Применение 2-фенил-3-ароилбензотиофенов для ингибирования тромботического расстройства, для увеличения активации протеина с

 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии. Предложено новое средство для ингибирования тромботического расстройства (инфаркта миокарда, нестабильной стенокардии, ишемии сердца, инсульта и др.) и для увеличения активации протеина С как механизма действия нового средства. В качестве такого средства предложены 2-фенил-3-ароилбензотиофены общей формулы (I), в частности ралоксифен. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения. 2 с. и 6 з.п.ф-лы, 1 табл.

Процесс свертывания крови и тромбообразование вызывается комплексным протеолитическим каскадом, ведущим к образованию тромбина. Тромбин протеолитически удаляет активационные пептиды из A - и B -цепей фибриногена, который растворяется в плазме крови, инициируя образование нерастворимого фибрина.

Антикоагуляция обычно достигается путем введения гепаринов и кумаринов. Парентеральное фармакологическое регулирование коагуляции и тромбообразования основывается на ингибировании тромбина благодаря применению гепаринов. Гепарины косвенно воздействуют на тромбин, ускоряя ингибирующее действие эндогенного антитромбина Ш (основного физиологического ингибитора тромбина). Поскольку уровень антитромбина Ш в плазме изменяется, и поскольку поверхностно-связанный тромбин оказывается устойчивым к таковому косвенному механизму воздействия, лечение гепаринами может быть неэффективным. Поскольку полагают, что некоторые испытания на свертывание являются эффективными и надежными, уровень гепарина обычно контролируют с помощью испытаний на свертывание (в частности, определяя время активированного неполного тромбопластина (the activated partial thromboplastin time (APTT) assay)/. Кумарины препятствуют генерации тромбина, блокируя посттрансляциональное гамма-карбоксилирование при синтезе протромбина и других протеинов этого типа. Вследствие механизма из воздействия, действие кумаринов может проявляться только медленно, через 6-24 часа после введения. Кроме того, они не являются селективными антикоагулянтами. Кумарины также требуют контроля с помощью испытаний на свертывание (в частности, определения протромбинового времени).

Для лучшего понимания изобретения, далее приводится краткое описание системы ферментной коагуляции. Систему коагуляции, иногда называемую также "каскадом", лучше всего рассматривать как цепную реакцию, включающую последовательную активацию зимогенов до активных сериновых протеаз, которая, в конечном счете, приводит к образованию фермента тромбина. Тромбин, через ограниченный протеолиз, превращает фибриноген плазмы в нерастворимый гель-фибрин. Двумя ключевыми моментами в коагуляционном каскаде являются конверсия фактора свертывания Х и Ха посредством фактора свертывания IХа и конверсия протромбина в тромбин под действием фактора свертывания Ха.

Обе реакции происходят на поверхности клеток, наиболее заметно на поверхности пластинчатых эндотелиальных клеток, и обе реакции требуют кофакторов. Основные кофакторы факторы V и VIII циркулируют как относительно неактивные предшественники, но когда образуются первые несколько молекул тромбина, тромбин, путем ограниченного протеолиза, активирует кофакторы. Активированные кофакторы Vа и VIIIа ускоряют, примерно на три порядка, как конверсию протромбина в тромбин, так и конверсию фактора Х в фактор Ха.

Активированный протеин С в большинстве случаев предпочитает два плазменных протеина-субстрата, которые он гидролизует и необратимо разрушает. Эти плазменные протеиновые субстраты представляют собой активированные формы кофакторов свертывания V и VIII (кофакторы Vа и VIIIа, соответственно). Активированный протеин С только минимально разрушает неактивные предшественники - факторы свертывания V и VIII. На собаках показано, что активированный протеин С резко увеличивает уровень циркуляции основного физиологического фибринолитического фермента тканевого плазменного активатора.

