Средство, усиливающее противовоспалительное действие иммунодепрессанта (варианты), способ усиления противовоспалительного действия иммунодепрессанта, способ лечения воспаления

 

Изобретение может быть использовано в медицине для лечения таких воспалительных процессов, как затянувшееся воспаление (хроническое прогрессирующее воспаление) или воспаление, при котором задействован иммунологический механизм. Средство, усиливающее противовоспалительное действие иммунодепрессанта, представляет собой по меньшей мере один глюкозамингликан из группы, включающей дерматансульфат, гепарин, гепарансульфат, хондроитинсульфат, кератансульфат и их фармацевтически приемлемые соли. Способ усиления противовоспалительного действия иммунодепрессанта заключается в использовании комбинации его с гликозаминогликаном, выбранным из указанной выше группы. Способ лечения воспаления включает введение млекопитающему эффективного количества противовоспалительного средства, содержащего в качестве эффективного ингредиента дерматансульфат или его фармацевтически приемлемую соль, и иммунодепрессанта. Заявлено применение дерматансульфата или его фармацевтически приемлемой соли в качестве средства, усиливающего противовоспалительное действие иммунодепрессанта при получении противовоспалительного средства. Совместное использование указанной группы глюкозаминогликанов и депрессанта существенно улучшает противовоспалительное действие иммунодепрессанта, что позволяет снижать его количество. В результате могут быть ослаблены тяжелые неблагоприятные воздействия иммунодепрессанта. 5 с. и 11 з.п. ф-лы, 3 табл., 10 ил.

Данное изобретение относится к противовоспалительному средству, в частности к противовоспалительному средству против таких воспалительных процессов, как затянувшееся воспаление (хроническое прогрессирующее воспаление) или воспаление, при котором задействован иммунологический механизм.

В частности, данное изобретение относится к потенцирующему веществу иммунодепрессанта, усиливающему его противовоспалительное действие, или к средству, усиливающему противовоспалительный эффект.

Согласно данному изобретению может быть предотвращено или вылечено начало и/или развитие таких заболеваний, как гломерулонефрит, коллагеноз или родственные им заболевания, трудноизлечимый ангиит, иммунологические аномалии, сопровождающиеся воспалением, или аутоиммунные заболевания и т.д.

Предпосылки создания изобретения Воспалительный процесс, при котором задействован иммунологический механизм, к примеру, гломерулонефрит, коллагеноз или родственные ему заболевания, трудноизлечимый ангиит, иммунологические аномалии, сопровождающиеся воспалением, или аутоиммунные заболевания и т.д., хронически прогрессируют, давая повторяющиеся резкие обострения, и без лечения вызывает органические нарушения, приводящие к почечной недостаточности или другие органические нарушения, и ведет, в конечном счете, к смерти.

Предполагается, что большинство таких хронически прогрессирующих воспалений трудноизлечимо, по той причине, что, как считается, они связаны с иммунологическими аномалиями и т.о. сопровождаются непрерывной активацией медиатора воспалительного процесса. Исследованы различные виды терапии, сосредоточенные на этих факторах. Например, в отношении иммунологических аномалий, применяют обычным способом или способом спасающей внутривенной инфузионной терапии (пульсовой терапии) такой иммунодепрессант, как адренокортикостероиды, циклофосфамид, мизорибин, метотрексат или азатиоприн. Однако адренокортикостероид оказывает опасные неблагоприятные воздействия, такие, как подавляющее воздействие на адреналиновую функцию, легкость инфекционного заражения, пептическая язва, гипертензия, остеопороз и т.д. Вдобавок, другие иммунодепрессанты также проявляют чрезвычайно опасные неблагоприятные воздействия, такие как угнетение костного мозга, возникновение желудочно-кишечных расстройств, повреждения печени, интерстициальной пневмонии, почечных нарушений или геморрагического уроцистита и т.д. Кроме того, в связи с тем, что этот вид фармакотерапии не является этиотропной терапией и заключается во введении лекарственного средства в течение длительного периода времени, что приводит к опасным неблагоприятным воздействиям, возникают особенно серьезные проблемы. Кроме того, некоторые из этих заболеваний устойчивы к применению лекарственных средств. При заболеваниях, при которых основные патологические изменения состоят в нефрите или ангиите, могут быть использованы противотромбоцитные средства или антикоагулянты. Однако даже использование такого антикоагулянта, как гепарин или варфарин (торговая марка; общее название, калийварфарин) может сопровождаться в качестве неблагоприятного воздействия кровотечением. Что касается противотромбоцитного средства, считается, что также существует риск кровотечения. Поскольку среди больных коллагенозом много пациентов с пониженным уровнем тромбоцитов, как в случае системной красной волчанки (SLE), либо много пациентов с легочным кровотечением, как в случае синдрома Good pasture, сопровождаемого гломерулонефритом, в указанных выше случаях затруднительно применение противотромбоцитного средства. Далее, хотя недавно сообщалось, что гепарин или гепарин с низким молекулярным весом эффективен для предотвращения нефрита, сопровождаемого SLE (не прошедшая экспертизу патентная заявка Японии 40327/1990, Arthritis Rheum. 33, 1554, 1990), по экспериментальным результатам, полученным заявителями данной заявки, эффект недостаточно достоверен, как описано ниже.

Описание изобретения Воспалительный процесс, при котором задействован иммунологический механизм, такой как гломерулонефрит, коллагеноз или родственные ему заболевания, трудноизлечимый ангиит, иммунологические аномалии, сопровождаемые воспалением или аутоиммунным заболеванием и т.д., включает описанный выше SLE. Принимая во внимание вышеуказанную ситуацию и исследуя действие дерматансульфата или его фармацевтически приемлемой соли на эти воспалительные заболевания, используя MRL (lpr/lpr) мышь (Izui S., et al. Mechanism of genetic control of murine systemic lupus erythematosus., In systemic Lupus Erythematosus, pp. 3-12, Ed. Peter A. Miescher, Springer-Verlag Berlin, 1995) как модель SLE на животных, заявители установили, что соединение не только подавляет воспаление и замедляет развитие заболевания, но также весьма безопасно и может использоваться для длительного применения. Кроме того, действие дерматансульфата исследовали, используя животную модель человеческого рассеянного склероза и крыс с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом в качестве другого примера воспалительного процесса, при котором задействован иммунологический механизм, и нашли его эффективным для этих заболеваний. Найдено, что среди разнообразных видов дерматансульфата конкретный вид дерматансульфата со специфическими физическими свойствами или специфическим происхождением или его фармакологически приемлемая соль сохраняют концентрацию в сыворотке крови в течение длительного времени и являются предпочтительными. Найдено, что для практического применения данного изобретения пригоден дерматансульфат или его фармацевтически приемлемая соль, которые включают 2-9%, желательно 3-8%, Di-OS (HexAl ---> 3GalNAc); с характеристической вязкостью 0,8-2,0 (100 мл/г) и с молекулярным весом 25.000-100.000, предпочтительно 30.000-60.000, который определяли гель-проникающей ЖХВР, и гликозаминогликана с известным молекулярным весом, в качестве стандарта (см. ссылочный пример 1, (1) Определение молекулярного веса, как описано в Biochim. Biophys. Acta, 60-70, 1992); или дерматансульфат, полученный из гребня. Данное изобретение выполнено на основании этих наблюдений.

