Полусинтетические сульфаминогепаросансульфаты, имеющие высокую антиметастатическую активность и пониженный геморрагический риск

 

Изобретение может быть использовано в медицине для лечения раковых больных. Заявлены сульфаминогепаросансульфаты как антиметастатические агенты и фармацевтическая композиция, содержащая их. Новые соединения имеют мол.м. 3200-40000 и соотношение сульфатных групп к карбоксильным 2,2-2,3. Они получены из полисахарида К5 Escherichia coli N-деацетилированием гидразином с последующим N-сульфатированием аддуктом триметиламин/серный ангидрид и затем О-сульфатированием аддуктом пиридин/серный ангидрид при 0^oС в течение 0,25-2 ч. При О-сульфатировании отношение аддукт/полисахарид равно 5 (в эквивалентном соотношении SO₃/OH). Затем продукт N-сульфатируют. Новые соединения обладают антиметастатической активностью, сравнимой с активностью гепарина, но имеют более низкую по сравнению с ним противосвертывающую активность. В связи с этим их применение для лечения метастаз снизит геморрагический риск. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к медицине.

Целью изобретения является применение сульфаминогепаросансульфатов в качестве антиметастатических средств.

Метастазирование - это процесс, включающий отделение раковых клеток от участка первичного рака, их распространение в кровотоке, адгезию к стенкам сосудов, а также миграцию и рост во внесосудистом пространстве. Указанное явление, в частности адгезия к стенкам сосудов, по-видимому, регулируется эндогенным полисахаридом гепарансульфата (HS). Некоторые антикоагулянты, среди которых находился и гепарин (НЕР), структурно аналогичный гепарансульфату, исследовались как потенциальные антиметастатические средства (I. Viodavsky et. al. "Modulation of neovascularization and metastasis by species in heparin", in "Heparin and Related Polysaccharides" (D.A. Lane et al., Eds. ), Plenum Press, New York 1992, 317-327). Среди указанных лекарственных средств гепарин является особенно активным антиметастатиком, однако его высокая противосвертывающая активность подразумевает геморрагический риск, поэтому поиск гепариноподобных веществ, имеющих пониженную противосвертывающую активность, представляет особый интерес (D.J. Tyrrell et al.: "Therapeutic uses of heparin beyond its traditional role as an anticoagulant", TIPS 16, 198- 204, 1995).

Занимаясь данным изобретением, мы обнаружили, что некоторые полусинтетические гепарансульфаты, принадлежащие к классу сульфаминогепаросансульфатов (SAHS) (В. Casu et al.,: "Heparin-like compounds prepared by chemical modification of capsular polysaccharide from E. coli K5", Carbohydr. Res. 263, 271-284 (1994), неожиданно обладают антиметастатической активностью in vivo, сравнимой с активностью гепарина, даже если они имеют противосвертывающую активность in vivo на порядок ниже активности гепарина.

В частности, мы обнаружили, что только сульфаминогепаросансульфаты, получаемые из полисахарида K5 Escherichia coli путем отщепления ацетильного остатка и последующего сульфатирования аддуктом серный ангидрид/триметиламин, проводимого при 0^oC в течение 0,25-2 часов, и соотношении реагент и полисахарид (эквиваленты SO₃/эквиваленты доступных ОН-групп), равном 5 (обозначаемые как SAHS-B), и имеющие молекулярную массу, составляющую 5000-40000, обладают антиметастатической активностью, сравнимой с обычной активностью гепарина, в то время как сульфаминогепаросансульфаты, полученные в других экспериментальных условиях, обладают антиметастатической активностью, заметно более низкой, чем активность гепарина и SAHS-B.

Более того, мы также обнаружили, что фракции SAHS-B, имеющие молекулярную массу ниже 5000, сохраняют существенную антиметастатическую активность (также превышающую активность соответствующих гепаринов, имеющих низкую молекулярную массу).

Поэтому полусинтетические гепаросансульфаты SAHS-B представляются как антиметастатические лекарственные средства с пониженным геморрагическим риском.

С этой целью SAHS-B следует изготавливать в виде приемлемых фармацевтических композиций, используя обычные методы и носители. Такие композиции могут применяться для профилактики или лечения метастазов в дозах, зависящих очевидно от нескольких факторов, но обычно колеблющихся от 1 до 1000 мг SAHS-B от одного до нескольких раз в сутки.