Однако активация протеина С затрагивает тромбин, конечную сериновую протеазу в коагуляционном каскаде, и связанный с мембранами эндотелиальных клеток гликопротеин тромбомодулин. Тромбомодулин образует прочный стехиометрический - 1:1 - комплекс с тромбином. Тромбомодулин, когда образует комплекс с тромбином, существенно модифицирует свойства тромбина. Тромбин, в каскаде коагуляции, обычно свертывает фибриноген, активирует тромбоциты и превращает кофакторы свертывания V и VIII в их активные фоор формы Vа и VIIIа. Тромбин, когда один, действует как активатор протеина С, но только очень медленно и неэффективно. В противоположность этому, тромбин в виде комплекса 1: 1 с тромбомодулином не способен свертывать фибриноген, не активирует тромбоциты, и не превращает факторы свертывания V и VIII в их активные формы. Комплекс тромбина с тромбомодулином промотирует активацию протеина С, причем константа скорости активации протеина С в 20000 раз выше для комплекса тромбина С с тромбомодулином, чем для одного тромбина.

Следовательно, активированный протеин С является противотромботическим средством с более широким терапевтическим индексом, чем другие антикоагулянты, такие как гепарин и оральные антикоагулянты гидроксикумаринового типа, такие как варфарин. Ни протеин С, ни активированный протеин С не являются эффективными до тех пор, пока в каком-либо отдельном месте не генерируется Тромбин. Активированный протеин С фактически неэффективен без тромбина, поскольку тромбин нужен для того, чтобы превратить факторы свертывания V в Va, а фактор свертывания VIII в VIIIа. Как отмечалось, активированные формы двух кофакторов являются предпочтительным субстратом для активированного протеина С. При введении пациентам зимоген протеина С будет оставаться неактивным до тех пор, пока генерируется тромбин. Без комплекса тромбомодулина с тромбином зимоген протеина С превращается в активированный протеин С с очень небольшой скоростью. Настоящее изобретение направлено на раскрытие соединений, определение которым дается ниже, которые увеличивают экспрессию тромбомодулина, и биологически пригодны для перорального применения.

Настоящее изобретение предлагает способ ингибирования тромботических расстройств или случая, который включает введение нуждающемуся в таком лечении человеку эффективного количества соединения формулы I в которой R¹ и R³, независимо, представляют собой водород, -СН₃, где Ar представляет собой необязательно замещенный фенил; R² выбирают из группы, состоящей из пирролидино-, гексаметиленимино и пиперидиногрупп, и его фармацевтически приемлемых солей и сольватов.

Изобретение также охватывает способ увеличения скорости активации протеина С, который включает введение соединения формулы I.

Настоящее изобретение касается открытия, что выбранная группа 2-фенил-3-ароилбензотиофенов (бензотиофенов) формулы I пригодны для увеличения экспрессии тромбомодулина. Способы применения, предлагаемые настоящим изобретением, на практике представляют собой введение человеку или млекопитающему, нуждающемуся в этом, дозы соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, или его сольвата, которая является эффективной для увеличения экспрессии тромбомодулина. Настоящий способ включает как консервативное лечение, так и/или профилактическую обработку, в зависимости от предназначения.

Термин "ингибирование" включает обычные значения, которые включают задержку, предупреждение, торможение, замедление или реверсию.

Ралоксифен - соединение настоящего изобретения - представляет собой гидрохлорид соединения формулы I, в которой R¹ и R³ представляют собой водород, и R² является 1-пиперидинилом.

Обычно соединение формулируют с обычными эксципиентами, разбавителями или носителями, и прессуют в таблетки, или формулируют в виде эликсиров или растворов для обычного перорального введения, или вводят внутримышечно или внутривенно. Соединения могут быть введены чрезкожно, и могут быть сформулированы в виде дозировочных форм с длительным высвобождением, и т.п.

Соединения, применяемые в способах настоящего изобретения, могут быть получены в соответствии с разработанными методиками, такими, какие подробно описаны в патентах США 4133814, 4418068 и 4380635, которые все внесены в настоящее изобретение в качестве ссылок. Вообще, способ начинается с бензо[b] тиофена, содержащего 6-гидроксильную группу и 2-(4-гидроксифенильную) группу. В исходное соединение вводят защитную группу, алкилируют или ацилируют, и удаляют защитную группу, чтобы получить соединения формулы I. Примеры получения таких соединений приводятся в упомянутых выше патентах США. Необязательно замещенный фенил включает фенил и фенил, замещенный одной или двумя группами, из числа (C₁-C₆)-алкила, (С₁-С₄) -алкоксила, гидроксигруппы, нитрогруппы, хлора, фтора или три(хлор-или фтор)метила.

