Способы определения in vitro биоактивности эритропоэтина

 

Изобретение имеет целью разработку способа определения in vitro активности эритропоэтина (ЭПО) in vivo в образце, содержащем ЭПО. В частности, способ включает в себя обработку образца, содержащего ЭПО, в условиях, в которых удаляют десиалилированный ЭПО, и измерение активности ЭПО in vitro в полученном обработанном образце. В предпочтительном варианте осуществления изобретения десиалилированный ЭПО удаляют из образца посредством инкубации с клетками клеточной линии гепатомы человека HepG2, и активность ЭПО in vitro определяют посредством инкубации обработанного образца с клетками ЭПО-реактивной клеточной линии и измерения пролиферации или жизнеспособности ЭПО-реактивных клеток. Изобретение обеспечивает количественное определение биологически активного ЭПО в различных типах образцов. 5 с. и 13 з.п. ф-лы, 3 табл.

Эритропоэтин (ЭПО) является гликопротеиновым гормоном, который стимулирует созревание клеток-предшественников эритроидов и таким образом регулирует образование эритроцитов у млекопитающих. Очистка человеческого ЭПО (чЭПО) и клонирование гена ЭПО привело к коммерческому производству рекомбинантного чЭПО, который успешно используется для лечения пациентов с анемией, являющейся результатом почечной недостаточности, и клинически полезен для лечения других видов анемий. Существующие способы количественного определения биологически активного ЭПО в образце, например, в технологии приготовления основных лекарственных средств, являются громоздкими, дорогостоящими и требующими больших затрат времени. К настоящему изобретению относятся безопасный, быстрый и относительно недорогой способ измерения биоактивности ЭПО in vivo и наборы для измерения биоактивности ЭПО.

ЭПО является гликопротеиновым гормоном, который стимулирует пролиферацию, дифференциацию и созревание клеток- предшественников эритроидов, превращающихся в эритроциты. ЭПО был очищен (Miyake et al., (1977) J.Biol. Chem. 252: 5558) и молекулярным способом клонирован (Lin et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7580), и рекомбинантный чЭПО был успешно использован в лечении анемии, развившейся на конечной стадии болезни почек. Сообщалось также о клиническом использовании ЭПО при лечении анемии, связанной со СПИДом, ревматоидным артритом, злокачественным развитием болезней крови и недоношенностью, а также для увеличения выхода собственной крови, собираемой перед операцией.

Рекомбинантный чЭПО имеет молекулярную массу 30,4 кДа, из которой 40% составляют углеводы. Изучение природы и функции гликозилирования ЭПО показало, что большинство олигосахаридных цепей чЭПО являются фукозосодержащими сиалилированными тетраантенными олигосахаридами. Структура гликозилирования ЭПО мочи человека и рекомбинантного ЭПО, продуцированного в клетках яичника китайского хомяка ( CHО), в клетках почки детеныша хомяка (ВНК) и в В-лимфобластах человека, похожа, но не идентична.

Выяснилось, что гликозилирование играет роль в растворимости, биосинтезе и секреции ЭПО, а также в метаболизме ЭПО in vivo. Исследовалась роль, которую играет в метаболизме in vivo гликозилирование, и, в частности, присутствие сиаловой кислоты. Было показано, что мочевой и рекомбинантный десиалилированный ЭПО теряют активность in vivo из-за быстрого печеночного клиренса. На основе этих и подобных им исследований было установлено, что сиаловая кислота образует чехол вокруг предпоследних остатков галактозы и таким образом защищает ЭПО от клиренса, осуществляемого рецепторами гепатоцитов асиалогликопротеина (галактозила). Поэтому потеря конечных остатков сиаловой кислоты из олигосахаридов ЭПО приводит к незащищенности остатков галактозы, что приводит к быстрому клиренсу десиалилированного (называемого также "асиалилированным") ЭПО из плазмы, путем связывания с гепатическим рецептором.

