Способ определения суммарных 17-кетостероидов в биологических жидкостях

 

Изобретение относится к медицине. В способе для определения берется 2,0-0,25 мл биологической жидкости, к которой прибавляют 0,05-0,4 мл концентрированной соляной кислоты. Затем нагревают в кипящей водяной бане и охлаждают при 0^oС. Добавляют 0,05-0,4 мл концентрированной щелочи и встряхивают. Часть экстракта переносят в лунку, выпаривают при температуре выше 40^oС, к сухому остатку добавляют цветообразующий реагент - 10% раствор м-динитробензола в пиридине и 4N щелочи, помещают в термостат при 45^oС на 25-40 мин, добавляют в лунку смесь пиридина и этилацетата в соотношении 1:1 и фотометрируют. Способ позволяет быстро и точно определять 17-кетостероиды с применением автоматизации процесса фотометрирования.

Изобретение относится к медицине, в частности к методам клинико-лабораторной диагностики, а именно к определению гормонов в биологических жидкостях.

Уже известен способ определения в моче метаболитов стероидных гормонов, который заключается в добавлении к 20 мл мочи 3 мл концентрированной соляной кислоты и 1 мл ледяной уксусной, перемешивании, перенесении на 15 минут в кипящую водяную баню. Далее пробу охлаждают до комнатной температуры, переносят в делительную воронку, где экстрагируют эфиром дважды по 10 мл. Водяную фазу сливают через кран, эфирный экстракт промывают трижды 8 мл 10% водным раствором едкого натра и один раз - 10 мл дистиллированной воды. Воду тщательно отделяют, экстракт переносят в центрифужную пробирку и выпаривают досуха струей воздуха на водяной бане 50-60^oС. К сухому остатку приливают 0,2 мл 2% раствора м-динитробензола в этаноле. Пробу встряхивают и оставляют для развития окраски на час в защищенном от света месте при комнатной температуре. Затем в эту же пробирку добавляют 3 мл 50% водного этанола и 2 мл хлороформа. Смесь встряхивают, после ее расслоения водную фазу отсасывают пипеткой, а к оставшемуся хлороформному слою прибавляют 1 мл 96^o-ного этанола. Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 520 нм с зеленым фильтром против контроля реактивов (Резников А.Г. Методы определения гормонов. Справочное пособие. 1980г. Киев: Наукова думка, стр.300-301). Главным недостатком данного метода является его трудоемкость и длительность выполнения.

Известен также способ, который заключается в предварительной активации сорбента, содержащегося в колонках, путем промывки его дистиллированной водой. Берут 1 мл 25% соляной кислоты, добавляют к 5 мл мочи и помещают в кипящую водяную баню на 10 минут, затем охлаждают. Гидролизат помещают в колонки и позволяют полностью стечь. В каждую колонку наливают 2 раза по 5 мл реагента 1. Перед добавлением новой порции позволяют первой полностью стечь. Затем в каждую колонку добавляют 3 раза по 1 мл реагента 2. Перед добавлением новой порции позволяют первой полностью стечь. Колонки выбрасывают. Экстракты смешивают. В каждую пробирку добавляют 0,5 мл реагента 3 и 1,5 реагента 4. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в темноте при 35^oС ровно 30 минут. Охлаждают до комнатной температуры и добавляют 4 мл диэтилового эфира, затем встряхивают. Эфирный слой фотометрируют на волне 520 нм (Леви С., Швартц Т. Клиническая химия, 1973г., т. 19, стр.679). Недостатком этого метода является его длительность - занимает целый рабочий день. Самыми трудоемкими стадиями являются многочисленные пропускания жидкости через колонки, при этом насадка колонок часто вспухает, что приводит к замедлению процесса. Кроме того, в описании подчеркивается, что нельзя проводить больше 20 определений одновременно, это говорит о плохой стабильности фотометрируемой окраски исследуемых образцов, которая в свою очередь влияет на точность определения. Метод является дорогостоящим - себестоимость одного определения более 7 долларов США.

Целью изобретения является повышение точности результатов, удешевление метода, сокращение времени исследования и автоматизация.

Эта цель достигается тем, что берут 2,0-0,25 мл биологической жидкости, прибавляют 0,05-0,4 мл концентрированной соляной кислоты, нагревают в кипящей водяной бане, охлаждают при 0^oС, добавляют 0,05-0,4 мл концентрированной щелочи, встряхивают, часть экстракта переносят в лунку планшетного ридера, выпаривают при температуре выше 40^oС, к сухому остатку добавляют цветообразующий реагент - 10% раствор м-динитробензола в пиридине и 4N щелочи, планшету помещают в термостат при температуре 45^oС на 25-40 минут, добавляют в лунку смесь пиридина и этилацетата в соотношении 1:1 и фотометрируют.

Изобретение поясняется на конкретных примерах.

