Способ получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью

 

Изобрение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам иммобилизации микробных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью , и может быть использовано в пищевой промышленности при производстве глюкозофруктозного сиропа. Цель изобретения - повышение ферментативной активности и прочности гранул целевого продукта. Включение клеток Streptomyces albogriseolus 28- 3 в нерастворимый носитель осуществляют путем смешивания клеточной биомассы с раствором хитозана с рН 4,0-4,5 и затем с водным растворим трехвалентного ацетата кобальта при соотношении компонентов 1:(0,1-0,5):(0,15-1,5) соответственно. Далее проводят гранулирование иммобилизованного препарата путем введения капель полученной смеси в 5-10%-ный водный раствор аммиака. Способ позволяет повысить удельную активность иммобилизованного препарата по сравнению с известным на 15-20%. 2 з.п. ф-лы, 3 табл. со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ts> >s С 12 N 11/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4813977/13 (22) 12.04,90 (46) 07.05.92. Бюл. ¹ 17 (71) Институт элементоорганических соединений им. А,Н.Несмеянова (72) И.А.Ямсков, Е.Н.Ефременко и M.Ñ.Мосичев (53) 577.154 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1634715, . кл. .С 12 N 11/04, 1988, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК, ОБЛАДАЮЩИХ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобрение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам иммобилизации микробных клеток. обладающих глюкозоизомеразной активностью, и может быть использовано в пищевой

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам иммобилизации микробных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, и может быть использовано в пищевой промышленности для получения глюкозоф. руктозного сиропа, Известны способы получения иммобилизованных препаратов глюкозоизомеразы.

Недостатками данных способов являются использование в качестве носителей сырья, в основном, пищевого назначения, сложность получения иммобилизованных препаратов, так как требуется проведение дополнительной обработки сшивающим агентом для обеспечения механической и термической прочности и недостаточно вы» . Ы«1731815 А1 промышленности при производстве глюкозофруктозного сиропа, Цель изобретения— повышение ферментативной активности и прочности гранул целевого продукта. Включение клеток Streptomyces albogriseolus 283 в нерастворимый носитель осуществляют путем смешивания клеточной биомассы с раствором хитозана с рН 4,0 — 4,5 и затем с водным раствором трехвалентного ацетата кобальта при соотношении компонентов

1:(0,1 — 0,5);(0,15 — 1,5) соответственно. Далее проводят гранулирование иммобилизованного препарата путем введения капель полученной смеси в 5 — 10%-ный водный раствор аммиака, Способ позволяет повысить удельную активность иммобилизованного препарата по сравнению с известным на 15 — 20%.

2 з.п, ф-лы, 3 табл.

1 сокая активность получаемых биокатализаторов. ()

i00

Ql

Известен способ иммобилизации клеток Streptomyces albogriseolus 28-3, обладающих глюкозоизомеразной активностью, в гель гидроокиси кобальта (И), для чего их суспендируют в водном растворе ацетата кобальта при массовом соотношении сухих клеток и соли кобальта 1:(0,1 — 10,0). Далее по каплям приливали концентрированный раствор аммиака до рН 6,5-10,0. Полученный осадок отфильтровывали, промывали водой и фосфатным буфером (рН 7,0). высушивали и измельчали. Готовый иммобилизованный препарат имел активность 133 ед/г влажного препарата, Недостатком этого способа является то, что конечный продукт имеет вид порошка, а

1731815

55 применение биокатализатора в таком виде в промышленных условиях невозможно.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения биокатализатора на основе

Streptomyces albogriseoIus 28-3, согласно которому биомассу предварительно суспендируют в растворе ацетата магния, Суспензию смешивают с хитозаном, растворенным в водном растворе ацетата кобальта (II), проводят гранулирование геля введением полученной смеси в 8%-ный водный раствор аммиака, при этом конечные концентрации компонентов в препарате составляют, масс.%: биомасса клеток (по сухой массе) 3,0 — 10,0; ацетат кобальта (II)

7,0-15,0; хитозан 1,0-4,0.

Недостаток этого способа иммобилизации заключается в том, что при использовании полученного препарата в колонном реакторе для процесса изомеризации глюкозного сиропа. который протекает при температуре 60 С, наблюдается интенсивное г+ вымывание ионов Со из биокатализатора.

Вследствие этого происходит загрязнение конечного продукта — гл юкозофруктозного сиропа ионами кобальта, его окрашивание в розовый цвет, что по требованию к пищевым продуктам совершенно недопустимо, Проведение дополнительной очистки глюкозофруктозного сиропа до содержания допустимых концентраций кобальта сопряжено с усложнением процесса.

Целью изобретения является повышение ферментативной активности и прочности гранул целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, проводят включение клеточной биомассы в нерастворимый носитель. Для этого клетки Streptomyces

albogriseolus 28 — 3 смешивают с раствором хитозана (рН 4,0 — 4,5), добавляют в эту смесь водный раствор соли кобальта (! Ii) и проводят гранулирование препарата путем закапывания в 5 — 10 -ный водный раствор аммиака, При этом исходное соотношение компонентов, взятых для получения препарата (в расчете на сухие вещества) должно быть следующим: клеточная биомасса:хитозан:ацетат кобальта (III) как 1:(0,1 — 0,5);(0,15 — 1,5).

Выбор 5 — 10 -ных растворов аммиака в качестве осадителя обусловлен тем, что именно в растворе аммиака (а не какого-то другого щелочного раствора) такой концентрации (5 — 10%) происходит формирование гранул биокатализатора с необходимой механической прочностью. При проведении стадии гранулирования в растворе аммиака

45 происходит процесс включения клеток в двойной гель: в гель хитозана, который изменяет свою растворимость при щелочном рН, и в гель гидроокиси кобальта (III).