Хотя десиалилированный ЭПО существенно биологически неактивен in vivo из-за его быстрого клиренса, его биоактивность сохраняется в анализах, проводимых in vitro. Стандартные анализы для определения биоактивности ЭПО in vitro включают в себя измерение включения меченого тритием тимидина в селезеночные эритробласты анемичных мышей, подвергнутых воздействию фенилгидразина (Krystal (1983) Exp. Hematol, 20:649), или в клетки человеческой полипотентной лейкемической клеточной линии (Lewis et al. (1989) Exp. Hematol, 17: 102), измерение включения ³⁹Fe в культивируемые клетки костного мозга (Goldwasser et al. (1975) Endocrinology 97:315), и измерение роста ЭПО-зависимых клеточных линий (Kitamura et al. (1989) Blood 73:375).

Поскольку анализы in vitro не могут выявить различий между сиалилированным и десиалилированным ЭПО, то такие анализы не дают возможности произвести количественное определение популяции ЭПО, которая может быть активной in vivo. Например, если образец, содержащий ЭПО, содержит также и значительное количество десиалилированного ЭПО, то проведенные in vitro анализы дадут результаты, превышающие фактическое значение активности in vivo. Поэтому для измерения активности ЭПО in vivo используются анализы, проводимые in vivo. В частности, активность ЭПО измеряется включением ³⁹Fe в эритробласты эритроцитозных мышей Cotes et al. (1961) Nature 191:1065) или голодавших крыс (Goldwasser et al. (1975) Methods Enzymol, 37:109).

В данном анализе, который представляет собой модификацию методики Cotes et al., самок мышей подвергали воздействию низкого давления в течение 14 суток. Эндогенное образование эритроцитов подавлялось эритроцитозом, вызванным пребыванием в условиях пониженного давления. Поскольку эритроцитозное состояние сохраняется после гипоксии, то образование новых эритроцитов связано с введением экзогенного ЭПО. Опытные образцы и стандарты ЭПО затем подкожно инъецировали ч стандартным мышам. Через 48 ч после инъекции вводили ³⁹Fe. Еще через 48 ч взяли анализы крови и произвели количественный анализ их радиоактивности. Величина радиоактивности была прямо пропорциональна инъецированной дозе стандарта ЭПО; активность in vivo неизвестных образцов рассчитывалась на основе кривой стандарта.

Биологический анализ in vivo широко признан в качестве единственного надежного способа измерения биологической активности in vivo, поскольку он измеряет как циркуляционную продолжительность ЭПО, так и его пролиферативную активность. Однако анализ in vivo имеет значительные недостатки, заключающиеся в том, что он трудоемкий, дорогостоящий, требует больших затрат времени, и результаты его зависят от индивидуальной изменчивости животных.

Настоящее изобретение касается способа количественного определения в условиях in vitro активности ЭПО in vivo, который устраняет недостатки существующих способов.

Целью настоящего изобретения является способ определения in vitro активности ЭПО in vivo в образце, содержащем ЭПО. В частности, настоящий способ включает в себя обработку образца, содержащего ЭПО, в условиях, которые удаляют десиалилированный ЭПО, и измерение в условиях in vitro активности ЭПО в полученном обработанном образце. В предпочтительном варианте осуществления изобретения десиалилированный ЭПО удаляют из образца путем инкубации этого образца с клетками клеточной линии гепатомы человека HepG2, и активность ЭПО in vitro определяют путем инкубации обработанного образца с клетками ЭПО-реактивной клеточной линии и измерения пролиферации или жизнеспособности ЭПО- реактивных клеток.

Другой целью настоящего изобретения является разработка набора, который включает в себя первый контейнер, содержащий клетки, которые экспрессируют рецептор асиалогликопротеина, и второй контейнер, который содержит ЭПО-реактивные клетки. В другом варианте осуществления изобретения данный набор содержит еще и третий контейнер, содержащий краситель, определяющий жизнеспособность, такой, как 3-[4,5- диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ).

Целью настоящего изобретения является способ определения in vitro активности ЭПО in vivo в образце, содержащем ЭПО. В частности, настоящий способ включает в себя обработку образца, содержащего ЭПО, в условиях, когда удаляют десиалилированный ЭПО, и измерение in vitro активности ЭПО в полученном обработанном образце. Настоящее изобретение, в частности, полезно для определения активности in vivo в лекарственных формах ЭПО, предназначенных для клинического использования.

