Способ и устройство для измерения пероксидации липидов в биологических жидкостях и суспензиях тканей
Изобретение относится к способу и устройству для измерения степени пероксидации липидов в биологических жидкостях и суспензиях тканей, в котором специально подготовленные пробы, содержащие липиды, подвергают нагреву для того, чтобы вызвать термохемилюминесцентное свечение, испускаемое пробой и усиливаемое до такой степени, что его можно обнаружить с помощью фотодетектора 18 специального назначения. Измерение света позволяет сделать заключение о содержании пероксидов и в последующем получить точную оценку пероксидации липида. Технический результат - обеспечение простого и чувствительного способа измерения. 2 с. и 8 з.п.ф-лы, 5 ил.
Область техники Настоящее изобретение относится к способам и устройствам для оценки степени пероксидации липидов в биологических жидкостях и, в частности, жидкостях человека. Однако следует понимать, что настоящее изобретение могут применять также для измерения пероксидации липидов других соединений, содержащих липиды.
Предшествующий уровень техники Кислород необходим для многих метаболических реакций поддержания жизни. Воздействуя на ненасыщенные жирные кислоты, активные формы кислорода (свободные радикалы), вообще говоря, производят пероксиды липидов. Оксидацию ненасыщенных жирных кислот получают путем введения молекул кислорода в двойные связи. Во время реакции двойные связи цис-типа преобразуются в сопряженные двойные связи, производя таким образом гидроперекисной тип пероксида липида с сопряженными двойными связями. Когда молекулы кислорода непосредственно вводят в насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты в реакции фотосенсибилизированного окисления, образуются гидропероксиды липидов с- или без сопряженных двойных связей. В реакциях разложения и полимеризации гидроксидов липидов в качестве первичных продуктов окисления производят вторичные оксиды различных типов. Кислород и его активированные промежуточные продукты могут вступать в реакции с компонентами клеток, что приводит к деградации или инактивации молекул. Набор внутриклеточных или внеклеточных условий, который делает возможным химическое или метаболическое образование реактивных разновидностей кислорода, таких как супероксидные радикалы, перекись водорода, пероксиды липидов или родственные формы, называют оксидативным стрессом. Обычно метаболическая деятельность клетки способна контролировать или предотвращать негативные воздействия оксидативного стресса. Восприимчивость к оксидативному стрессу является функцией общего баланса между факторами, вызывающими оксидативный стресс, и теми факторами, которые проявляют антиоксидантные способности. Вызванное свободными радикалами пероксидативное разрушение липидов мембран долго считали критическим инициирующим событием, ведущим к поражению клетки. В присутствии свободного радикала или инициатора свободных радикалов биологические вещества и, особенно, клеточные мембраны, которые содержат относительно большую долю полиненасыщенных липидов, становятся восприимчивыми к окислению. Процесс пероксидации липидов, таким образом, ассоциирован с потерей мембраной полиненасыщенных жирных кислот и формированием гидроксидов, промежуточных соединений свободных радикалов и других вторичных продуктов. Пероксидация важнейших жирных кислот может нарушить тонкую структуру биологических мембран и способна, таким образом, негативно воздействовать на проницаемость и функции мембраны. Процесс пероксидации липидов, если его не прервать, может привести к разрыву клеточных мембран и высвобождению продуктов распада. В результате эти процессы могут вызвать необратимые повреждения клеток и породить и/или усилить патогенез при определенных условиях поражения или болезни. Предотвращение потенциально негативного воздействия кислорода и его реактивных промежуточных продуктов достигают с помощью различных систем антиоксидантной защиты, уже представленных в клетке, или путем их усиления извне с помощью различных форм искусственных антиоксидантов. Следовательно, обеспечение простого, чувствительного и надежного способа изменения степени пероксидации липидов в биологических и, особенно, человеческих жидкостях и тканях может составить важное средство для изучения различных патологий и болезней, например дисбаланс питания, наследственные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, рак, диабет, синдром острой респираторной недостаточности и др. Разложение пероксидов высвобождает энергию в форме хемилюминесценции. Установлено, что имеется корреляция между интенсивностью хемилюминесценции и скоростью разложения перекиси водорода. Хемилюминесценцию можно вызвать нагревом с помощью процесса термохемилюминесценции (сокращенно ТХЛ). Явление ТХЛ в основном вызвано двумя типами основных реакций: I. Температурное разложение диоксатан-циклических пероксидов, как показано ниже:
С=О* - нестабильное карбониловое соединение
ROOo - перокси радикал липида. Оба типа реакций проявляют способность липидных веществ, которые могут присутствовать в биологических жидкостях и тканях, реагировать через цепную реакцию окисления свободного радикала с образованием нестабильных карбониловых продуктов. Низкоинтенсивную хемилюминесценцию, вызванную нестабильностью карбониловых фрагментов различного происхождения, могут обнаруживать как видимый свет в диапазоне 400-600 нм. Большинство обычных методов измерения степени пероксидации липидов, например популярный тест пероксидации липидов ТВА-RS, не основаны на хемилюминесценции. По способу, описанному в патенте США 4900680 (автор Миядзава и др.), пробу, содержащую липиды, подвергают липидной хроматографии для разделения липидов на липидные классы, впоследствии приводят их в соприкосновение с люминесцентными реактивами, что приводит к генерации светового излучения в количестве, соответствующем содержанию гидропероксида липида. Способом, наиболее близким из известных к описываемому в данном изобретении, является способ и устройство для измерения люминесценции биологических жидкостей, описанные в выложенной заявке ФРГ 4421792 (авт. Шницер и др.) и включенные сюда в качестве ссылки. В этом документе описан способ подготовки пробы биологической жидкости, включающий нагревание пробы в условиях вакуума при температуре, которая находится в диапазоне от точки замерзания пробы до температуры, достаточной для возбуждения люминесценции, излучаемой исследуемой жидкостью. К сожалению, известный способ не позволяет измерить интенсивность люминесценции надежным образом и получить стабильную корреляцию между интенсивностью ТХЛ и временем. Причина этого кроется в том факте, что структура замороженной пробы не является непрерывной и содержит пустоты, связанные с эвакуацией жидкой фазы. Другой причиной является относительно медленный нагрев пробы, что не оставляет достаточно времени для измерения ТХЛ. Таким образом, можно заключить, что проблема надежного измерения степени ТХЛ пока не решена. Раскрытие изобретения
Основной задачей настоящего изобретения является предложение способа и устройства для измерения ТХЛ, в которых вышеупомянутые ограничения существенно снижены или преодолены. В частности, основной задачей настоящего изобретения является предложение нового улучшенного способа и устройства для измерения степени пероксидации липидов, позволяющих надежно измерять ТХЛ и устанавливать стабильную корреляцию между интенсивностью ТХЛ и временем. Указанные выше, а также прочие задачи и преимущества настоящего изобретения можно достичь в соответствии с нижеследующей комбинацией его важнейших признаков, описываемых с помощью различных вариантов реализации изобретения. В варианте реализации настоящего изобретения, который относится к способу измерения пероксидации липидов в биологических жидкостях, суспензиях биологических тканей или т.п., в котором пробы указанной жидкости или суспензии нагревают так, чтобы возбудить в ней термохимическую люминесценцию (ТХЛ), и количество упомянутой ТХЛ можно было измерить, упомянутый способ включает такую последовательность операций:
а) помещение пробы указанной жидкости или суспензии в резервуар, имеющий в основном плоское дно,
б) размещение резервуара в камеру испарения и установка его на основание, выполненное в основном из металлического материала,
в) сообщение резервуару возвратно-поступательных движений с целью распределить пробу по дну резервуара в основном гомогенным образом,
г) выгонку пробы, находящейся внутри камеры, при сниженном давлении в течение периода времени, достаточного для удаления жидкой фазы из пробы и формирования на дне резервуара в основном непрерывной пленки, состоящей из сухого твердого остатка,