Как описано B.Casu et al., 1994, loc. cit.; PCT/EP94/01660, сульфаминогепаросансульфаты получают из полисахаридов K5, являющихся компонентом клеточной мембраны штамма K5 Escherichia coli. В частности, полисахарид K5 селективно N-деацетилируют (отщепляют ацетильный остаток) и N- сульфатируют, а затем О-сульфатируют, как показано на следующей схеме, получая сульфаминогепаросансульфаты различных видов, такие как SAHS-B, SAHS-C, SAHS-A.

Первая стадия включает N-деацетилирование путем гидразинолиза полисахарида K5 (K5-PS). Полученный продукт (гепаросан, АН) N-сульфатируют аддуктом серный ангидрид/триметиламин (ТМА/SO₃), получая сульфаминогепаросан (SAH). Цифры над стрелками показывают по порядку температуру реакции (^oC), отношение реагента к полисахариду (эквиваленты SO₃/эквиваленты доступных гидроксильных групп) и продолжительность реакции (часы).

Антиметастатическую активность сульфаминогепаросансульфатов, гепарина и других сравнительных полисахаридов определяют, используя метод колонизации в легкое клеток меланомы B16B16 (N. Casella et al., Thromb. Haern. 73, 964 (1995)).

Такой метод, направленный, в частности, на определение эффекта лекарственных препаратов, оказывающих ингибирующее действие на гематическую диссеминацию рака, включает определение количества раковых колоний, образующихся в легких после внутривенной инъекции мышам клеток мышиной меланомы. Используют клетки меланомы B16B16. Клетки культивируют в DME с 10% фетальной бычьей сыворотки в инкубаторе с CO₂ (5%) в условиях влажности и при температуре 37^oC. Клетки разделяют два раза в неделю, обрабатывая их 0,25% трипсином/0,05% этилендиаминтетрауксусной кислотой. Исследуемые полисахариды растворяют в физиологическом растворе или фосфатном (PBS) буфере соответствующим образом и применяют на месте. Клетки меланомы B16B16, разбавленные в PBS (10⁵ клеток/0,1 мл/мышь), вводят в боковую вену хвоста мышей C57B16, имеющих средний вес, равный 20 г, при окончательном объеме, составляющем 0,2 мл/мышь. Мышей умерщвляют через 12-16 дней после введения раковых клеток; легкие удаляют и фиксируют в растворе Buoin для подсчета поверхностных метастатических узелков, которые выглядят как черные образования на желтом поле. Затем определяют отношение легочных узелков в обработанных и контрольных мышах. Каждый эксперимент проводят как минимум на пяти мышах, чаще - на 8-10 мышах. Процентные величины ингибирования метастазов, полученные в нескольких экспериментах, приведены в отдельных примерах и таблице 1.

Пример 1 Получение и антиметастатическая активность сульфаминогепаросансульфатов, типы А, В и С Ниже приводится описание стандартных процедур получения некоторых сульфаминогепаросансульфатов, обладающих различной антиметастатической активностью. Определяют следующие характеристики продуктов: среднюю молекулярную массу (гель- фильтрацией), степень сульфатирования (выражаемую в виде молярного отношения групп сульфатов и карбоксильных групп и определяемую кондуктометрией) и распределение сульфатных групп (определяемое ¹H и ¹³С ЯМР спектрометрией), как описано Casu et al., 1994 (loc. cit.).

Нижеописываемые процедуры применяют к сульфаминогепаросансульфатам, имеющим степень N-сульфатирования около 100% и степень 6-0-сульфатирования, равную по меньшей мере 25%.

Исходный полисахарид K5 может быть получен как описано в заявке на патент Италии M191A000659.

Количества, указанные в скобках, являются показательными.

Ia) N-деацетилирование Полисахарид K5 (100 мг) и гидразин сульфат (138 мг) растворяют в безводном гидразине (1,38 мг) и выдерживают в закрытой трубке в атмосфере азота в течение 5 часов при 96^oC. Раствор высушивают в роторном испарителе, продукт реакции растворяют в дистиллированной воде и pH доводят до 4 37% HCL. pH доводят до 9 NaOH 2N и добавляют 4 объема этанола, насыщенного ацетатом натрия. Полученный осадок фильтруют, растворяют в дистиллированной воде и раствор диализируют против дистиллированной воды в течение 3 дней (3 2 л каждый лень; порог пропускания 14 000 D) и, наконец, лиофилизируют.

