Способ доклинической диагностики сепсиса у новорожденных с дыхательными расстройствами и перинатальным поражением цнс

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к неонатологии. Способ обеспечивает повышение точности и чувствительности доклинической диагностики сепсиса у новорожденных с респираторными расстройствами и перинатальным поражением центральной нервной системы. Проводят серологический анализ крови, при этом в сыворотке крови у новорожденных определяют уровень полифункционального цитокина интерлейкина-6 (ИЛ-6) и при его концентрации 40 пг/мл и выше диагностируют начало септического процесса.

Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии, и может быть использовано для ранней лабораторной диагностики септического инфицирования и прогнозирования исхода сепсиса у детей с перинатальным поражением центральной нервной системы и дыхательными расстройствами.

Неонатальный сепсис занимает одно из ведущих мест в структуре заболеваемости среди новорожденных, составляя летальность до 13-50%. Наиболее тяжелая ситуация сложилась в отделениях реанимации и интенсивной терапии, где находятся дети из группы высокого риска, определяемой основным заболеванием, материнским анамнезом, повышенной восприимчивостью к инфекциям.

Особое значение экспресс-методы диагностики бактериального инфицирования приобретают в клинической практике неонатологической реаниматологии. Очевидно, что рутинные методы диагностики в условиях терапии экстремальных состояний малоприемлемы из-за своей длительности и использования для исследования больших количеств биологических жидкостей. Используемый арсенал ранее известных методов диагностики развития септической инфекции не всегда отвечает требованиям современности. Таким образом, работу в этом направлении следует продолжить.

В настоящее время известны следующие методы лабораторной диагностики сепсиса.

Микробиологические, которые основаны на выделении и идентификации микробного агента из крови на искусственных питательных средах (И.А. Бочков, Н. М. Овчарова. "Бактериальная колонизация и сукцессия у новорожденных в аспекте проблемы госпитальных инфекций" // Журн. микробиол.-1991.- 8.-С.71-75). Микробиологический метод занимает много времени, трудоемок и результаты не всегда своевременны.

Методы биохимической бактериологии косвенно свидетельствуют о присутствии возбудителя в крови, поскольку они основаны на действии микробных ферментов на характерные для них субстраты (оксидазный, индоловый галактозидазный, глюкуронидазный и ксилозидазный) (А.Г. Глоба. "Исследования некоторых биохимических компонентов ответа нейтрофилов в норме и патологии", М., "Медицина", 1991). Однако эти методы не могут использоваться для ранней диагностики сепсиса, поскольку они низкочувствительны и малоспецифичны, могут быть отнесены только к дополнительным, ориентировочным тестам.

Метод идентификации микробной ДНК в крови с помощью PCR-реакции основан на амплификации специфических участков ДНК возбудителя (Н.А. Федюшкина, О.Д. Видута, А. Л. Заплатников, С.Н. Щербо. "Диагностика внутриутробных инфекций методом полимеразной цепной реакции", М., "Медицина", 1998). Метод высокочувствителен и специфичен, но не может охватить весь спектр микроорганизмов, вызывающих бактериемию.

Прототипом предлагаемого изобретения выбран способ диагностики раннего сепсиса новорожденных, описанный Benitz W.E., Han M.Y., Madan A., Ramachandra P. "Serial serum C-reactive protein levels in the diagnosis of neonatal infection" ("Pediatrics" 1998 Oct; 102(4):E41).

Сущность способа состоит в том, что в первые дни после рождения у новорожденного берут кровь и в сыворотке серологическим методом (реакция иммунодиффузии по Манчини) определяют С-реактивный белок (СРБ). Повышение уровня СРБ более 6 мг/дл свидетельствует о развитии раннего септического процесса.

Недостатком прототипа является невысокая точность и чувствительность способа. По данным литературы чувствительность определения СРБ составляет 60%, специфичность 50% (Anwer S.K., Mustafa S. Rapid identification of neonatal sepsis. JPMA J. Pak. Med. Assoc. 2000 Mar; 50(3):94-98) СРБ, в отличие от ИЛ-6, является поздним маркером сепсиса.

Кроме того, ряд авторов указывает на ненадежность СРБ как диагностического маркера при ранней диагностике новорожденного сепсиса (Ronnestad A, Abrahamsen TG, Gaustad P, Finne PH. C-reactive protein (CRP) response patterns in neonatal septicaemia. APMIS 1999 Jun; 107(6):593-600; Коnо Т, Otsuka M, Ito M et al. Negative C-reactive protein in children with bacterial infection. Pediatr Int 1999 Oct;41(5):496-9).

Задачей изобретения является разработка более точного, высокочувствительного метода ранней диагностики септической инфекции у новорожденных на доклинической стадии.