д) перенос резервуара с остатком в камеру обработки и размещение его на пластине, температура которой достаточна для возбуждения ТХЛ и ее излучения указанным остатком,
е) восприятие указанной ТХЛ и измерение ее интенсивности, например, оптическим фотодетектором в течение времени, достаточного для установления стабильной корреляции между интенсивностью ТХЛ и временем. В соответствии с одним из предпочтительных вариантов реализации изобретения, относящимся к способу, резервуар изготавливают из тонкой металлической фольги в виде сосуда однократного применения, а подставку изготавливают из алюминия. В соответствии с одним из предпочтительных вариантов реализации изобретения, пробе сообщают возвратно-поступательное движение, по меньшей мере, в течение 40 секунд, так чтобы распределить пробу по дну указанного резервуара слоем толщиной 0,3-0,5 мм. В соответствии с одним из предпочтительных вариантов реализации изобретения, операцию испарения проводят при пониженном давлении, не превышающем 2 мбар, в течение периода времени не более 10 минут. В соответствии с одним из предпочтительных вариантов реализации изобретения, до размещения резервуара на пластине ее нагревают до температуры, по меньшей мере, 60oС. В соответствии с одним из предпочтительных вариантов реализации изобретения, относящимся к способу, интенсивность ТХЛ измеряют в диапазоне 400-600 нм в течение, по меньшей мере, 300 секунд. В соответствии с первым предпочтительным вариантом реализации изобретения, относящимся к устройству для измерения пероксидации липидов в биологических жидкостях, суспензиях биологических тканей или т.п., в котором пробу жидкости или суспензии нагревают до возбуждения в ней термохимической люминесценции (ТХЛ), и в которой количество ТХЛ можно измерить, причем устройство содержит:
а) камеру выгонки, снабженную средствами для гомогенного распределения пробы в резервуаре и средствами выгонки, способными удалить жидкую фазу из пробы так, чтобы образовалась тонкая, в целом непрерывная пленка, состоящая из твердого сухого остатка, причем средства для гомогенного распределения включают в себя основание, выполненное предпочтительно из металлического материала, причем основание снабжено выемкой для установки в нее резервуара, а также снабжено средствами приведения в движение для придания возвратно-поступательных движений основанию,
б) камеру нагревания, снабженную пластиной для размещения на ней резервуара, со средствами нагрева для нагревания пластины, а также со средствами для обнаружения и измерения ТХЛ,
в) блок записи данных для визуального представления результатов измерения ТХЛ,
г) блок управления и обработки данных для управления средствами для гомогенного распределения, средствами для приведения в движение, средствами выгонки, средствами нагрева, средствами для обнаружения и измерения ТХЛ и блоком записи данных. В соответствии с одним из предпочтительных вариантов реализации устройства, средства выгонки включают в себя вакуум-насос, способный вырабатывать пониженное давление в камере выгонки. В соответствии с еще одним из предпочтительных вариантов реализации изобретения, основание изготовлено в виде диска из алюминия, причем диск установлен на эластичные трубчатые элементы, соединяющие этот диск с основанием камеры выгонки, а средства приведения в движение включают двигатель, сообщающий возвратно-поступательные движения пластине через кулачковый механизм. В соответствии с еще одним из предпочтительных вариантов реализации устройства, средства нагрева включают в себя транзистор и датчик температуры, а средства для обнаружения и измерения ТХЛ включают в себя электронный умножитель. Настоящее изобретение в составе предпочтительных вариантов его реализации было лишь кратко изложено выше. Для лучшего понимания настоящего изобретения и его преимуществ следует обратиться к нижеследующему описанию вариантов его реализации. Краткое описание чертежей