Под активностью ЭПО in vitro подразумевается его способность стимулировать пролиферацию или жизнеспособность, in vitro, клеток, которые экспрессируют функциональный рецептор ЭПО, например, в клетках-предшественниках эритроидов. Как обсуждается ниже, как сиалилированный, так и десиалилированный ЭПО активны in vitro. Под активностью ЭПО in vivo подразумевается его способность стимулировать пролиферацию клеток-предшественников эритроидов in vivo. При этом здесь принимается во внимание, что десиалилированный ЭПО существенно неактивен in vivo из-за быстрого печеночного клиренса.

В соответствии с настоящим изобретением, ЭПО-содержащий образец может быть в форме частиц или жидкости, и предпочтительно должен представлять собой сыворотку или плазму, среду для культивирования клеток, очищенный или частично очищенный рекомбинантный ЭПО, или лекарственную форму ЭПО, предназначенную для клинического использования, для исследований стабильности или изучения лекарственных форм.

В соответствии с настоящим изобретением, ЭПО-содержащий образец обрабатывают в условиях, в которых удаляют десиалилированный ЭПО. Десиалилирование ЭПО приводит к тому, что олигосахариды ЭПО подвергаются воздействию предпоследних остатков галактозы. Поэтому десиалилированный ЭПО может быть удален из ЭПО-содержащего образца посредством того, что образец подвергают аффинной хроматографии с лектином, который имеет сродство к галактозе, например Абрин А, или аффинной хроматографии с иммобилизованным антителом, специфичным для галактозы. Методики выполнения лектиновой аффинной хроматографии известны обычным специалистам в данной области техники.

В другом варианте осуществления данного изобретения десиалилированный ЭПО удаляют из ЭПО-содержащего образца посредством инкубации с клетками, экспрессирующими рецептор асиалогликопротеина. Эти клетки могут экспрессировать рецептор асиалогликопротеина естественно, либо в результате генно-инженерного вмешательства они могут экспрессировать этот рецептор рекомбинантно. Например, фибробласты, трансфецированные с кДНК (комплементарной ДНК), кодирующей суб-единицы HL-1 и HL-2 рецептора асиалогликопротеина, экспрессируют функциональный рецептор. Трансфецированные фибробласты, экспрессирующие рекомбинантный рецептор асиалогликопротеина, могут быть получены с помощью методики Shia et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1158.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения десиалилированный ЭПО удаляют из ЭПО-содержащего образца путем инкубации с клетками клеточной линии гепатомы человека HepG2 (Американская коллекция тканевых культур, N НВ 8065), для которых известно, что они естественно экспрессируют функциональный рецептор асиалогликопротеина при высокой плотности (см., например, Lodish, (1991), Trends in Biochem. Science 16: 374). Клеточная линия HepG2 описана авторами Knowles et al. (1980) Science 209: 497, а также в патенте США 4393133, принадлежащем Knowles et al.

Подходящие условия для инкубации ЭПО-содержащего образца с клетками, которые экспрессируют рецептор асиалогликопротеина, могут быть определены специалистами в данной области техники и могут варьировать в зависимости от типа клеток и источника образца. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки выращивают до предслияния, промывают, и клеточные суспензии помещают в лунки культурального планшета. Каждую лунку, содержащую прилипшие клетки, несколько раз промывают буферным раствором, буферный раствор удаляют, и стандарты ЭПО или опытные образцы помещают в каждую лунку. Клетки и ЭПО-содержащие образцы инкубируют до следующего дня (около 15 - 20 ч) при 37^oC в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂ и 95% воздуха. Надосадочные жидкости из инкубационных смесей, которые в соответствии с настоящим изобретением называются "обработанные образцы" и из которых была адсорбирована ЭПО, затем переносят в сосуды для анализа пролиферативной активности ЭПО.

Для того чтобы подтвердить, что десиалилированный ЭПО был удален либо с помощью афинной хроматографии, либо путем инкубации с клетками, экспрессирующими рецептор асиалогликопротеина, ЭПО можно подвергнуть воздействию условий, способствующих десиалилированию. Химические и ферментативные способы осуществления деасиалилирования известны специалистам в данной области техники. Коротко говоря, ЭПО можно химически десиалилировать путем нагревания при 80^oC в течение 60 мин в 0,1 мол/л растворе HCl. Десиалилирование может быть также осуществлено путем инкубации ЭПО с иммобилизованной нейраминидазой. Конкретные условия для десиалилирования ЭПО описаны в работе Spivak et al (1989) Blood 73: 90. Анализ ЭПО до и после десиалилирования, например, посредством изоэлектрического фокусирования, может использоваться для того, чтобы определить, удалена ли сиаловая кислота.