Цель данного изобретения состоит в получении противовоспалительного средства, оказывающего значительное противовоспалительное действие на воспалительный процесс и использующего дерматансульфат или его соли, особенно эффективные для профилактики или лечения трудноизлечимых воспалений, таких как гломерулонефрит, который является воспалительным процессом, связанным с иммунологическим механизмом, или затянувшегося воспаления, коллагеноза или родственного ему заболевания, трудноизлечимого ангиита, иммунологических аномалий, сопровождающихся воспалением или аутоаллергической (аутоиммунной) болезни. Другая цель настоящего изобретения состоит в получении агента, усиливающего противовоспалительное действие иммунодепрессанта в сочетании с гликозаминогликаном, имеющим сульфатную группу.

Настоящее изобретение относится к противовоспалительному средству, включающему в качестве активного ингредиента дерматансульфат или его фармацевтически приемлемую соль, как указано выше. В частности, данное изобретение относится к противовоспалительному средству, включающему в качестве активного ингредиента дерматансульфат, обладающий противовоспалительным действием на затянувшийся воспалительный процесс или воспалительный процесс с иммунологическим механизмом, такой, как воспаление, связанное с аутоиммунной болезнью. Более конкретно, настоящее изобретение относится к противовоспалительному средству, полезному при воспалении, сопровождающемся рассеянным склерозом, коллагенозом или родственным ему заболеванием, гломерулонефритом, трудноизлечимым ангиитом и тому подобным. Вдобавок, данное изобретение относится к противовоспалительному средству, включающему дерматансульфат со специфическими физическими свойствами или специфического происхождения или его фармацевтически приемлемую соль. Далее, данное изобретение относится к усиливающему действие агенту, который увеличивает противовоспалительный эффект иммунодепрессанта и включает гликозаминогликан, содержащий сульфатную группу или его фармацевтически приемлемую соль, используемые в качестве эффективного ингредиента. Кроме того, данное изобретение относится к агенту, усиливающему противовоспалительное действие иммунодепрессанта, который включает гликозаминогликан, имеющий сульфатную группу, или его фармацевтически приемлемую соль и иммуноподавляющее соединение (иммунодепрессант).

В качестве характерного примера гликозаминогликана, имеющего сульфатную группу, используемого в комбинации с иммунодепрессантом, может служить дерматансульфат, гепарин, гепаринсульфат, хондроитинсульфат и кератансульфат. Среди них предпочтителен дерматансульфат и более желателен, как указано выше, дерматансульфат со специфическими физическими свойствами или специфического происхождения или его фармацевтически приемлемая соль.

Краткое описание рисунков На фигуре 1 представлены результаты анализа концентрации дерматансульфата в крови (остаточный уровень) с течением времени после введения крысам дерматансульфата различного происхождения. На фигуре обозначает дерматансульфат, полученный из гребня, и обозначает дерматансульфат, полученный из бычьей кишки, x обозначает перекрывающиеся и .

На фигуре 2 приведено действие дерматансульфата на свертывание крови мыши в примере 1. На фигуре обозначает введение низкомолекулярного гепарина и обозначает введение дерматансульфата.

На фигуре 3 приведено действие дерматансульфата на уровень в сыворотке компонента сыворотки, отражающего функцию почек мыши в примере 2.

"a" обозначает результаты анализа BUN (азотмочевины в крови), и "b" обозначает результаты анализа креатинина. * в "b" обозначает достоверное отклонение с p<0,05 при исследовании по Bonferroni.

На фигуре 4 представлена микрофотография, показывающая результаты аутопсии почки у мыши, обработанной дерматансульфатом (увеличение: x500, - (bar) составляет 10 мкм).

"a" обозначает нормальную ткань почки, "b" обозначает ткань почки с МС (минимальным изменением), и "c" обозначает ткань почки с DP, соответствующим пролиферативному гломерулонефриту среди диффузного гломерулонефрита, определенным по WHO (ВОЗ) и подпадающим под дисфункцию).

На фигуре 5 приведен уровень аномальных клубочков при введении мыши дерматансульфата в примере 2.

"a" обозначает уровень числа МС (минимально измененных) клубочков от общего числа клубочков, и "b" обозначает уровень числа DP клубочков от общего числа клубочков.

На фигуре 6 приведены гистологические микрофотографии, показывающие почечную артерию, когда мышам введен дерматансульфат в примере 2 (увеличение: x 204, -(bar) составляет 50 мкм).

"a" представляет гистологию нормального контроля, а "b", "c" и "d" представляют гистологию слабого, среднего и тяжелого ангиита, соответственно.

На фигуре 7 приведены результаты анализа фибриногена в крови при введении мышам дерматансульфата в примере 2.

На фигуре 8 приведены воздействия дерматансульфата (25 мг/кг) и каждой дозы эндоксана (торговая марка циклофосфамид), при раздельном введении или совместном введении, на уровень креатинина в сыворотке у мышей в примере 3.

DS обозначает дерматансульфат, и End обозначает эндоксан. * обозначает достоверное отклонение с p<0,05 при исследовании по Bonferroni.

На фигуре 9 приведено воздействие дерматансульфата (25 мг/кг) и каждой дозы эндоксана, при раздельном введении или совместном введении, на вес селезенки у мышей в примере 3.

DS обозначает дерматансульфат, и End обозначает эндоксан.

На фигуре 10 приведено воздействие дерматансульфата (25 мг/кг) и каждой дозы эндоксана, при раздельном введении или совместном введении, на вес мезентериального лимфатического узла у мышей в примере 3.

** обозначает достоверное отклонение с p<0,01 при исследовании по Bonferroni.

Наилучший вариант практического воплощения изобретения Дерматансульфат содержит, в основном, повторяющуюся структуру (Ido-GalNAc) дисахарида, состоящего из N-ацетил-D-галактозамин-4-сульфата и L-идуроновой кислоты и небольшого количества D-глюкуроновой кислоты. Содержание сульфата, положения присоединения сульфатной группы и содержание D-глюкуроновой кислоты в дерматансульфате различаются в зависимости от вида животного, ткани или органа.