Соединения, используемые в способах настоящего изобретения, образуют соли присоединения кислот и оснований с широким рядом органических кислот и неорганических кислот и оснований, которые часто применяются в фармацевтической химии. Такие соли также являются частью настоящего изобретения. Типичные неорганические кислоты, применяемые для образования таких солей, включают соляную кислоту, бромистоводородную, иодистоводородную, азотную, серную, фосфорную, гипофосфорную кислоту, и т.п. Также могут применяться соли, происходящие от органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, алифатические одно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые и гидроксиалкановые дикислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты. Таким образом фармацевтически приемлемые соли включают ацетаты, фенилацетаты, трифторацетаты, акрилаты, аскорбаты, бензоаты, хлорбензоаты, динитробензоаты, гидроксибензоаты, метоксибензоаты, метилбензоаты, о-ацетоксибензоаты, нафталин-2-бензоаты, бромиды, изобутираты, фенилбутираты, --гидроксибутираты, бутин-1,4-диоаты, гексин-1,4-диоаты, капраты, каприлаты, хлориды, циннаматы, цитраты, формиаты, фумараты, гликоляты, гептаноаты, гиппураты, лактаты, малеаты, малаты, гидроксималеаты, малонаты, манделаты, мезилаты, никотинаты, изоникотинаты, нитраты, оксалаты, фталаты, терефталаты, фосфаты, моногидрофосфаты, дигидрофосфаты, метафосфаты, пирофосфаты, пропиолаты, пропионаты, фенилпропионаты, салицилаты, себацаты, сукцинаты, субераты, сульфаты, бисульфаты, пиросульфаты, сульфиты, бисульфиты, сульфонаты, бензолсульфонаты, п-бромфенилсульфонаты, хлорбензолсульфонаты, этансульфонаты, 2-гидроксиэтансульфонаты, метансульфонаты, нафталин-1-сульфонаты, нафталин-2-сульфонаты, п-толуолсульфонаты, ксилолсульфонаты, тартраты и т.п. Предпочтительной солью является хлористоводородная соль.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот, как правило, получают взаимодействием соединения формулы I с эквимолярным или избыточным количеством кислоты. Реагенты обычно соединяют в совместном растворителе, таком как диэтиловый эфир или бензол. Соль обычно выпадает из раствора в течение от одного часа и до 10 дней, и может быть отделена фильтрацией, или растворитель может быть удален обычными способами.

Основания, обычно применяемые для образования солей, включают гидроксид аммония и гидроксиды щелочных и щелочноземельных металлов, карбонаты, а также алифатические и первичные, вторичные и третичные амины, алифатические диамины. Основания, особенно пригодные для получения солей присоединения оснований, включают гидроксид аммония, карбонат калия, метиламин, диэтиламин, этилендиамин и циклогексиламин.

Фармацевтически приемлемые соли, как правило, имеют повышенную растворимость, по сравнению с соединением, из которого их получают, и, таким образом, часто больше подходят для формулировок в виде жидкостей или эмульсий.

Фармацевтические составы могут быть получены приемами, известными в технике. Например, соединения могут быть составлены в препараты с обычными наполнителями, разбавителями или носителями, и сформованы в таблетки, капсулы, суспензии, порошки и т.п. Примеры наполнителей, разбавителей и носителей, которые являются подходящими для таких препаратов, включают следующие материалы: наполнители и сухие разбавители, такие как крахмал, сахара, маннит и кремнийсодержащие производные; связующие агенты, такие как карбоксиметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, альгинаты, желатин и поливинилпирролидон; увлажняющие агенты, такие как глицерин; дезинтегрирующие средства, такие как карбонат кальция и бикарбонат натрия; агенты для замедления растворения, такие как парафин; ускорители ресорбции, такие как соединения четвертичного аммония; поверхностно-активные вещества, такие как цетиловый спирт, моностеарат глицерина; адсорбирующие носители, такие как каолин и бентонит; и смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция и магния и твердые полиэтиленгликоли. Соединения могут быть также сформулированы в виде эликсиров или растворов для обычного перорального введения, или в виде растворов, подходящих для парентерального введения, например, внутримышечным, подкожным или внутривенным путем. Кроме того, соединения хорошо подходят для препаратов в виде дозировочных форм с замедленным высвобождением лекарственного средства и т.п. Препараты могут быть также составлены таким образом, что они могут высвобождать активный ингредиент только, или предпочтительно, в определенной части желудочно-кишечного тракта, возможно, в течение некоторого времени. Покрытия, оболочки и защитные основы могут быть изготовлены, например, из полимерных веществ или восков.