Вслед за обработкой ЭПО-содержащего образца, имевшей целью адсорбировать десиалилированный ЭПО, как описано выше, производят определение пролиферативной активности ЭПО. Как описано выше, термин "обработанный образец" обозначает образец, который был обработан для того, чтобы удалить десиалилированную ЭПО, например, с помощью лектиновой аффинной хроматографии или посредством инкубации с клетками, которые экспрессируют функциональный рецептор асиалогликопротеина. Этот обработанный образец может представлять собой, например, надсадочную жидкость клеточной культуры.

Пролиферативная активность может быть определена, например, посредством измерения изменений в числе клеток или в синтезе ДНК ЭПО-реактивных клеток в ответ на инкубацию с обработанным образцом. В соответствии с настоящим изобретением, под ЭПО-реактивными клетками подразумеваются клетки, которые пролиферируют или сохраняют жизнеспособность в ответ на ЭПО. ЭПО-реактивные клетки, которые могут быть использованы для измерения in vitro пролиферативной активности ЭПО, включают в себя клетки-предшественники эритроидов, свежеэксплантированные из кроветворных органов, стабилизированные клеточные линии, которые естественно экспрессируют рецепторы ЭПО, а также стабилизированные клеточные линии, которым с помощью методов генетической инженерии было придано свойство экспрессировать ген рецептора ЭПО. Клеточные линии, которые естественно экспрессируют рецепторы ЭПО, обычно происходят из злокачественных клеток животных, имеющих опухоли. Например, клеточные линии мышиных эритроидов были получены от больных эритролейкозом мышей, инфецированных вирусным комплексом лейкоза Френда или вирусным комплексом лейкоза Раушера. Линии человеческих клеток были созданы на основе клеток, полученных от больных " лейкозом пациентов. Другие клеточные линии были подвергнуты воздействию методов генной инженерии для того, чтобы они продуцировали большие количества рецепторов ЭПО, и чтобы они требовали ЭПО для своего выживания, что было сделано путем интродукции и экспрессии гена рецептора ЭПО. ЭПО-реактивные клеточные системы известны обычным специалистам в данной области техники и о них сообщается в обзоре Koury et al. (1992) Eur. J. Biochem. 210: 649.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения ЭПО-реактивные клетки - это клетки мультипотентной клеточной линии B6SUtA, происходящей из предшественников кроветворных клеток, описанной Greenberger et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2931. Эта клеточная линия B6SUtA была получена из долговременных культур клеток костного мозга мышей B6.S.