Обычно дерматансульфат получают из такого сырья, как слизистая оболочка кишечника, кожа, легкое, почка, печень, поджелудочная железа, артерия, селезенка, головной мозг, вилочковая железа, хрящ или гребень таких животных, как корова, свинья, лошадь, овца, коза, кролик и т.д. или такой птицы, как курица, утка, гусь и т.д.

Хотя в данном изобретении используется дерматансульфат или его фармацевтически приемлемая соль (далее, если не оговорено особо, подразумевается, что "дерматансульфат" включает фармацевтически приемлемую соль), может быть использовано любое уже известное в этой области соединение и его физические свойства и природа не лимитируются.

Характерными примерами могут служить соединения, полученные, например, из органов (кишки, кожи, почки, кровеносного сосуда) животного (млекопитающего и птиц и т.д.), более конкретно, гребешка, бычьей кишки, свиной кишки, свиной кожи, бычьей почки, свиной почки, бычьей аорты, и с физическими свойствами, приведенными, к примеру, в таблице 1 (средний молекулярный вес, характеристическая вязкость, состав дисахарида).

Дерматансульфат с относительно низким молекулярным весом 1.600-10.000 известен (Dol, F. et al. , J. Lab. Clin. Med., 1990, vol. 115, 43-51 или Bianchini, P. et al. Thrombosis and Haemostasis, 1991, vol. 65, 1315, или Barbanti, M. et al. Thrombosis and Haemostasis, 1993, vol. 69, 147-151) и может быть использован в данном изобретении. Состав дисахарида по данному изобретению определяется по составу (%) ненасыщенного дисахарида, полученного известным в этой области способом, по которому дерматансульфат расщепляют с помощью хондроитиназы ABC до ненасыщенного дисахарида и фракционируют продукты расщепления путем ЖХВР, используя ионообменный носитель (см., "2.8 Structure analysis by glycosaminoglycan degrading enzyme in association with HPLC" в Shin-seikagaku-jikken-koza 3, Tou-situ II, p. 49-62 (1991) Tokyo-Kagaku-doujin, особенно, см. ссылочный пример 1). Ненасыщенный дисахарид обычно представлен сигналами, приведенными в таблице 1, а структура изомера, представленная каждым сигналом, демонстрируется следующей формулой [1] и таблицей 2.

Структура, обозначенная аббревиатурным кодом в таблицах 1 и 2, иногда обозначается следующим образом: Di-OS: HexAl ---> 3GalNAc, Di-6S: HexAl ---> 3GalNAc (6S), Di-4S: HexAl ---> 3GalNAc (4S), Di-diS_D: HexA (2S)1 ---> 3GalNAc (6S), Di-diS_E: HexAl ---> 3GalNAc (4,6-diS), Di-diS_H: HexA (2S)1 ---> 3GalNAc (4S), Di-triS: HexA (2S)1 ---> 3GalNAc (4,6-diS).

В приведенной выше формуле HexA обозначает ненасыщенную гексуроновую кислоту и GalNAc обозначает N-ацил-D-галактозамин, а ( ) обозначает положение присоединения и число связей.

Любой из указанных выше дерматансульфатов может использоваться по данному изобретению, но предпочтительно использование дерматансульфата со следующими физическими свойствами и происхождением, характеризующегося большим временем жизни в крови и незначительным неблагоприятным воздействием, таким как кровотечение и т.д.: (1) Содержание Di-OS (HexAl ---> 3GalNAc) составляет 2-9%, предпочтительно 3-8%; (2) с 0,8-2,0 характеристической вязкостью (100 мл/г); (3) с 25.000-100.000, предпочтительно 30.000-60.000, средним молекулярным весом, определяемым гельпроникающей ЖХВР и гликозаминогликана с известным молекулярным весом в качестве стандарта (способ описан в Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992); (4) или дерматансульфат, полученный из гребня. Более желателен дерматансульфат, обладающий четырьмя вышеуказанными свойствами, или эквивалентный ему. Характерным примером такого дерматансульфата служит натриевая соль дерматансульфата (см. таблицу 1), полученная из гребешка по методике, изложенной настоящими заявителями в описании патентной заявки (см. PCT международную публикацию, WO 95/09188) и подтвержденной примерами.

Дерматансульфат, полученный из гребня, и дерматансульфат, полученный из бычьей кишки (см. ссылочный пример 2 в WO 95/09188), вводят в хвостовую вену самцов SD-крыс, измеряют изменения остаточного уровня дерматансульфата в крови с течением времени и рассчитывают уровень его остатка от начального уровня дерматансульфата на момент введения (см. пример 1 в указанной выше международной публикации). На фигуре 1 приведены изменения остаточного уровня с течением времени после введения двух соединений в крови. На фигуре обозначает дерматансульфат, полученный из гребня, и обозначает дерматансульфат, полученный из бычьей кишки. Как следует из приведенных на фигуре 1 результатов, через 5 минут после введения остаточный уровень дерматансульфата, полученного из гребня, вдвое больше, чем соответствующая величина для дерматансульфата, полученного из бычьей кишки, и даже через 120 минут после введения дерматансульфата, полученного из гребня, остается порядка 10%, тогда как дерматансульфат, полученный из бычьей кишки, определяется с трудом. Итак, поскольку дерматансульфат, полученный из гребня, или дерматансульфат с эквивалентными физическими свойствами имеет длительный период жизни в крови и долгое время сохраняет противовоспалительное действие, то для лечения не требуется большая доза, и дерматансульфат, полученный из гребня или эквивалентный ему, наиболее предпочтителен. В качестве противовоспалительного средства по данному изобретению может быть использована фармацевтически приемлемая соль дерматансульфата.

В качестве примера такой соли, но не в порядке ограничения, предпочтительны натриевая, калиевая, литиевая или кальциевая соли, и обычно вводят натриевую соль.

Дерматансульфат обычно вводят внутривенно, но при необходимости, он может быть введен внутриартериально, внутримышечно или чрескожно. Содержащие его глазные капли могут быть получены в комбинации с соответствующим приемлемым вспомогательным ингредиентом и использованы для закапывания. Его мази или кремы также могут быть получены в комбинации с приемлемой основой и нанесены на кожу или слизистую оболочку. Кроме того, пероральное лекарственное средство также может быть получено разработкой дозированных форм.