Конкретная дозировка соединения формулы I, требуемая для ингибирования тромботического осложнения или случая, или увеличения скорости активации протеина С, в соответствии с настоящим изобретением, будет зависеть от серьезности и природы состояния, способа введения и прочих факторов, которые будут определяться лечащим врачом. Как правило, принятые и эффективные ежедневные дозы будут составлять от 0,1 до 1000 мг/день, и более типично от 50 до 200 мг/день. Такие дозы будут вводиться субъекту, нуждающемуся в лечении, от одного до трех раз в день, или чаще, если это требуется, чтобы увеличить активацию протеина С или ингибировать тромботические расстройства.

Обычно предпочтительно вводить соединение формулы I в форме соли присоединения кислоты, что является обычным при введении фармацевтических препаратов, несущих такую основную группу, как пиперидиновое кольцо. Также выгодно вводить такое соединение пероральным путем. Для таких целей подходят лекарственные формы для перорального введения, перечисленные ниже.

Рецептура В рецептурах, о которых идет речь далее, "активный ингредиент" означает соединение формулы I.

Рецептура 1. Желатиновые капсулы Готовят твердые желатиновые капсулы, используя перечисленные далее ингредиенты, мг/капсулу: Активный ингредиент - 0,1-1000 Крахмал, NF - 0-650
Крахмал, текучий порошок - 0-650
Силиконовая жидкость, 350 сСт - 0-15
Ингредиенты смешивают, пропускают через сито 45 меш (США) и заполняют твердые желатиновые капсулы.

Примеры конкретных рецептур в виде капсул с ралоксифеном включают перечисленные ниже.

Рецептура 2. Капсула с ралоксифеном, мг/капсулу:
Ралоксифен - 1
Крахмал, NF - 112
Крахмал, текучий порошок - 225,3
Силиконовая жидкость, 350 сСт - 1,7
Рецептура 3. Капсула с ралоксифеном, мг/капсулу:
Ралоксифен - 5
Крахмал, NF - 108
Крахмал, текучий порошок - 225,3
Силиконовая жидкость, 350 сСт - 1,7
Рецептура 4. Капсула с ралоксифеном, мг/капсулу:
Ралоксифен - 10
Крахмал, NF - 103
Крахмал, текучий порошок - 225,3
Силиконовая жидкость, 350 сСт - 1,7
Рецептура 5. Капсула с ралоксифеном, мг/капсулу:
Ралоксифен - 50
Крахмал, NF - 150
Крахмал, текучий порошок - 397
Силиконовая жидкость, 350 сСт - 3,0
Конкретные, приведенные выше формулировки могут быть изменены в разумных пределах.

Формулировку в виде таблеток готовят, используя перечисленные ниже ингредиенты.

Рецептура 6. Таблетки, мг/таблетку:
Активный ингредиент - 0,1-1000
Макрокристаллическая целлюлоза - 0-650
Высокодисперсный диоксид кремния - 0-650
Стеариновая кислота - 0-15
Компоненты смешивают и прессуют для получения таблеток. С другой стороны, таблетки, каждая из которых содержит 0,1-1000 мг активного ингредиента, готовят следующим образом.

Рецептура 7. Таблетки, мг/таблетку:
Активный ингредиент - 0,1-1000,0
Крахмал - 45
Микрокристаллическая целлюлоза - 4
Поливинилпирролидон (в виде 10%-ного раствора в воде) - 4
Натрийкарбоксиметилцеллюлоза - 4,5
Стеарат магния - 0,5
Тальк - 1
Активный ингредиент, крахмал и целлюлозу пропускают через сито 45 меш (США) и тщательно смешивают. Раствор поливинилпирролидона смешивают с полученными в результате порошками, которые затем пропускают через сито 14 меш (США). Полученные таким образом гранулы сушат при 50-60^oС, и пропускают через сито 18 меш (США). Затем к гранулам добавляют натрийкарбоксиметилкрахмал, стеарат магния и тальк, предварительно просеянные через сито 60 меш (США), и после перемешивания, прессуют на таблетировочной машине и получают таблетки.