Фиг. 1а и 1б схематично изображают устройство для измерения степени пероксидации липидов в соответствии с настоящим изобретением и резервуар для размещения пробы биологической жидкости. Фиг. 2а, 2б изображают соответственно продольный разрез и вид сверху с частичным разрезом камеры выгонки. Фиг. 3 - это блок-схема способа измерения степени пероксидации липидов в соответствии с настоящим изобретением. Фиг. 4 - график корреляции между интенсивностью ТХЛ и временем, полученный способами предыдущего уровня техники. Фиг. 5а и 5б изображают две кривые, выражающие корреляцию между интенсивностью ТХЛ и временем, установленные по методу, соответствующему настоящему изобретению. Подробное описание предпочтительных вариантов реализации изобретении
На фиг.1а изображено устройство для измерения ТХЛ в соответствии с настоящим изобретением, которое включает в себя блок 1 подготовки пробы и измерительный блок 2. Как показано на фиг.1б, небольшое количество, обычно 150 мл, пробы биологической жидкости, подлежащей испытанию на степень пероксидации липидов, помещают в резервуар 3, предпочтительно изготовленный в форме кюветы однократного применения, дно которой преимущественно плоское диаметром 5 см. Вышеописанную кювету, которая содержит жидкую пробу, помещают в блок подготовки пробы, изготовленный в виде цилиндрической камеры 4 выгонки, которую с помощью кольцевого уплотнения 5 можно плотно закрывать крышкой (не показана) так, чтобы герметично изолировать содержимое камеры от окружающей среды. Внутри камеры имеется двигатель 6, жестко установленный на основании камеры с помощью кронштейна 6'. Энергию на двигатель подают по электрическим проводам, проходящим через отверстие 7 в основании камеры. На оси 8 двигателя устанавливают кулачок 9, жестко прикрепленный к ней с помощью фиксирующего винта 9'. На опорных элементах 10 находится преимущественно плоская пластина 11, на верхней стороне которой имеется углубление 12 для установки туда резервуара 3. Нижняя сторона пластины снабжена круглым отверстием 13, диаметр которого выбирают таким образом, чтобы туда помещался кулачок, вызывая тем самым возвратно-поступательные движения пластины при вращении двигателем кулачка. Опорные элементы 10 выполняются в форме тонких трубок из эластичного материала, чтобы обеспечить плавность хода возвратно-поступательного движения пластины, приводимой в движение кулачком. Резервуар с пробой биологической жидкости помещают в углубление 12 пластины и включают двигатель, чтобы придать возвратно-поступательное движение пластине, тем самым встряхивая пробу. Частоту и длительность встряхивания выбирают такими, чтобы получить в целом равномерное распределение слоя жидкости по дну резервуара. На практике встряхивание производят в течение 40-60 секунд, чтобы получить после встряхивания слой пробы толщиной 0,3-0,5 мм. Указанная экспериментально установленная толщина слоя жидкости пробы очень важна для избежания нежелательного образования пузырьков в жидкости пробы и их воздействия на операцию сушки (выгонкой), которую производят после встряхивания и которая подробнее описана ниже. Если операцию встряхивания провели правильно, то после следующей операции выгонки можно получить сухой остаток (сублимат) в виде тонкой непрерывной пленки, равномерно распределенной по дну резервуара. Процесс сушки (выгонки) проводят внутри камеры выгонки при пониженном давлении, которое создают и поддерживают с помощью вакуум-насоса (не показан), связанного с внутренним объемом камеры через патрубок 14. Кроме того, предусматривают подходящие средства, чувствительные к вакууму, подсоединенные к внутреннему объему камеры через патрубок 15, предназначенные для измерения давления внутри камеры выгонки. Эмпирически обнаружили, что необходим баланс между разумной длительностью процесса сушки, необходимой для установления пониженного давления, и желаемыми свойствами высушенного остатка, позволяющими достоверно измерить ТХЛ. Эти свойства включают количество сухого вещества в тонкой пленке остатка, которое должно быть не менее 99,9% и отсутствие пустот, связанных с наличием пузырьков в жидкости во время выгонки. Эмпирически обнаружили, что наилучшие результаты в смысле продолжительности процесса сушки и достижения свойств высушенной пробы, позволяющих получить наиболее достоверное измерение ТХЛ получают, если камеру вакуумируют в течение 1-3 минут, чтобы снизить давление до величины не более 2 мбар, а если такое давление выдерживают, по меньшей мере, 6-8 минут. С этой целью может с успехом применяться механический насос со скоростью откачивания 20 л/мин и предельным давлением 1

Формула изобретения
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5