Пролиферация ЭПО-реактивных клеток может быть измерена путем количественного определения увеличенного синтеза ДНК в ответ на ЭПО. Увеличенный синтез ДНК обычно определяют in vitro посредством измерения включения меченого тритием тимидина. Соответствующие анализы известны в данной области техники и описаны, например, авторами Krystal et al. (1983) Exp. Hematol. 11: 649 и Lewis et al. (1989) Exp. Hematol. 17: 102. Коротко говоря, препараты ЭПО-реактивных клеток инкубируют с ЭПО-содержащими опытными образцами, в микротитровых лунках культуральных планшетов, обычно в течение 22 ч при 37^oC, в увлажненной атмосфере, состоящей из 5% CO₂ и 95% воздуха. Меченый тритием тимидин добавляют из такого расчета, чтобы создать окончательную концентрацию примерно в 0,3710⁴ Бк на лунку. После дополнительных двух часов инкубации содержимое лунок собирают на фильтры из стекловолокна, и полученную радиоактивность измеряют с помощью сцинтилляционной спектрометрии. Для стандартизации величину радиоактивности, включенной в ДНК, показывают на графике по сравнению с активностью ЭПО в мЕ/мл.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, который не требует использования радиоактивности, пролиферация ЭПО-реактивных клеток измеряется спектрофотометрически, посредством использования красителя МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2- ил] 2-,5-дифенилтетразолий бромид). (Mossman, 1983, Immounological methods 65, 55). МТТ в растворе имеет желтоватый цвет, а в результате действия митохондриальных дегидрогеназ живых клеток он превращается в темно-синий/пурпурный нерастворимый в воде формазин МТТ. Синие кристаллы переводят в растворимую форму с помощью кислотного изопропанола, и интенсивность окрашивания измеряют колорометрически при 570 и 690 нм. Таким образом, количество ММТ, преобразованного в окрашенный формазин, является прямой мерой количества клеток, которое в свою очередь является индикатором пролиферации клеток. Сравнение оптических плотностей неизвестных образцов по сравнению со стандартами используется для расчета биологической активности. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения обработанный образец инкубируют с ЭПО-реактивными клетками в лунках микротитрового культурального планшета примерно в течение 46-50 ч при температуре 37^oC, в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂ и 95% воздуха. Затем в каждую ячейку добавляют МТТ и инкубируют еще 2 ч при 37^oC. После перевода синих кристаллов в растворимую форму измеряют оптические плотности и определяют активность ЭПО путем сравнения количеств клеток, продуцированных неизвестным образцом, с кривой стандартов ЭПО. МТТ коммерчески доступен в виде наборов, которые содержат краситель МТТ и раствор для солюбилизации (перевода в растворимое состояние). (Набор МТТ, Корпорация Промега). Кроме МТТ другие индикаторные красители, такие как XТТ (3,3'-(1- ((фениламино)карбонил)-3,4-тетразолий)-бис(4-метокси-6-нитро) бензолсульфоновая кислота, натриевая соль) и MTS (3-(4,5- диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)- 2Н-тетразолий, внутренняя соль) также могут использоваться для той же цели.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения десиалилированный ЭПО удаляют из образца путем инкубации образца с клетками клеточной линии гепатомы человека HepG2, а активность ЭПО in vitro определяют путем инкубации обработанного образца, т.е. надосадочной жидкости из клеток HepG2, с клетками ЭПО-зависимой клеточной линии, и измерения пролиферации или жизнеспособности ЭПО-зависимых клеток. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, который пояснен ниже, в примере 1, ЭПО-зависимой клеточной линией является линия B6SUtA, а пролиферацию клеток или жизнеспособность измеряют спектрофотометрически, с помощью красителя МТТ.

Было установлено в соответствии с настоящим изобретением, что сродство in vitro рецептора асиалогликопротеина клеток HepG2 к десиалилированному ЭПО эффективно имитирует существующую in vivo функцию быстрого клиренса десиалилированного ЭПО. Кроме того, было установлено, что культуральная среда клеток, которая содержит ЭПО, может индуцировать пролиферацию ЭПО-реактивных клеток.

Другой целью настоящего изобретения является разработка набора для определения активности ЭПО in vivo в образце, содержащем ЭПО. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения этот набор разделен на отделения для того, чтобы получить первый контейнер, содержащий клетки, которые экспрессируют рецептор асиалогликопротеина, и второй контейнер, который содержит ЭПО-зависимые клетки. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки, которые экспрессируют рецептор асиалогликопротеина - это клетки HepG2, а ЭПО-зависимые клетки - это клетки B6SUtA. В другом варианте осуществления данного изобретения данный набор включает в себя еще и третий контейнер, содержащий МТТ.

Нижеследующий пример дает дополнительные пояснения к настоящему изобретению. Настоящее изобретение не ограничивается этими примерами, ограничиваясь только прилагаемой формулой изобретения.

ПРИМЕР 1 Клетки HepG2 выращивают в 100-миллиметровых культуральных планшетах до тех пор, пока они не достигают стадии слияния. В этот момент клетки промывают фосфатно-буферной солью, обрабатывают трипсином, чтобы отделить их от планшета, и приготавливают клеточную суспензию с плотностью 0,2510⁶ клеток/мл в среде для культивирования клеток, 1 мл этой суспензии помещают в каждую лунку 24-луночного культурального планшета. Через три дня клетки HepG2 готовы для использования их в анализе ЭПО.