Суспензии, содержащие 0,1-1000,0 мг активного ингредиента в 5-мл дозе, готовят следующим образом.

Рецептура 8. Суспензии, мг/5 мл:
Активный ингредиент - 0,1-1000,0
Натрийкарбоксиметилцеллюлоза - 50
Сироп - 1,25
Раствор бензойной кислоты, мл - 0,10
Отдушка - g.v.

Краситель - g.v.

Очищенная вода - До 5 мл
Активный ингредиент просеивают через сито 45 меш (США) и смешивают с натрийкарбоксиметилцеллюлозой и сиропом, получают однородную пасту. Раствор бензойной кислоты, отдушку и краситель разбавляют некоторым количеством воды и добавляют в пасту при перемешивании. Затем добавляют воду в количестве, достаточном для получения требуемого объема.

Другие варианты осуществления изобретения относятся к лечению у человека или животного состояния, когда требуется ингибирование тромботического нарушения. Тромботические нарушения или случаи, и тромбоэмболические заболевания, включают широкое разнообразие приобретенных болезненных состояний, в том числе внутрисосудистую коагуляцию, включая глубокий тромбофлебит, эмболию легких, сердечную ишемию, инфаркт миокарда, церебральный тромбоз, неспецифические состояния, состояния с местной гиперкоагуляцией и распространенные повреждения ткани, относящиеся к воспалительным процессам, капиллярный артериальный тромбоз, периферический артериальный тромбоз, эмболию, исходящую из сердечной или периферических артерий, острый инфаркт миокарда, Тромботические удары и рассеянную внутрисосудистую коагуляцию. Рассеянная внутрисосудистая коагуляция имеет место, как осложнение, при многих болезненных состояниях, включая обширную травму, обширное оперативное вмешательство, тепловой удар, септицемию, острые и хронические заболевания печени, злокачественные заболевания, включая твердые опухоли, лейкозы и лимфомы, широкое разнообразие бактериальных, грибковых, паразитарных и вирусных инфекционных болезней, акушерские осложнения, гемолитические процессы, кардиогенный шок, любой случай сердечно-сосудистой недостаточности, тяжелые прогрессирующие удары, укусы змей, коллагеновые васкулярные нарушения, молниеносную пурпуру, острый панкреатит, аллергический васкулит, polycythemia vera, тромбоцитемию и неспецифический язвенный колит, среди прочих. Хотя еще не раскрыто, врожденная недостаточность в экспрессии тромбомодулина может быть продемонстрирована у пациентов с тромбоэмболическими проблемами. Обострения у таких пациентов будут поддаваться лечению соединениями формулы I.

Полагают, что соединения формулы I также пригодны для лечения тромболитических ударов. Уровень тромбомодулина в сосудах мозга является низким, таким образом повышение его будет важным при тромботическом ударе. На сегодняшний день удары, как правило, обычными антикоагулянтами на лечатся. Лечение ударов либо гепарином, либо пероральным антикоагулянтом хотя подчас успешно, несет высокий риск кровотечения в области поврежденного мозга, причем посредством этого сопровождает удар ухудшение неврологического состояния.

Кроме того, полагают, что соединения настоящего изобретения пригодны для лечения острого инфаркта миокарда, поскольку очевидно, что основной предложенный механизм действия тромбомодулина и производных, т.е., антикоагуляция через активацию протеина С, составляет высокоэффективный способ достижения антитромботических эффектов на артериальной стороне циркуляции, так же, как и уменьшения реперфузионного повреждения. В ходе испытаний с тромболитическими средствами при остром инфаркте миокарда и из экспериментов на животных станет ясно, что гепарин, как вспомогательное лечебное средство, является относительно неэффективным в качестве антитромботического средства на артериальной стороне циркуляции.