Снижение концентрации аммиака ведет к снижению механической прочности образующихся гранул и удлинению процесса их формирования, Увеличение концентрации аммиака выше указанных значений также приводит к снижению механической прочности из-за черезмерно быстрого формирования геля.

Приготовление ацетата кобальта (! I!) проводилось на основе водных растворов ацетата кобальта (II) при окислении их с помощью 3 -ного раствора перекиси водорода, Использование более концентрированных растворов перекиси водорода приводит к частичной инактивации фермента.

Пример 1. 12 г влажных клеток (влажность 90 0) актиномицетов

Streptomyces albogriseolus 28 — 3, полученных после центрифугирования культуральной жидкости и обладающих активностью

48 ед./г, смешивают с 4 мл 3 -ного раствора хитозана (рН 4,3 доводится 5 -ным раствором уксусной кислоты), добавляется 4 мл и редва рител ьно п ри готовлен ного 15 / -ного раствора ацетата кобальта (III). Соотношение компонентов, взятых для получения препарата (в расчете на сухие вещества) следующее: клеточная биомасса:хитозан;ацетат кобальта (III) — 1:0,1:0,5. Полученную смесь закапывают в 8О/-ныи водный раствор аммиака с целью получения прочного гранулированного катализатора. Активность влажного иммобилизованного препарата 190,4 ед,/г, За единицу активности глюкозоизомеразы принимали количество фермента, катализирующее изомеризацию одного микромоля глюкозы во фруктозу при рН 7,0 и температуре 60 С за 1 мин. В качестве субстрата использовали 2 М раствор глюког+ зы с добавлением 10 з M ионов Mg

Глюкозоизомеразная активность препарата, полученного по прототипу, составляет 175 ед,/г влажного препарата и принята за 100%.

Остальные примеры иммобилизации клеток, характеризующие данный способ, проводят аналогично примеру 1, изменяя лишь соотношение исходных компонентов-, концентрацию осаждающего раствора аммиака и рН раствора хитозана, Их результаты представлены в табл. 1, Результаты иммобилизации клеток дан ы в табл. 2.

1731815

Таблица 1

Кол ичестрН раствора хитозана

Соотношение компонентов (в пересчете на сухие вещества

Концентрация водного раствора, аммиака, о(Хитозан, мл, концентрации (%) Ацетат кобальта (! I!), мл, концентрации (%) Активность влажного препарата. ед/г во клеточной биомассы, г

Пример

4 (3%)

5 (6%)

5 (1о/)

4 (15%)

2 (4,5%)

5 3

4 (15%)

4 (3%)

4(5

6(1:0,1:0,5

1:0,5:0,2

4,3

4.2

3,8

3,8

4,0

4,5

190,4

12

Результаты термомеханических исследований иммобилизованных препаратов даны в табл. 3, Гранулы биокатализатора, полученные по известному и предлагаемому способам, были. подвергнуты термомеханическим исследованиям, С этой целью было проведено изучение зависимости величины относительной деформации гранул биокатализатора от температуры с помощью термомеханического метода (при использовании нагрузки 100 г).

На прочность были испытаны образцы катализаторов, полученные сразу после иммобилизации по двум сравниваемым способам, а затем те же самые образцы, но уже после их термостатирования при 60 С в 0,01

М Na-малеатном буфере (рН 6,8) — традиционные условия исследования стабильности препаратов с глюкозоизомеразной активностью — на протяжении 15 сут, (табл. 3).

При температуре 60 С (оптимал ьн ые условия проведения процесса изомеризации) исходно лучшими прочностными характеристиками обладает препарат на основе хитозана и гидроокиси кобальта (III) (предлагаемый вариант). Остаточная деформация такого образца на 16% меньше (при

60 С) той, которую имеет препарат, полученный по известному способу. Более того, механические свойства катализатора, полученные по известному способу, претерпевают изменения в сторону ухудшения в результате его испытания в водной среде при 60 С вследствие сильной набухаемости гелевых гранул. Одновременно с этим из носителя происходит частичное вымывание ионов Со . Подобное явление отсутствует в препарате, полученном согласно предлагаемому способу, В результате прочностные характеристики биокатализатора (относи20

40 тельная деформация образца 28%) в 2 раза превосходят те же параметры для известного препарата (относительная деформация

53%).

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить удельную активность иммобилизоBGHHolo препарата на 15 — 20%, а также получить целевой продукт с улучшенными механическими свойствами, Реактивы, .используемые в иммобилизации, дешевы и доступны. Для реализации способа не требуется использования сложного или нестандартного оборудования.

Формула изобретения

1, Способ получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, включающий приготовление смеси биомассы

Streptomyces albogriseolus 28-3 с растворами хитозана и ацетата кобальта при рН 4,0—

4,5, формирование гранул геля введением полученной смеси по каплям в водный раствор аммиака, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности и прочности гранул целевого продукта, приготовление смеси осуществляют путем введения биомассы в раствор хитозана, а затем добавляют раствор трехвалентного ацетата кобальта.

2. Способ поп. 1,отл ича ющи йся тем, что компоненты, необходимые для приготовления преперата, берут в следующем соотношении по сухим веществам: клеточная биомасса:хитозан:ацетат кобальта (III),—

1:(0,1 — 0,5):(О, 15 — 1,5).

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для формирования гранул геля используют 5 — 10%-ный водный раствор аммиака.

Продолжение табл.1

Таблица 2

Таблица 3

Составитель И,Ямское

Редактор Л.Гратилло Техред М.Моргентал Корректор М.Пожо

Заказ 1557 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

ПрМизвдственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101