Пример 1. Берут мочу в объеме 1,5 мл, добавляют 0,35 мл концентрированной соляной кислоты, нагревают в кипящей водяной бане, охлаждают при 0^oС, добавляют 0,35 мл концентрированной щелочи, встряхивают, часть экстракта переносят в лунку планшетного ридера, выпаривают при температуре выше 40^oС, к сухому остатку добавляют 0,2 мл цветообразующего реагента (10% раствор м-динитробензола в пиридине) и 0,1 мл раствора 4N-щелочи, планшету помещают в термостат при 45^oС на 35 минут, добавляют в лунку 2 мл смеси пиридина и этилацетата в соотношении 1:1, фотометрируют. Результат - 112 ммоль/л при норме от 15 до 30 ммоль/л соответствует адреногенитальному синдрому.

Пример 2. Берут 0,35 мл амниотической жидкости, прибавляют 0,06 мл концентрированной соляной кислоты, нагревают в кипящей водяной бане, охлаждают при 0^oС, добавляют 0,06 мл концентрированной щелочи, встряхивают, часть экстракта переносят в лунку планшетного ридера, выпаривают при температуре свыше 40^oС, к сухому остатку добавляют 0,2 мл цветообразующего реагента (10% раствор м-динитробензола в пиридине) и 0,1 мл раствора 4N-щелочи, планшету помещают в термостат при 45^oС на 30 минут, добавляют в лунку 2 мл смеси пиридина и этилацетата в соотношении 1:1 и фотометрируют. Полученный результат соответствует 1,5 ммоль/л при норме от 2,7 до 4,0 ммоль/л, что соответствует биологической незрелости организма матери к родам и при переводе на программированные роды приведет к первичной слабости родовой деятельности.

Пример 3. Для исследования была взята моча мужчины 30 лет, страдающего бесплодием и нарушением жирового обмена. Определения проводились, как описано в примере 1. При этом было получено значение экскреции 17-кетостероидов, в три раза превышающей норму. При дальнейшем более углубленном исследовании была выявлена гиперплазия коры надпочечников.

Способ успешно апробирован в условиях стандартной клинической лаборатории. Метод получил высокую оценку клиницистов. Практика показала, что он значительно дешевле по сравнению с ранее используемыми методами - себестоимость составляет 0,5 доллара США за одно определение. Автоматизация метода с применением планшетного ридера позволяет проводить в условиях стандартной лаборатории одним врачом-лаборантом до 100 и более исследований за рабочий день. Кроме того, удобство предложенного метода заключается также в том, что для его проведения не требуется зарубежного оборудования и ни одного импортного реактива.

Высокая эффективность и относительная простата определения 17-кетостероидов в биологических жидкостях основана на длительных научных исследованиях и экспериментах по разработке методики.

Важность исследования 17-кетостероидов впервые показана на практике в 1937 году, в настоящее время результаты этого исследования используются практически в каждой больнице у пациентов с эндокринной патологией, бесплодием, онкологическими заболеваниями, а также у беременных групп риска. Однако несмотря на высокую информативность для клиницистов не представляется возможным проводить исследование всем нуждающимся больным в связи с отсутствием необходимого оборудования в больничных лабораториях. Многократные попытки рационализировать методику определения метаболитов стероидов не привели к положительным результатам. Преимущество предложенного способа состоит в его неочевидности для специалистов-лаборантов, поскольку даже известная цветная реакция не могла быть применена в клинике в стандартной методике в связи с кажущейся ненужностью. Несомненной новизной заявленного метода является использование планшетного ридера, традиционно увязанного в психологии специалистов с определением гормонов сыворотки крови, основанной на реакции антиген-антитело.

Впервые в лабораторной диагностике 17-кетостероидов, ранее представлявшейся весьма трудоемким и длительным исследованием, произведен технологический прорыв, позволяющий значительно изменить все экономические параметры исследования. Существенно сокращено время исследования, снижена стоимость, полностью отсутствует зависимость от импортных реактивов.

Изобретение полностью пригодно к использованию в практической деятельности, обеспечивает получение существенного экономического и медико-социального эффекта в любом медицинском учреждении. Это позволяет сделать ранее дорогостоящий и редко применяющийся из-за этого анализ широко доступным для всех нуждающихся.

Формула изобретения

Способ определения суммарных 17-кетостероидов в биологических жидкостях с использованием кислотного гидролиза конъюгатов стероидов и цветной реакции м-динитробензола и щелочи в среде пиридина, отличающийся тем, что берут 2,0-0,25 мл биологической жидкости, прибавляют 0,05-0,4 мл концентрированной соляной кислоты, нагревают в кипящей водяной бане, охлаждают при 0^oС, добавляют 0,05-0,4 мл концентрированной щелочи, встряхивают, часть экстракта переносят в лунку планшетного ридера, выпаривают при температуре выше 40^oС, к сухому остатку добавляют цветообразующий реагент - 10% раствор м-динитробензола в пиридине и 4N щелочи, планшету помещают в термостат при 45^oС на 25-40 мин, добавляют в лунку смесь пиридина и этилацетата в соотношении 1: 1 и фотометрируют.