Каждую лунку, содержащую клетки HepG2, пять раз промывают фосфатно-буферной солью (ФСБ). После того, как ФСБ полностью удалили, по 100 мкл среды (среда Дульбекко MEM, содержащая 10% фетальной телячьей сыворотки и глютамин) помещают в каждую лунку. Для инициации кривой стандарта ЭПО берут эталонный стандарт ЭПО в концентрации 10 Е/мл и разбавляют его в 2 раза, путем смешивания со 100 мкл каждого раствора, помещаемого в отдельную лунку. Клетки плюс растворы ЭПО инкубируют до следующего дня при температуре 37^oC в инкубаторе с высокой влажностью, содержащем 5% CO₂. После инкубации готовят кривую стандарта, путем разбавления средой стандарта, обработанного HepG2 и имеющего концентрацию в 5 Е/мл, в 5 раз, чтобы получить раствор с концентрацией 1 Е/мл. Каждый обработанный образец разбавляется средой в 10 раз, чтобы получить растворы с установленной концентрацией в 0,5 Е/мл. После этого стандарты и образцы готовы для проведения анализа пролиферации. Примерно в то же самое время, когда стандарт и образцы добавляют к клеткам HepG2, клетки B6SUtA готовят к тому, чтобы начать анализ пролиферации на следующий день. Эти клетки выращивали на среде (такой, как описано выше), с добавкой IL-3 в количестве 20 нг/мл; пассировали два раза в неделю при разбавлении 1:20. Клетки готовят путем однократной промывки средой и доводят до первоначального объема в среде без IL-3. Клетки инкубируют до следующего дня в 100-миллиметровых культуральных планшетах (37^oC, 5% CO₂). После инкубации клетки снова промывают в среде и вновь готовят клеточную суспензию с окончательной концентрацией в 10⁶ клеток/мл. Используя 96-луночный культуральный планшет, смешивают по 50 мкл клеток B6SUtA с каждым стандартом ЭПО и образцом. Планшет инкубируют 48 ч при 37^oC в инкубаторе с 5% CO₂.

Пролиферацию клеток или жизнеспособность измеряют с помощью набора МТТ корпорации Промега. Количество МТТ, превратившегося в окрашенный формазин, прямо связано с количеством клеток. Эта процедура в кратком изложении выполняется следующим образом. 20 мкл красителя МТТ (корпорации Промега) добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 2 ч при 37^oC. Затем в каждую лунку добавляют 100 мкл солюбилизационного раствора (корпорации Промега) и инкубируют при комнатной температуре до тех пор, пока темно-синий/пурпурный осадок растворится, обычно 1 - 4 ч. Затем планшеты прочитывают в планшетридере (аппарате для прочтения планшетов) при оптической плотности 570 и 690 нм. Активность ЭПО определяют путем сравнения количества клеток, продуцированных неизвестным образом, с кривой стандарта ЭПО. Биоактивность рассчитывают путем деления рассчитанной активности на 0,5 Е/мл и умножения на 100%.

В таблице 1 показаны репрезентативные оптические плотности и рассчитанные значения стандартов ЭПО, имеющих концентрации от 0 до 1000 мЕ/мл, определенные в вышеописанных условиях. Как можно видеть из рассчитанных значений, способ по настоящему изобретению обеспечивает точные измерения стандартов ЭПО.

Когда те же самые стандарты анализировали на пролиферативную активность в отсутствие предварительной инкубации с клетками HepG2, то были получены подобные же результаты, как представлено в таблице 2. Эти результаты показывают, что обработка с помощью клеток HepG2 не оказывает существенного влияния на кривую стандарта ЭПО.

Образцы с известными и варьирующими количествами десиалилированного ЭПО были проанализированы настоящим способом, а также в отсутствие предварительной инкубации с клетками HepG2. Как можно видеть из таблицы 3, образцы, содержащие значительные количества десиалилированного ЭПО, индуцируют большую величину пролиферативной реакции до инкубации с клетками HepG2 (R2), чем после инкубации с клетками HepG2 и адсорбции десиалилированного ЭПО (R1). В таблице 3 также показаны ожидаемые количества сиалилированного (интактного) ЭПО и значения, рассчитанные на основе оптических плотностей, полученных в соответствии с настоящим способом. Как можно видеть из таблицы 3, настоящий способ высокоточен в количественном определении сиалилированного (т.е. активного in vitro) ЭПО в образце.