Также предполагается, что соединения настоящего изобретения пригодны для лечения рассеянной внутрисосудистой коагуляции ("DIC"). Существуют экспериментальные данные, что посредники при воспалении, такие как IL-1, TNF и LPS-эндотоксин, резко снижают экспрессию тромбомодулина на эндотелиальных клетках, что, в свою очередь, ведет к недостаточной активации протеина С в антикоагуляционном каскаде. Гепарин и другие пероральные антикоагулянты давались пациентам с рассеянной внутрисосудистой коагуляцией в расширенных клинических испытаниях, но результаты этих испытаний разочаровывают. Характерно, что у пациента с рассеянной внутрисосудистой коагуляцией тромбы широко распространены, включая капиллярное кровообращение, с сопутствующими, зачастую серьезными проблемами кровотечения, которые являются результатом "расходования" важных факторов свертывания, которые сначала активируются, а затем инактивируются в ходе образования широко распространенных микроциркуляторных фибриновых тромбов.

Поскольку тромбомодулин падает с помощью различных посредников воспаления, предпочтительное применение соединений состоит в регулировании воспалительных состояний, связанных с капиллярным тромбозом. В широком смысле, это будет включать любое состояние, отмечаемое дисфункцией сосудистого эндотелия, как это происходит при сепсисе, повреждениях, включающих обширное повреждение ткани, и травмах, синдроме системного воспалительного отклика, синдроме сепсиса, септическом шоке и синдроме нарушения функций многих органов, включая DIC.

Существуют данные, что обычные антикоагулирующие лекарственные препараты, в частности, варфарин, пригодны для лечения инвазивных злокачественных опухолей. Многие опухолевые клетки продуцируют вещества, которые вызывают активацию системы коагуляции, давая в результате локальные отложения фибрина. Эти фибринные отложения функционируют как "гнезда", в которых раковые клетки могут делиться, образуя метастатические повреждения. В одном клиническом исследовании показано, что пациенты, получающие варфарин в дополнение к противораковой химиотерапии при лечении мелкоклеточного рака легких, живут дольше и имеют менее обширные метастатические повреждения, чем пациенты, получающие одну химиотерапию. Однако раковая химиотерапия, использованная при этом исследовании, была менее интенсивной, чем та, которая на сегодняшний день считается оптимальной в клинической онкологии. Более интенсивные формы раковой химиотерапии почти всегда дают резкое ухудшение количества тромбоцитов, и тромбоцитопения, в сочетании с лечением варфарином, несет пациенту неприемлемо высокий риск серьезных осложнений в виде кровотечений.

Ожидается, что соединения являются полезными при других заболеваниях, когда свертывание крови может стать основным делающим свой вклад процессом или источником вторичной патологии, при таких, как рак, включая метастазы, воспалительные заболевания, включая артрит, и диабет. Антикоагулирующее соединение вводят перорально, парентерально, например, внутривенными вливаниями (iv), внутримышечной инъекцией (im) или подкожно (sc).

Способ настоящего изобретения на практике применяют также вместе с растворяющим тромб средством, например, с тканевым плазменным активатором (tPA), модифицированным tPA, стрептокиназой или урокиназой, чтобы уменьшить реперфузионные повреждения. В случаях, когда происходит образование сгустков и блокируется артерия или вена (либо частично, либо полностью), обычно используют растворяющее тромб средство. Соединение изобретения может быть введено прежде или одновременно с растворяющим средством, или после его применения, одно или вместе с растворяющим средством и, кроме того, предпочтительно его вводят вместе с аспирином, чтобы предотвратить возобновление образования тромбов.

Способ настоящего изобретения на практике применяют также в сочетании с антагонистом тромбоцитного гликопротеинового IIb-IIIа-рецептора, что ингибирует агрегацию тромбоцитов. Соединение изобретения может быть введено раньше или вместе с антагонистом IIb-IIIa-рецептора или после его применения, чтобы предотвратить появление или возобновление тромбообразования.

Способ настоящего изобретения также применяют на практике в сочетании с аспирином. Соединение изобретения может быть введено раньше или вместе с аспирином, или после его применения, чтобы предупредить появление или возобновление тромбообразования. Как указывалось выше, соединение настоящего изобретения предпочтительно вводить в сочетании с растворяющим тромб средством и с аспирином.