Ib N-сульфатирование Полисахарид, полученный как в 1a) (100 мг), растворяют в дистиллированной воде, pH раствора доводят до 9 добавлением твердого бикарбоната натрия и температуру повышают до 55^oC. При этой температуре, не прекращая перемешивание смеси, добавляют 100 мг аддукта, включающего триметиламин/серный ангидрид (TMA/SO₃). Через 4 часа добавляют равные количества аддукта и продолжают реакцию в целом в течение 24 часов. N- сульфатированный полисахарид выделяют, как описано выше.

1c) О-сульфатирование Полисахарид, полученный как в 1b) (100 мг), растворяют в дистиллированной воде (20 мл) и раствор пропускают через колонку Amberlite IR-120 H⁺ при комнатной температуре. Колонку промывают другой 20-мл порцией дистиллированной воды, собирают элюаты и их pH доводят до 5,5 10% трибутиламином в этаноле (вес./об.) (3 мл). Избыточный трибутиламин удаляют диэтиловым эфиром (40 мл) и лиофилизируют.

Полученный таким образом продукт (188,2 мг) растворяют в безводном ДМФА (33 мл), добавляют аддукт пиридина и серного ангидрида (Py/SO₃, количество указано ниже), растворенный в 15 мл безводного диметилформамида, и выдерживают реакционную смесь при температуре и в течение периодов времени, указанных ниже. Для получения различных видов сульфаминогепаросансульфата используют различные температуры реакции, количества серного аддукта и периоды реакции. В частности, сульфаминогепаросансульфат типа А получают при 0^oC, используя 460 мг пиридина/SO₃, в течение 1 часа. Продукт (G1524-3; средняя молекулярная масса 11700; молекулярное соотношение сульфатных карбоксильных групп составляет 1,8) показывает антиметастатическую активность, соответствующую 17,5% ингибирования метастазирования для дозы, равной 0,5 мг/мышь; в этом же тесте сравнительный гепарин показывает 97,5% ингибирования, а гепаран сульфат из свиной поджелудочной железы - 54,8%.

Сульфаминогепаросансульфат типа В получают при 0^oC, используя 765 мг серного аддукта, соответствующее отношению аддукт/полисахарид (в эквивалентном соотношении SO₃/OH), равному 5, в течение 0,25-2 часов (предпочтительно, 1 часа), вновь подвергая продукт повторному N-сульфатированию, как описано в 1b). Типичный конечный продукт (G1669; средняя молекулярная масса 25 700; молярное отношение сульфатных карбоксильных групп составляет 2,2) показывает антиметастатическую активность (доза составляет 0,5 мг/мышь), соответствующую 92,7% ингибирования метастазирования.

Сульфаминогепаросансульфат типа С получают при 25^oC в течение 1 часа, используя 7,650 мг серного аддукта. Продукт (G1524/3; средняя молекулярная масса 10 800; молярное отношение сульфатных карбоксильных групп - 2,8) показывает антиметастатическую активность (доза составляет 0,5 мг/мышь), соответствующую 8,8% метастатического ингибирования.

Пример 2 Антиметастатическая активность сульфаминогепаросансульфата типа В Тесты по антиметастатической активности повторяют для SAHS-B, полученного как описано в примере 1 (продукт G1669), относительно трех доз (0,5, 0,2 и 0,1 мг/мышь). Соответствующее ингибирование метастазов составляет 78,5%, 62,5% и 20,5%; при этих же дозах ингибирование сравнительным гепарином составило 95,5%, 91,3% и 80,3% соответственно.

Пример 3 Антиметастатическая активность сульфаминогепаросансульфата типа В
Тест по антиметастатической активности повторяют для сульфаминогепаросансульфата типа В, полученного, как описано в примере 1 (продукт 1669), относительно дозы, составляющей 0,5 мг/мышь, получая ингибирование, равное 98,5% метастаз. При этой же дозе сравнительный гепарин показывает ингибирование, равное 98,5%, а "сверхсульфатированный" гепарин, имеющий низкую молекулярную массу, - ингибирование, равное 91,0%.