Настоящее изобретение описано здесь со ссылкой на определенные предпочтительные варианты его осуществления и на пример. Поскольку специалистам в данной области техники очевидны различные модификации, то подразумевается, что настоящее изобретение не ограничивается изложенным здесь, ограничиваясь только формулой изобретения, которая следует ниже.

Формула изобретения

1. Способ определения in vitro активности эритропоэтина (ЭПО) in vivo в образце, содержащем ЭПО, который включает обработку образца с помощью лектиновой аффинной хроматографии в условиях in vitro, которые удаляют десиалилированный ЭПО, и измерение активности ЭПО in vitro в обработанном образце.

2. Способ определения in vitro активности эритропоэтина (ЭПО) in vivo в образце, содержащем ЭПО, который включает обработку образца с помощью инкубации с клетками, которые экспрессируют рецептор асиалогликопротеина, в условиях in vitro, которые удаляют десиалилированный ЭПО, и измерение активности ЭПО in vitro в обработанном образце.

3. Способ по п.2, в котором указанные клетки экспрессируют указанный рецептор асиалогликопротеина естественно или рекомбинантно.

4. Способ по п.2, в котором указанные клетки являются клетками HepG2.

5. Способ определения in vitro активности эритропоэтина (ЭПО) in vivo в образце, содержащем ЭПО, который включает обработку образца в условиях in vitro, которые удаляют десиалилированный ЭПО, и измерение активности ЭПО in vitro в обработанном образце посредством инкубации указанного обработанного образца с ЭПО-реактивными клетками и измерение пролиферации или жизнеспособности ЭПО-реактивных клеток.

6. Способ по п. 5, в котором указанные ЭПО-реактивные клетки являются клетками B6SUtA.

7. Способ по п.5, в котором указанную пролиферацию указанных ЭПО-реактивных клеток измеряют посредством определения увеличения синтеза ДНК.

8. Способ по п.7, в котором увеличение синтеза ДНК измеряют посредством определения включения меченного тритием тимидина.

9. Способ по п.5, в котором указанную пролиферацию указанных ЭПО-реактивных клеток измеряют спектрофотометрически.

10. Способ по п.5, в котором указанную пролиферацию указанных ЭПО-реактивных клеток измеряют посредством инкубации указанных клеток с 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил] 2,5-дифенилтетразолий бромидом (МТТ) и измерения превращения МТТ в формазин МТТ.

11. Способ определения in vitro активности эритропоэтина (ЭПО) in vivo в образце, содержащем ЭПО, который включает: (а) инкубацию указанного образца с клетками HepG2; (б) взятие надосадочной жидкости из указанных клеток HepG2; (в) инкубацию указанной надосадочной жидкости с клетками B6SUtA; (г) измерение пролиферации указанных клеток B6SUtA; и (д) расчет активности ЭПО.

12. Способ по п.11, в котором указанный образец, содержащий ЭПО, инкубируют с указанными клетками HepG2 в течение приблизительно 15-20 ч при 37^oС в указанной атмосфере с 5% СO₂ и 95% воздуха.

13. Способ по п.11, в котором указанную надосадочную жидкость инкубируют с клетками B6SUtA в течение приблизительно 46-50 ч при 37^oС.

14. Способ по п.11, в котором указанную пролиферацию указанных клеток B6SUtA измеряют путем инкубации указанных клеток с МТТ и измерения превращения МТТ в формазин МТТ.

15. Способ по п. 11, в котором указанную активность ЭПО рассчитывают путем сравнения пролиферации, продуцированной образцом, содержащим ЭПО, с пролиферацией, продуцированной стандартом ЭПО.

16. Разделенный на отделения набор, включающий первый контейнер, содержащий клетки, которые экспрессируют рецептор асиалогликопротеина, и второй контейнер, содержащий ЭПО-реактивные клетки.

17. Разделенный на отделения набор по п.16, в котором указанные клетки, которые экспрессируют рецептор асиалогликопротеина, являются клетками HepG2.

18. Разделенный на отделения набор по п.16, в котором указанные ЭПО-реактивные клетки являются клетками B6SUtA.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3