такими же малыми отклонениями, как и для 30% гематокрита.

Формула изобретения

1. Диагностическая подложка для проведения анализов для определения объекта анализа из цельной крови с помощью содержащегося в подложке аналитического поля, которое содержит систему реактивов, включающую в себя цветообразующий реактив, причем аналитическое поле имеет сторону подачи пробы, на которую подается проба крови, и индикационную сторону, на которой получается оптически обнаруживаемое изменение вследствие реакции объекта анализа с системой реактивов, при этом аналитическое поле содержит прозрачную пленку, нанесенный на прозрачную пленку первый пленочный слой и нанесенный на первый пленочный слой второй пленочный слой, причем находящийся на прозрачной пленке первый пленочный слой во влажном состоянии является значительно менее светорассеивающим, чем расположенный над ним второй пленочный слой, при этом непокрытая сторона прозрачной пленки является индикационной стороной, а сторона второго пленочного слоя, противоположная стороне, на которой второй пленочный слой наложен на первый, является стороной подачи пробы, отличающаяся тем, что первый пленочный слой содержит наполнитель, коэффициент преломления которого близок к коэффициенту преломления воды, а второй пленочный слой содержит пигмент с показателем преломления, по меньшей мере, 2,5 в концентрации, по меньшей мере, 25 мас. % по отношению к сухому двойному пленочному слою.

2. Диагностическая подложка по п. 1, отличающаяся тем, что оба пленочных слоя образованы из дисперсии или эмульсии полимерного пленкообразователя, которая содержит полимерный пленкообразователь и средство для набухания в гомогенном распределении, причем способность к набуханию средства для набухания настолько высока, что оптически обнаруживаемое изменение на индикационной стороне может быть измерено самое большее через минуту.

3. Диагностическая подложка по любому из пп. 1 или 2, отличающаяся тем, что первый пленочный слой содержит в качестве наполнителя алюмосиликат натрия, а второй пленочный слой содержит в качестве пигмента двуокись титана.

4. Диагностическая подложка по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что оба пленочных слоя выполнены с возможностью отделения эритроцитов.

5. Диагностическая подложка по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что толщина первого и второго пленочных слоев в сухом состоянии вместе составляет максимально 0,20 мм, предпочтительно максимально 0,12 мм, особенно предпочтительно максимально 0,08 мм.

6. Диагностическая подложка по п. 5, отличающаяся тем, что второй пленочный слой примерно в 2-5 раз толще, чем первый пленочный слой.

7. Диагностическая подложка по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что в первом пленочном слое находится цветообразующий реактив.

8. Диагностическая подложка по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что компоненты системы реактивов распределены на оба пленочных слоя.

9. Диагностическая подложка по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что в пленочных слоях отсутствуют гемолизирующие смачивающие средства.

10. Диагностическая подложка по п. 9, отличающаяся тем, что по меньшей мере, один пленочный слой содержит в качестве смачивающего средства N-октаноил-N-метил-глюкамид.

11. Способ определения объекта анализа из цельной крови, при котором кровь подают на сторону подачи крови аналитического поля и наблюдают индикационную сторону в отношении цветообразования, причем интенсивность цветообразования является мерой количества объекта анализа в крови, отличающийся тем, что применяют диагностическую подложку для проведения анализа по любому из пп. 1-10.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что индикационную сторону наблюдают в отношении цветообразования непрерывно или с интервалами.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что наблюдение осуществляют с помощью аппаратуры в виде ряда замеров посредством измерения цветообразования, а момент оценки определяют путем однократного перехода ниже определенного абсолютного или процентного значения разности следующих друг за другом замеров цветообразования.

14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что наблюдение осуществляют с помощью аппаратуры в форме ряда замеров посредством измерений цветообразования, а момент оценки определяют с помощью заранее установленного многократного перехода ниже определенного абсолютного или процентного значения разности следующих друг за другом измерений цветообразования.

15. Способ по п. 13 или 14, отличающийся тем, что после одно- или многократного перехода ниже абсолютного или процентного значения разности следует дальнейшее послереакционное время.

16. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что измерения цветообразования осуществляют с помощью рефлектометрии, а последнее значение ряда замеров используют для математической оценки концентрации объекта анализа.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12