С целью получения противовоспалительного средства или средства, усиливающего противовоспалительный эффект, или фармацевтического препарата по данному изобретению, можно соответственно использовать дерматансульфат или содержащий сульфатную группу гликозаминогликан и/или иммуноподавляющее соединение (иммунодепрессант) с такими вспомогательными ингредиентами, как обычный стабилизатор, эмульгатор, изотоническое средство и/или агент, создающий определенный pH, приемлемыми для медицины.

Доза дерматансульфата или его фармацевтически приемлемой соли для взрослого человека в день составляет 50-3.000 мг. Введение может быть одноразовым или дробным, за 2 или более раз, или в виде непрерывного внутривенного вливания в течение нескольких дней.

Кроме того, содержащий сульфатную группу гликозаминогликан в сочетании с иммунодепрессантом может существенно улучшать противовоспалительное действие иммунодепрессанта и снижать количество иммунодепрессанта. В результате тяжелые неблагоприятные воздействия иммунодепрессанта, вызванные его введением, могут быть ослаблены. Таким образом, фармацевтические средства, включающие в качестве эффективного ингредиента содержащий сульфатную группу гликозаминогликан, могут усиливать противовоспалительное действие иммунодепрессанта и использоваться как средства, повышающие противовоспалительное действие иммунодепрессанта и снижающие его дозу, как средства, снижающие нежелательные воздействия иммунодепрессанта, или в комбинации с иммунодепрессантом как средства, повышающие противовоспалительное действие и снижающие нежелательные эффекты указанного иммунодепрессанта. В качестве содержащего сульфатную группу гликозаминогликана, используемого в комбинации с иммунодепрессантом, предпочтительно использование дерматансульфата, особенно дерматансульфата с указанными выше физическими свойствами и указанного происхождения или его фармацевтически приемлемой соли.

Когда содержащий сульфатную группу гликозаминогликан и иммунодепрессант вводят одному и тому же индивидууму (пациенту), нет необходимости в ограничивающем объединенном способе воздействия (определенное время введения и способа введения), при этом фармацевтические средства, включающие единственный эффективный компонент, могут быть получены независимо, и фармацевтическое средство, включающее содержащий сульфатную группу гликозаминогликан, может быть введено до или после введения иммунодепрессанта, или же может также быть получена и введена фармацевтическая композиция, содержащая оба компонента. Более конкретно, содержащий сульфатную группу гликозаминогликан или его фармацевтически приемлемая соль могут быть приготовлены в форме инфузии, а иммунодепрессант может быть получен в форме для перорального введения или вливания.

Доза иммунодепрессанта в комбинации с содержащим сульфатную группу гликозаминогликаном зависит от типа иммунодепрессанта, состояния пациента (возраста, пола, вида заболевания, тяжести и т.д.), способа введения (пути введения, дозированной формы и т.д.) и в целом не может быть точно указана, но обычно желательно вводить за отдельный прием 30-70% дозы иммунодепрессанта.

В качестве иммуноподавляющего средства или иммунодепрессанта, используемого в сочетании с агентом, повышающим противовоспалительное действие, или содержащим сульфатную группу гликозаминогликаном может быть использован любой иммунодепрессант, обладающий противовоспалительным действием, любой выпускающийся промышленностью или известный иммунодепрессант (см. "Today's remedy (1994)", 1994, Nankodo publ; 157-161 p. "Immunosuppressants" и "Adrenocortical steroid"). Характерными примерами иммунодепрессанта или иммуноподавляющего соединения служат адренокортикостероиды, циклофосфамид, азатиоприн, мизорибин, циклоспорин, метотрексат, такроли-мусгидрат и т.д. Характерным примером адренокортикостероида служат преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон, дексаметазон, параметазон, триамцинолон, гидрокортизон и кортизонацетат.

Противовоспалительное средство по данному изобретению обладает противовоспалительным действием против воспалительных процессов, сопровождающих перечисленные ниже заболевания, и может предупреждать, лечить и ослаблять эти заболевания у млекопитающих, включая человека (приматов, включая человека; домашних животных, таких как собаки, кошки и т.д.; домашнего скота, такого как коровы, свиньи, лошади и т.д.) и птиц (кур и т.д.).

(1) Гломерулонефрит Согласно классификации WHO (ВОЗ) (Churg, J. & Sokin, LH: Renal disease classification and atlas of glomerular disease. Tokyo and New York, Ikagu-shoin, 1982), гломерулонефрит делится на 1) начальная гломерулярная болезнь, 2) гломерулонефрит системного заболевания, 3) гломерулярные повреждения при заболевании сосудов, 4) гломерулярные повреждения при болезни обмена веществ, 5) наследственная нефропатия, 6) разносторонняя гломерулярная болезнь, 7) почка в конечной стадии, и 8) гломерулярные повреждения, сопровождающие (как последствие) трансплантацию. Противовоспалительные средства по данному изобретению эффективны при начальной гломерулярной болезни по указанному выше пункту 1). При (A. небольших гломерулярных аномалиях, B. фокально/сегментальных повреждениях, C. Диффузном гломерулонефрите и D. Неклассифицированном гломерулонефрите) и специфических болезнях (люпус-нефрит, аллергическая пурпура, lgA нефропатия (болезнь Бергера), синдром Goodpasture'a), относящихся к гломерулонефриту системного заболевания по пункту 2). Кроме того, они эффективны против гломерулярных повреждений при заболевании сосудов по пункту 3) (узелковый периартериит, грануломатоз Wegener'a, тромботическая микроангиопатия, гломерулярный тромбоз, артериолонефросклероз, артериолонекротический нефросклероз, склеродермия) и при гломерулярных повреждениях, сопровождающих трансплантацию по пункту 8).

(2) Коллагеноз и родственные ему заболевания Коллагеноз и родственные ему заболевания относятся к диффузным заболеваниям соединительной ткани, классифицированным Американской Ревматологической Ассоциацией (Decker, J.L. et al. Arthritis Rheum. 26, 1029, 1983).

Заболевания, принадлежащие к вышеуказанной категории, включают: ревматоидный артрит, ювенильный артрит, люпус-эритематоз, склеродермию, диффузный фасцит, полимиозит, некротизирующий васкулит и другие формы васкулопатии (узелковый полиартериит, аллергический гранулематоз, аллергический ангиит, гранулематозный артериит, болезнь Kawasaki, болезнь Бехчета и т.д.), синдром Шегрена, синдромы наложения и другие (полимиалгическая ревматика, рецидивирующий панникулит, рецидивирущий полихондрит, лимфоматозный гранулематоз, узелковая эритема и т.д.). Кроме того, сюда входят также гломерулонефрит и васкулит, вызванные этими болезнями. Противовоспалительные средства по данному изобретению эффективны при этих заболеваниях. Кроме того, они также эффективны при человеческом аутоиммунном лимфопролиферативном синдроме (Cell 81, 935-946 (1995), Science 268, 1347-1349 (1995)).