Поставленная задача решается тем, что у новорожденных серологическим методом (ИФА) определяют уровень полифункционального цитокина интерлейкина-6 (ИЛ-6) в сыворотке крови и при концентрации ИЛ-6 от 40 пг/мл и выше диагностируют развитие септического процесса.

Тяжесть состояния новорожденных с респираторной патологией и перинатальным поражением центральной нервной системы вследствие основного и сопутствующих заболеваний, с учетом особенности иммунологических механизмов, характерных для перинатального периода - далеко не полный перечень факторов, определяющих специфичность иммунного статуса данной группы пациентов.

ИЛ-6 является одним из наиболее характерных примеров полифункционального цитокина. Этот небольшой гликопротеин с молекулярной массой 21-28 кД образуется как в лимфоидных, так и в нелифоидных клетках и действует на множество клеточных мишеней, включая Т-клетки, В-клетки, фибробласты, миелоидные предшественники и гепатоциты. Нашими исследованиями установлено, что мониторинговое определение цитокина ИЛ-6 в крови новорожденного позволяет с высокой степенью вероятности выявить септический процесс в самой ранней стадии в случае, если концентрация ИЛ-6 достигает 40 пг/мл или превышает это значение.

Работоспособность изобретения подтверждается следующими конкретными примерами.

Пример 1.

Ребенок Ч. , первых суток жизни, история болезни 12/1366. Дыхательная недостаточность (ДН) развилась в связи с аспирацией мекония через 3 часа после рождения. Ребенок переведен на искусственную вентиляцию легких (ИВЛ) в отделение реанимации. У новорожденного взяли 1 мл венозной крови, центрифугировали 3 мин при 5000 об/мин. 100 мкл полученной сыворотки внесли в микротитражные лунки планшет от набора для определения ИЛ-6 серологическим методом (методом ИФА). Из пластикового пакета со стрипами достали необходимое количество стрипов, учитывая, что при каждом проведении анализа используется 6 концентраций стандарта и один бланк-контроль. Пакет с оставшимися стрипами и с вложенным в него мешочком силикагеля снова плотно закрыли. Стрипы вставили в рамку-держатель, промаркировали с одной стороны. В каждую лунку внесли по 25 мкл инкубационного реагента. Добавили по 100 мкл исследуемого образца или раствора стандарта, а в лунки бланк-контроля - 100 мкл дилюента для образцов. Перемешали, встряхивая микропланшеты на шейкере (1000 об/мин), или пипетируя несколько раз содержимое лунок с помощью многоканальной пипетки. Покрыли микропланшет липкой пленкой и инкубировали в течение 2 часов при 37^oС. Промыли все лунки микропланшета 4 раза. Добавили в каждую лунку по 100 мкл приготовленного раствора конъюгата. Покрыли микропланшет новой липкой пленкой и инкубировали в течение 60 мин при 37^oС. Во время этой инкубации подготовили раствор конъюгата 2. Промыли все лунки микропланшета 4 раза. Добавили в каждую лунку по 100 мкл приготовленного раствора конъюгата 2. Покрыли микропланшет новой липкой пленкой и инкубировали в течение 30 мин при 37^o. Во время этой инкубации подготовили раствор субстрата. Промыли все лунки микропланшета 4 раза. Добавили в каждую лунку по 100 мкл приготовленного раствора субстрата. Инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Для остановки реакции в каждую лунку добавили 100 мкл 2N Н₂SО₄ (в той же последовательности и с такой же скоростью, как вносили раствор субстрата). Перемешали содержимое лунок осторожным постукиванием микропланшета по рамке-держателю.

Через 15 минут, установив ридер на ноль по значению оптической плотности (ОП450) в лунке с бланк-контролем, измеряли ОП450 во всех остальных лунках. Оптическую плотность цветной реакции регистрируют на фотометре (Labsystems Multiscan Plus, Финляндия) при длине волны 450 нм. Измерение при двух длинах волн (620 или 690 нм в качестве длины волны сравнения) рекомендуется, но не является обязательным.

Подсчет результатов производится по калибровочной кривой.

Цифры концентрации ИЛ-6 в сыворотке крови от 40 пг/мл и выше свидетельствуют о развитии септического процесса.

При поступлении в реанимационное отделение данного ребенка уровень ИЛ-6 в сыворотке составил 49,7 пг/мл.

Через 4 часа у ребенка появилось гнойное отделяемое из эндотрахеальной трубки, отмечалось нарастание бледности и мраморности кожных покровов, бактериологическое исследование выявило в крови рост St. Epidermalis.