Пример 4
Получение и антиметастатическая активность фракций сульфаминогепаросансульфата типа В, имеющих различную молекулярную массу
Образец сульфаминогепаросансульфата типа В (препарат G 1668, полученный, по существу, как описано в примере 1) фракционируют с помощью гель-хроматографии на Sephadex и выделяют следующие три фракции, характеризуемые аналогичными отношениями сульфатных карбоксильных групп (2,2 - 2,3) и различными молекулярными массами: G1668a (средняя молекулярная масса 38 200), G1668c1 (22 700) и G1668b1 (3 200). Соответствующая антиметастатическая активность (доза 0,5 мг/мышь) оказалась аналогичной для трех фракций (ингибирование - 97-98%), а также аналогичной другому нефракционированному препарату SAHS-B (G1783), полученному как описано в примере 1. В этой же серии экспериментов сравнительный гепарин показывает ингибирование, равное 95-97%.

Пример 5
Антиметастатическая активность SAHS-B с низкой молекулярной массой
Сравнение с другими натуральными и сверхсульфатированными гликозаминогликанами
Оказалось, что антиметастатическая активность фракции G1668b1, имеющей низкую молекулярную массу (получена, как описано в примере 4), соответствует 83,6% метастатического ингибирования. В этом же тесте сравнительный гепарин показывает ингибирование, равное 92,8%, "сверхсульфатированный" гепаран сульфат, имеющий низкую молекулярную массу (ssLMWHS) - 46,4%, а дерматан сульфат 4,6-дисульфатированный (DS₄, 6S) - 65,32%.

Пример 6
Антиметастатическая активность SAHS-B Препарат SAHS-B (продукт G1668, полученный, по существу, как описано в примере 1) показывает антиметастатическую активность (доза 0,5 мг/мышь), соответствующую 98,5% ингибирования метастаз. (В этом же тесте сравнительный гепарин показывает 98,5% ингибирования).

Пример 7
Антиметастатическая активность небольшой дозы фракции SAHS-B с низкой молекулярной массой
Фракция G1668c1, имеющая низкую молекулярную массу, описанная в примере 4, при дозе, равной 0,1 мг/мышь, показывает антиметастатическую активность, соответствующую ингибированию 41,0% метастаз. (При этой же дозе нефракционированный сравнительный гепарин обеспечивает ингибирование, равное 91,1%).

Пример 8
Антиметастатическая активность очень малой дозы фракции SASH-B с низкой молекулярной массой
Фракция G1668c1, имеющая низкую молекулярную массу, описанная в примере 4, при дозе, равной 0,02 мг/мышь, показывает антиметастатическую активность, соответствующую ингибированию 24% метастаз. (При этой же дозе сравнительный гепарин ингибирует 30% метастаз).

Пример 9
Антикоагулирующая активность SAHS-B
Антикоагулирующая активность G1668, определяемая как продолжительность действия величины APTT у мышей (внутривенная инъекция 0,5 мг/мышь; эксперименты с группой, включающей 4 мыши), составляет > 300; 44,4 и 39,9 соответственно, через 1, 2 и 4 часа соответственно после инъекции. Соответствующие величины сравнительного гепарина составляют: > 300; > 300 и 37,6. (Обычная величина контроля -28,5).

Формула изобретения

1. Сульфаминогепаросансульфаты, имеющие молекулярную массу от 3200 до 40000 и отношение сульфатных/карбоксильных групп 2,2-2,3, получаемые из полисахарида К5 Escherichia coli N-деацетилированием гидразином, последующим N-сульфатированием аддуктом триметиламин/серный ангидрид, последующим О-сульфатированием аддуктом пиридин/серный ангидрид при температуре 0^oС в течение от 0,25 до 2 ч и отношении аддукт/полисахарид (в эквивалентном соотношении SO₃/OH), равном 5, и повторным N-сульфатированием как антиметастатические агенты.

2. Фармацевтическая композиция, проявляющая антиметастатическую активность, включающая в качестве активного агента сульфаминогепаросансульфат, имеющий молекулярную массу от 3200 до 40000 и отношение сульфатных/карбоксильных групп 2,2-2,3, получаемые из полисахарида К5 Escherichia coli N-деацетилированием гидразином, последующим N-сульфатированием аддуктом триметиламин/серный ангидрид, последующим О-сульфатированием аддуктом пиридин/серный ангидрид при температуре 0^oС в течение от 0,25 до 2 ч и отношении аддукт/полисахарид (в эквивалентном соотношении SO₃/OH), равном 5, и повторным N сульфатированием.

3. Композиция по п.2, в которой сульфаминогепаросансульфат имеет степень сульфатирования, по существу, равную степени сульфатирования гепарина (молярное отношение сульфатных/карбоксильных групп равно приблизительно 2,2).

РИСУНКИ

Рисунок 1