(3) Трудноизлечимый васкулит Согласно Fauci, AS (The vasculitis syndrome. Harrison's Principles of Internal Medicine, 11th ed., McGraw-Hill) трудноизлечимый васкулит классифицируется на системный некротизирующий васкулит (классический множественный артериит, аллергический гранулематозный ангиит (синдром Churg-Strauss'a), полиартритный узелковый осложненный синдром), аллергический васкулит (экзогенное стимулирование доказано или предполагается: пурпура Шенлейна-Геноха, сывороточная болезнь или подобная ей реакция, другие виды вызываемого применением лекарственных средств васкулита, связанный с инфекционными заболеваниями и с эндогенными антигенами, вовлеченными в патологический процесс подобным образом, васкулит, васкулит, ассоциированный с опухолями, васкулит, связанный с заболеванием соединительной ткани, васкулит, связанный с другими основными заболеваниями, васкулит, связанный с врожденными недостатками комплементарной системы), гранулематоз Вегенера, гигантоклеточный артериит (темпоральный артериит, синдром Такаясу), другие синдромы васкулита (болезнь Kawasaki'a, изолированный васкулит центральной нервной системы, болезнь Бюргера (облитерирующий тромбангиит) и противовоспалительные средства по данному изобретению эффективны при этих заболеваниях.

(4) Иммунологические аномалии или аутоаллергические (аутоиммунные) болезни
К иммунологическим аномалиям или аутоаллергическим болезням относятся воспалительные процессы, сопровождаемые отторжением после трансплантации различных органов; нервные болезни, включающие рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре, HTLV-1, вызываемый миелопатией и тому подобные; желудочно-кишечные заболевания, включающие воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта (клональная болезнь, неспецифический язвенный колит), первичный билиарный цирроз печени и тому подобные; эндокринологические заболевания, включающие аутоаллергические болезни щитовидной железы, такие, как зоб Хасимото, базедова болезнь, инсулин-зависимый сахарный диабет (инсулит) и тому подобные; болезни сердечно-сосудистой системы, включающие идиопатический миокардит, болезнь Шагаса, дилатационная кардиомиопатия, эндокардиальные миофиброзные складки, идиопатический доброкачественный перикардит, эозинофильный эндокардит, посткардиотомный синдром, постмиокардный инфарктный синдром, синдром антифосфолипидного антитела и тому подобные; респираторные заболевания, включающие идиопатическую интерстициальную пневмонию, фиброз легких и тому подобные; почечные болезни, включающие интерстициальный нефрит и тому подобные; кожные болезни, включающие пузырчатку, пемфигоид, иммуногенный влажный приобретенный буллезный эпидермолиз и тому подобные; офтальмические болезни, включающие вызываемый линзами увеит, синдром Vogt-Koyanagi-Harada'a и тому подобные (Autoimmune diseases and immunodeficiency, Recent internal medicine 22. Imura Hiroo, ed. Nakayama-shoten, 1993, pp. 91-206). Противовоспалительные средства по данному изобретению эффективны при этих болезнях.

Настоящее изобретение раскрыто также в следующих характерных ссылочных примерах, примерах и сравнительных примерах:
Ссылочный пример 1
Получение дерматансульфата
Один килограмм гребней (куриных) измельчают и кипятят. К остатку добавляют 5 г проназы (Kaken-seiyaku, торговая марка), и выдерживают для осуществления процесса (пищеварительного) расщепления при 50^oC в течение 12 часов. Переваренный раствор фильтруют через диатомовую землю и доводят pH фильтрата до 5,8-6,3. Добавляют гиалуронидазу (1.000 TRU), полученную из streptomyces griceus (Seikagaku-Corporation), и выдерживают для протекания процесса пищеварительного расщепления при 50^oC в течение 3 часов. К раствору добавляют хлористый натрий до получения 0,65 М раствора, который наносят на колонку (3 х 20 см) с анионообменной смолой Diaion HPA-10 (Mitsubishi-chemical, торговое название), уравновешенную 0,5 М раствором соли. Затем колонку промывают последовательно 0,5 л 0,65 М раствора соли и 0,3 л 1,1 М раствором соли, фракции, вымываемые 1,8 М раствором соли, собирают и концентрируют при пониженном давлении. Концентрат подвергают диализу против дистиллированной воды в течение ночи и концентрируют до 10 мл, к которым добавляют 5 М раствор гидроокиси натрия с тем, чтобы конечная концентрация составила 0,5 М. После выдерживания щелочного раствора при 37^oC в течение 90 минут, его охлаждают и нейтрализуют уксусной кислотой. Затем к нейтрализованному раствору добавляют двойное количество этанола, образовавшийся осадок промывают последовательно 70% этанолом, чистым этанолом и диэтиловым эфиром и сушат при пониженном давлении в присутствии оксида фосфора (V). Затем высушенный продукт (5 г) оставляют на ночь в 125 мл воды, небольшое количество нерастворимого вещества отделяют центрифугированием (10^oC, 10.000 об/мин в течение 15 минут), добавляют к нему 125 мл водного раствора ацетата натрия, а также этанол, так, чтобы его конечная концентрация составила 45%, и охлаждают на ледяной бане. Раствор выдерживают при 4^oC в течение 20 часов и центрифугируют, получая осадок, который промывают последовательно 90% этанолом, чистым этанолом и диэтиловым эфиром и сушат при пониженном давлении в присутствии оксида фосфора (V), получая очищенную натриевую соль дерматансульфата (далее обозначается DS).

Средний молекулярный вес, характеристическая вязкость и состав дисахарида приведены в таблице 1. Конечно, способ выделения и очистки DS не ограничивается приведенным выше, и может быть использован способ, описанный в опубликованной прошедшей экспертизу патентной заявке Японии 9042/1985 или в опубликованной прошедшей экспертизу патентной заявке Японии 21241/1986.

(1) Определение среднего молекулярного веса
Средний молекулярный вес DS определяют по способу Arai'а et al. (Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992). Его определяют (используя в качестве стандарта гликозаминогликан с известным молекулярным весом, определенным способом рассеивания света) по времени элюирования проникновения геля при жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР), используя последовательно соединенные (друг за другом) три колонки: TSK гель G4000PWX_L, TSK гель G3000PWX_L и TSK гель G2500PWX_L (анион 300х7,8 мм во внутреннем диаметре, Toso).