Последующее определение ИЛ-6 проведено через 12 часов: уровень - 56,6 пг/мл. Произведена смена одного из антибиотиков. Вводились гипериммунные препараты плазмы и иммуноглобулина. На вторые сутки пребывания в отделении в крови определяется уровень ИЛ-6 45,6 пг/мл.

Дальнейший мониторинг за концентрацией ИЛ-6 показал динамику к снижению. На 6-е сутки у ребенка наступило клиническое улучшение, цифры ИЛ-6 снизились до 29 пг/мл. Ребенок отлучен от искусственной вентиляции легких на 14-е сутки и на 21-е сутки жизни переведен для дальнейшего лечения в отделение патологии новорожденных. При переводе признаки септической инфекции отсутствуют. Уровень ИЛ-6 в крови - 37 пг/мл.

Таким образом, из данного примера следует, что при повышенных свыше 40 пг/мл показателях ИЛ-6, развивался септический процесс и только своевременная патогенетическая терапия позволила его купировать.

Пример 2.

Ребенок Р. , первых суток жизни, история болезни 17/2075. Поступил из родильного дома в реанимационное отделение на ИВЛ в связи с нарастанием дыхательной недостаточности в возрасте 12 часов. При поступлении признаки инфицирования отсутствуют, в крови определяется уровень ИЛ-6 32,1 пг/мл. В реанимационном отделении ребенок получал респираторную терапию. Через 12 часов после поступления уровень ИЛ-6 28,6 пг/мл. В последующем цифры ИЛ-6 находились на уровне 24,3-35,3 пг/мл. Трехкратное бактериологическое исследование крови не обнаружило микробный рост. Ребенок был экстубирован на 9-е сутки лечения, на 12-е сутки жизни переведен в отделение патологии новорожденных для дальнейшего наблюдения и лечения.

Пример 3.

Ребенок Л., первых суток жизни, история болезни 16/1940. Доставлен в отделение реанимации на ИВЛ в связи с нарастанием дыхательной недостаточности. При поступлении в отделении в сыворотке крови ИЛ-6 43,5 пг/мл.

В связи с тем, что уровень ИЛ-6 выше 40 пг/мл, производилась смена антибиотиков, проводилась пассивная иммунокоррекция. Клинически через 4-6 часов пребывания в отделении у ребенка отмечалось творожисто-гнойное отделяемое из эндотрахеальной трубки. На 2-е сутки лечения симптомы гнойного трахеобронхита были купированы. Многопробное бактериологическое исследование крови не выявило роста микрофлоры. Через 12 часов после поступления уровень ИЛ-6 35,6 пг/мл. В последующем цифры ИЛ-6 находились на уровне 27,3-35,6 пг/мл. Ребенок был экстубирован на 11-е сутки лечения, на 16-е сутки переведен в отделение патологии новорожденных для дальнейшего наблюдения и лечения.

Предлагаемым методом было обследовано 23 новорожденных с перинатальным поражением ЦНС и респираторной патологией в возрасте 1-7 суток жизни, получавших лечение в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных. У 12 детей уровень ИЛ-6 значительно превышал концентрацию 40 пг/мл, что позволило предположить у них септическую инфекцию еще на доклиническом этапе заболевания. В последующем у 11 из этих новорожденных диагноз неонатальный сепсис был подтвержден клинико-бактериологически. У остальных детей уровень ИЛ-6 был ниже 40 пг/мл и у них септический процесс не развился.

Таким образом, исследование уровня ИЛ-6 в крови у новорожденных, находящихся на ИВЛ, показало, что точность заявляемого способа составляет 90,1%.

Исходя из вышеизложенного, заявляемый способ диагностики септической инфекции у новорожденных по сравнению с существующими имеет следующие преимущества: 1. Способ относится к методам экспресс- диагностики (время выполнения 3 часа).

2. Предлагаемый способ обладает высокой точностью и найдет широкое применение не только в отделениях реанимации, но и в других педиатрических отделениях.

3. Способ позволяет диагностировать септическую инфекцию на доклинической стадии.

Предлагаемый способ позволяет врачу с первых суток жизни по сывороточному уровню интерлейкина-6 у новорожденных оценить возможность развития септической инфекции, прогнозировать ее исход, своевременно назначить адекватную терапию, снижая число септических осложнений преимущественно за счет сокращения наиболее тяжелых форм сепсиса, улучшая, тем самым, состояние здоровья и качество жизни детей.

Формула изобретения

Способ доклинической диагностики сепсиса у новорожденных с респираторными расстройствами и перинатальным поражением центральной нервной системы путем серологического анализа крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови у новорожденных определяют уровень полифункционального цитокина интерлейкина-6 (ИЛ-6) и при его концентрации 40 пг/мл и выше диагностируют начало септического процесса.