Испытания
Испытание 1
Для дальнейшего понимания действия (действий) соединений формулы I на внутреннюю оболочку клетки гладких мышц и их роли в усилении антикоагуляции крови необходимо исследовать изменения активности тромбомодулина ТМ на поверхности такого типа клеток. Соединения формулы I также могут быть использованы для реверсии, исправления любых влияний посредников, которые ведут к падению активности ТМ на поверхности ТМ таких клеток.

Приблизительно 40000-80000 ранее пассированных эндотедиальных (артериальных, венозных или капиллярных) клеток, или клеток интимальных гладких мышц, высеивают и выращивают до слияния на культуральных планшетах с 24 ячейками. Клеточный монослой затем промывают 2-3 раза либо буферным соляным раствором Хэнкса (HBSS), либо бессывороточной средой (SFM). Через 24 часа к клеткам добавляют в трех параллельных случаях различные концентрации соединения формулы I (в интервале от микромолярной до субпикомолярной). Клетки в контрольных ячейках (отрицательный контроль) выдерживают в бессывороточной среде с количеством носителя, эквивалентным во всех ячейках.

Измерение активности ТМ на поверхности клеток выполняют, используя двустадийное амидолитическое испытание (two-phase amidolitic assay). Во время первой стадии испытания вслед за ополаскиванием клеток HBSS или SFM, к монослою добавляют 0,4 мл SFM, содержащего человеческий протеин С (конечная концентрация 11,2 мкг/мл), альфа-тромбин (конечная концентрация 0,1 NIHU/мл), и инкубируют при 37^oС и 5% СО₂. Через 15, 30 и 45 минут из каждой ячейки отбирают 100 мкл среды и вводят в ячейки микротитратора с 50 мкл избыточного гирудина (20 антитромбиновых ед-ц на мл) на 5 минут при 37^oС, чтобы остановить дальнейшее действие тромбина. В качестве негативного контроля в отсутствии клеток используют SFM с протеином С и альфа-тромбином, как описано выше, и обрабатывают подобным образом.

На второй стадии испытания 50 мкл 3 мМ 2366, хромогенного субстрата протеина С, добавляют к смесям кондиционированных сред с гирудином, и с помощью автоматического считывающего устройства измеряют оптическую плотность при 405 нм (OD₄₀₅), чтобы проверить кинетику активности ТМ в течение 4 минут. После завершения этого кинетического испытания проводят измерение общего количества протеина, используя метод ВСА. Конечную активность ТМ выражают как % увеличения (см. таблицу). Соединение А представляет собой соединение формулы I, в котором R¹ и R³ являются водородом, R² представляет собой 1-пирролидиногруппу.

Испытание 2
Чтобы показать действие соединений формулы I в качестве антитромботиков и их способность корректировать эндотелиальную дисфункцию, индуцированную воспалением, используют павиановую модель сепсиса, индуцированного E.coli, описанную в патенте США 5009889 (включенном в настоящее изобретение в качестве ссылки).

Полезность соединений изобретения иллюстрируется положительным влиянием на тромботические нарушения или характеристики скорости активации протеина С, которое обнаруживается в упомянутых выше испытаниях.

Формула изобретения

1. Применение соединения формулы I

в которой R¹ и R³ независимо - водород, -СН₃,

где Ar - необязательно замещенный фенил;
R² выбирают из группы, состоящей из пирролидино-гексаметилимино и пиперидиногрупп,
или его фармацевтически приемлемой соли в качестве средства для ингибирования тромботического расстройства или тромбоза.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой гидрохлорид.

3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное введение является профилактическим.

4. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой

или его гидрохлорид.

5. Применение соединения формулы I

в которой R¹ и R³ независимо - водород, -СН₃ ,

где Аr - необязательно замещенный фенил;
R² выбирают из группы, состоящей из пирролидино-гексаметилимино и пиперидиногруппы,
или его фармацевтически приемлемой соли в качестве средства для увеличения активации протеина С.

6. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой гидрохлорид.

7. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанное введение является профилактическим.

8. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой

или его гидрохлорид.

РИСУНКИ

Рисунок 1