В качестве элюирующего раствора используют 0,2 М раствор соли при скорости потока 0,6 мл/мин, определение выполняют путем дифференциальной рефрактометрии.

(2) Анализ дисахарида
Согласно известной методике (см., "2-8 Structural analysis by HPLC using glycosaminoglycan degrading enzyme", приведенный в Shin-seikagaku-jikken-kouza 3, Tousitu, II, p. 49-62, (1991, Tokyo-Кagaku-dojin)), анализ местоположения сульфатной группы в DS выполняют, как описано ниже. DS расщепляют хондроитиназой ABC, и полученную фракцию дисахарида (ненасыщенного дисахарида), включающую ненасыщенный дисахарид, анализируют жидкостной хроматографией высокого разрешения (ЖХВР), а результат сравнивают с ЖХВР-аналитическим результатом продукта, полученного обработкой указанной фракции ненасыщенного дисахарида хондро-6-сульфатазой. Экспериментальные условия пищевого расщепления с помощью хондроитиназы АВС и десульфуризации с помощью хондро-6-сульфатазы и ЖХВР-анализа следующие:
a) Пищевое расщепление с помощью хондроитиназы ABC
По способу Yoshida'a et al. (Anal. Biochem., 77, 372-333 (1989)), 20 мкл 0,4 М трис-HCl (pH 8,0), 20 мкл 0,4 М ацетата натрия, 20 мкл 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 120 мкл воды добавляют к 20 мкл водного раствора DS (10 мг/мл) и 20 мкл хондроитиназы ABC (5 ед/мл) и выдерживают при 37^oC в течение 2 часов.

b) Пищевое расщепление под действием хондро-6-сульфатазы
К 100 мл указанного выше продукта расщепления хондроитиназой ABC добавляют 20 мкл хондро-6-сульфатазы (5 ед/мл), растворенной в 20 мМ растворе трис-ацетатного буфера (pH 7,0), и выдерживают при 37^oC в течение 2 часов.

c) Анализ методом ЖХВР
50 мкл указанного выше раствора продукта расщепления хондроитиназой АВС или раствора продукта расщепления хондро-6-сульфатазой анализируют ЖХВР (Hitachi Seisakusho) с использованием ионообменной колонки (YMC-Pack PA-120-S5 колонка, 250 х 2,6 мм внутреннего диаметра) и определяют абсорбцию при 232 нм. Элюирование осуществляют 800 мМ кислого фосфата натрия при градиенте 0-100% в течение 60 мин при скорости потока 1,5 мл/мин. Определяют пики, соответствующие ненасыщенным дисахаридам с различным положением сульфатных групп.

(3) Измерение характеристической вязкости
Характеристическую вязкость DS измеряют согласно 12th ed. Japanese Pharmacopeia.

Аналитические приборы: прибор для автоматического измерения вязкости, VMC-052 (Rigo) при использовании вискозиметра Уббелоде.

Растворитель: 0,2 М раствор хлористого натрия (тот же раствор, что был использован для измерения времени вытекания из вискозиметра).

Температура измерения: 300,1^oC.

Способ измерения: характеристическую вязкость определяют по отрезку, отсекаемому на вертикальной оси координат, где снижающуюся вязкость ( red) откладывают по вертикальной оси, а концентрацию образца - по горизонтальной оси.

red = (t_s/t₀-1)/C
в приведенном выше уравнении, ts: скорость истечения 0,2 М раствора хлористого натрия, содержащего DS, t_o: скорость истечения растворителя (0,2 М раствор хлористого натрия, не содержащий DS), C: концентрация образца (вес.%).

В таблице 1 суммированы результаты измерения физических свойств указанного выше DS, полученного из гребня, и других известных DS (бычья кишка, свиная кишка, свиная кожа). DS, полученный из бычьей кишки, свиной кишки и свиной кожи, получен по способу, описанному в патентной заявке WO 95/09188.

Пример 1
Изучено воздействие DS и низкомолекулярного гепарина (LMWHep; торговое название, Fragmin, Pharmacia, Kissei-yakuhin-kogyo) на свертывание крови.

(1) Экспериментальный материал
Используют самцов C57BL/6 мышей в возрасте десять недель (каждая группа состоит из 3 мышей). DS и LMWHep растворяют в стерильном физиологическом растворе.

(2) Экспериментальный способ
После введения DS (25 мг/кг) и LMWHep (1 мг/кг) в хвостовую вену мыши отбирают образцы крови с определенными промежутками времени и измеряют активное парциальное время тромбопластина (APTT).

(3) Результаты
На фигуре 2 приведены изменения в APTT после введения каждого вещества с течением времени, где обозначает случай введения LMWHep и обозначает случай DS (среднее значение стандартная ошибка (сек)). Как следует из фигуры 2, APTT в LMWHep () все еще выше 300 секунд, даже через 30 минут после введения, это означает, что LMWHep подавляет действие фактора свертывания крови и риск кровотечения очень высок. В противоположность этому, через 60 минут после введения APTT пролонгирующая активность не отмечается, что означает, что LMWHep удаляется из крови за короткое время и нельзя ожидать, что его действие продержится в течение долгого времени. С другой стороны, через 5 минут после введения DS наблюдается только слабая APTT, пролонгирующая активность DS (), что означает отсутствие риска кровотечения. Кроме того, такая активность может быть зарегистрирована даже через 240 минут после введения, это означает, что DS оказывает безопасное и более устойчивое воздействие, чем LMWHep. Как указано выше, поскольку более чем 1 мг/кг LMWHep может вызвать нежелательный эффект кровотечения, максимальная доза LMWHep в последующих экспериментах составляла 1 мг/кг. Поскольку даже LMWHep, улучшенный в отношении антикоагулирующей активности, может вызывать кровотечение, как описано выше, лечение гепарином (Hep) не представляло практического интереса и поэтому не проводилось.

Пример 2
Исследование с использованием SLE модели-1 на мышах
Подтверждение воздействий отдельно применяемого дерматансульфата
(1) Экспериментальный материал
В качестве SLE модели используют самцов MRL (lpr/lpr) мышей в возрасте 17 недель, тогда как в качестве нормального контроля используют C57BL/6 мышей того же возраста и пола. В качестве лекарственных средств, DS или гепарин низкого молекулярного веса (LMWHep, Fragmin), полученный по способу стандартного примера 1, растворяют перед употреблением в стерильном физиологическом растворе.

(2) Экспериментальный способ
Отбирают образцы крови у мышей в возрасте 17 недель, отбирают только MRL мышей с нефритом, у которых высокое содержание азота мочевины крови (BUN) было на приблизительно одинаковом уровне, и делят на 4 группы, каждая группа из которых состоит из 5 мышей. Одной группе (в качестве нелеченной контрольной группы) вводят стерильный физиологический раствор, в 3 других группах в хвостовую вену вводят один раз в день и пять раз в неделю 5 мг/кг DS, 25 мг/кг DS и 1 мг/кг LMWHep. Через 4 недели отбирают образцы крови при анестезии нембуталом и после умерщвления животных путем кровопускания иссекают почки. Взятые сыворотку и плазму используют для определения BUN, креатинина и фибриногена, а почки используют для гистопатологического исследования.

(3) Результаты (см. фигуры 3-6)
1) Влияние на функцию почек
Результаты анализа BUN и креатинина приведены на фигуре 3a и фигуре 3b, соответственно (на фигурах изображен уровень в сыворотке (мг/дл) каждого вещества). На фигуре 3a, PRE (пунктирная линия) показывает среднее значение BUN к началу введения агентов (возраст 17 недель). Как показано на фигуре, это значение заметно выше, чем соответствующее значение для нормальной контрольной группы (C57BL/6), это означает, что у MRL мышей развит нефрит. На фигуре 3b, * обозначает, что существует существенное отличие с p<0,05 от нелеченной контрольной группы при анализе по Bonferroni. Как уровень BUN, так и уровень креатинина необработанной контрольной группы выше, чем соответствующие величины для нормальной контрольной группы (C57BL/6), из чего ясно, что функционирование почки ухудшено. Среди леченных групп, BUN уровень слегка улучшен в 5 мг/кг DS группе, 25 мг/кг DS группе и 1 мг/кг LMWHep группе. Среди леченных групп уровень креатинина также слегка улучшен в 5 мг/кг DS группе и 1 мг/кг LMWHep группе и значительно улучшен в 25 мг/кг DS группе.

2) Влияние на результаты гистопатологического исследования почек
Фигуры 4a-c представляют гистологические картины почек и демонстрируют гистопатологические изменения почек на каждой стадии при аутопсии MRL мышей и нормальных контрольных мышей. Фигура 4a демонстрирует гистологическую картину нормального контроля, а остальные - соответствующие данные для MRL мышей (фотоувеличение: x 500). Размер прямой горизонтальной линии основания каждой фотографии 10 мкм.

Фигура 5a представляет число МС клубочков/общее число клубочков (%), и фигура 5b дает число DP клубочков/общее число клубочков (%).

По результатам микроскопического исследования полученной аутопсией почки мыши, очевидная картина гломерулонефрита наблюдается в нелеченной контрольной группе, где отсутствуют нормальные клубочки (фигура 4a), (1) исходя из классификации ВОЗ относится к минимально измененному (МС) типу со слабо гипертрофированной петлей и пролиферацией клеток (фигура 4b), (2) клубочки, которые почти полностью утратили полость капсул Bowman'а и васкулярную полость и заполнены клеточными компонентами и осадком, функции которых нарушены (соответствие пролиферативному гломерулонефриту (далее обозначенному DP) диффузного гломерулонефрита по классификации ВОЗ, фигура 4c) и (3) иллюстрирует ситуацию между (1) и (2). Из этих результатов видны постепенные патологические изменения почечных клубочков MRL (lpr/lpr) мышей от МС до DP, при которых полость капсул Bowman'а и васкулярная полость утрачены из-за пролиферации моноцитарных и мезангиальных клеток и/или из-за осаждения фибрина и иммунного комплекса.

Измерение числа МС клубочков/общее число клубочков (%) и числа DP клубочков/общее число клубочков (%), показывает, что уровень МС клубочков значительно возрастает в 25 мг/кг DS группе и слабо возрастает в 5 мг/кг DS группе и 1 мг/кг LMWHep группе (фигура 5a). С другой стороны, уровень DP
клубочков явно снижается в зависимости от дозы в 5 мг/кг DS группе и 25 мг/кг DS группе, тогда как в LMWHep группе такой эффект не наблюдается (фигура 5b).

Как описано выше, гистопатологическим исследованием установлено, что DS оказывает действие, предупреждающее развитие нефрита. LMWHep оказывает слабое действие, поддерживая минимально измененную (МС) группу, но не воздействует на уже прогрессирующий нефрит.

3) Влияние на гистопатологические изменения почечной артерии
Фигура 6a представляет гистологическую картину почечной артерии нормальной контрольной мыши, а фигуры 6b-d представляют гистологическую картину почечной артерии MRL мыши, показывающую гистопатологические изменения почечной артерии на каждой стадии (фотоувеличение: x 204). Размер прямой горизонтальной линии основания каждой фотографии 50 мкм. В результате микроскопического исследования получены следующие гистопатологические картины 3 стадий ангиита в почечной артерии MRL мышей: слабая степень: воспалительно-целлюлярная инфильтрация вокруг кровеносного сосуда (фигура 6b), средняя степень: воспалительно-целлюлярная инфильтрация вокруг кровеносного сосуда и коллапс внешней части оболочки и средней части оболочки (дегенерация вакуоли, осаждение фибрина) (фигура 6c), тяжелая степень: воспалительно-целлюлярная инфильтрация вокруг кровеносного сосуда и коллапс внешней части оболочки и средней части оболочки (дегенерация вакуоли, осаждение фибрина, пролиферация клетки гладкой мышцы) и воспалительная инфильтрация внутренней и средней части оболочки (фигура 6d).

Ангиит в каждой группе оценивают гистопатологически, используя в качестве параметров эти гистологические картины. В результате, в 25 мг/кг DS группе снижается количество состояний, характеризуемых тяжелой степенью, и возрастает количество состояний средней и слабой степени (таблица 3). Нет большого различия между 1 мг/кг LMWHep группой, 5 мг/кг DS группой и необработанной группой (таблица 3). Из этих гистопатологических наблюдений следует, что DS оказывает подавляющее воздействие на ангиит.

4) Влияние на уровень фибриногена в крови
Фибриноген является одним из высоко реактивных соединений и его уровень возрастает не только при гломерулонефрите и ангиите, но также при различных видах воспалительных процессов и считается одним из показателей воспаления (In Procoagulant Activity in Health and Disease, Eds. Levy, G.A. and Cole, E. H. CRC Press Boca Raton 1994). Как показано на фигуре 7, этот переменный параметр для нелеченной группы MRL (lpr/lpr) мышей значительно выше, чем для нормальной контрольной группы, что свидетельствует о тяжелом воспалительном процессе в нелеченной группе. В 5 мг/кг и 25 мг/кг DS группе это возрастание подавлялось в зависимости от дозы, но такое действие едва выражено у LMWHep.

Пример 3
Исследование с использованием SLE модели-2
Подтверждение совместного действия дерматансульфата с циклофосфамидом
(1) Экспериментальный материал
В качестве экспериментальных животных используют самцов MRL (lpr/lpr) мышей в возрасте десяти недель, а в качестве агента - DS, полученный по ссылочному примеру 1, растворяя его перед применением в стерильном физиологическом растворе.

В каждом флаконе растворяют эндоксан для инъекции (Циклофосфамид, Shionogi) (100 мг/флакон), добавляя 5 мл дистиллированной воды для инъекций, и затем добавляют стерильный физиологический раствор, так, чтобы концентрация эндоксана составила 4, 6 и 8 мг/мл. В негативной контрольной группе (нелеченной группе) вводят стерильный физиологический раствор.

(2) Экспериментальный способ
Определяют вес тела животных в возрасте 10 недель, и производят забор крови для определения BUN сыворотки (азота мочевины крови) и креатинина сыворотки. Животных делят на 5 групп, по 6 мышей в каждой, разделяя путем непрерывной рандомизации, так, чтобы среднее значение и стандартное отклонение в каждой группе было приблизительно такое же, как и в других группах. DS вводят ежедневно 5 раз в неделю (кроме субботы и воскресенья) в хвостовую вену мышей, используя 1 мл одноразовые шприцы, при уровне дозы 25 мг/кг/день. Циклофосфамид вводят внутрибрюшинно один раз в неделю при какой-либо из доз: 20 мг/кг, 15 мг/кг или 10 мг/кг, согласно описанному в литературе способу, где тот же агент изучался на мышах (Shiraki, M. et al., Clin. Exp. Immunol., 55, 333-339 (1984)). Во время введения животных ежедневно тщательно осматривают. Через 8 недель забирают образцы крови при анестезии нембуталом и животных умерщвляют путем кровопускания. Затем измеряют уровень креатинина сыворотки, вес селезенки и вес мезентериального лимфатического узла.

(3) Результаты (см. фигуры 8-10)
1) Влияние на функцию почек
На фигуре 8 приведены результаты анализа уровня креатинина сыворотки (мг/дл). По сравнению с негативной контрольной группой одноразовое введение 20 мг/кг эндоксана не оказывает совсем никакого воздействия на уровень креатинина. Однако совместное введение эндоксана (10 мг/кг и 20 мг/кг) с 25 мг/кг DS приводит к слабому улучшению относительно уровня креатинина, а совместное введение 15 мг/кг эндоксана с DS значительно улучшает уровень (p<0,05). Особенно следует обратить внимание на то, что оба случая совместного введения, 20 мг/кг эндоксана с 25 мг/кг DS и 15 мг/кг эндоксана с 25 мг/кг DS, дают лучшие результаты, чем отдельное введение 20 мг/кг эндоксана. Далее, группа совместного введения 15 мг/кг эндоксана с 25 мг/кг DS дает гораздо лучшие результаты, чем группа отдельного введения 20 мг/кг эндоксана, и кроме того, найдено, что DS ослабляет токсичность эндоксана и является эффективным.

2) Влияние на вес селезенки
Вес селезенки у MRL мышей аномально тяжелее, чем у нормальных мышей. Проведено испытание по лечению увеличенной селезенки у MRL мышей. На фигуре 9 приведены результаты измерения веса селезенки. По сравнению с негативной контрольной группой, группа отдельного введения 10 мг/кг эндоксана не дает никакого эффекта, но все остальные группы дают эффективные результаты по спленомегалии. Доза DS во всех случаях составляет 25 мг/кг. Заслуживает внимания тот результат, что если используется одинаковое количество эндоксана, то группа совместного способа воздействия эндоксана с DS дает гораздо лучшие результаты, чем группа отдельного введения эндоксана.

3) Влияние на вес мезентериального лимфатического узла
Вес мезентериального лимфатического узла у MRL мышей аномально больше, чем у нормальных мышей. Проведено испытание по лечению этой аномалии. На фигуре 10 приведены результаты взвешивания мезентериального лимфатического узла. По сравнению с негативной контрольной группой, наблюдается понижение веса лимфатического узла во всех других группах. Важно, что группа совместного воздействия 10 мг/кг эндоксана с DS дает лучшие результаты, чем группа отдельного введения 10 мг/кг эндоксана. Доза DS во всех случаях составляет 25 мг/кг.

На основании результатов примера 3 установлено, что комбинирование DS с иммунодепрессантом повышает противовоспалительное действие иммунодепрессанта и дает такой же или лучший эффект, чем отдельное применение иммунодепрессанта при определенном уровне дозы (далее обозначается как доза A). То есть, найдено, что объединение меньшего количества иммунодепрессанта, чем доза A, с DS (доза DS не лимитируется) дает лучший эффект, чем отдельная доза A иммунодепрессанта. Поскольку DS является одним из гликозаминогликанов, содержащих сульфатную группу, комбинация другого, содержащего сульфатную группу гликозаминогликана с иммунодепрессантом, будет давать такой же эффект.

Пример 4
Исследование с использованием модели рассеянного склероза (МС) на крысах
Изучают воздействия DS на экспериментальный аллергический энцефаломиелит (EAE) крыс, используемый в качестве модели рассеянного склероза на животных, который считается аутоиммунным и представляет характерную болезнь при иммунологической аномалии центральной нервной системы (Clinical immunology illustrated, р. 112-117, Brostoff, Scadding, Male, Roitted., Shun-ichi Hirose, Shogo Kano, Tornio Tada, transl., Nanko-do, 1994).

(1) Экспериментальные материалы
В качестве экспериментальных животных используют 4-недельных самок Lewis крыс и делят на две группы, каждая из 10-12 крыс. В качестве иммунизирующего вещества используют миелин-основной белок морской свинки (далее называемый GPMBP) с полной добавкой Freund'a, включающей Mycobacterium tuberculosis (MTB). В качестве агента используют DS, полученный по способу стандартного примера 1, растворяя его перед применением в стерильном физиологическом растворе. Далее, группа с введенным DS упоминается как DS группа. Группе негативного контроля вводили физиологический раствор.

(2) Экспериментальные способы
Каждую крысу иммунизуют инъекцией в ногу 12,5 мкг GPMBP и 200 мкг MTB. Начиная с третьего дня после иммунизации, вводят интраперитонеально один раз в день стерильный физиологический раствор в DS группе и в негативной контрольной группе, соответственно. Клинические симптомы, характеризующие EAE, выражают в цифрах следующим образом: (далее называется клинической оценкой) нет симптомов - 0; гипотония хвоста - 1; гипотония нижних конечностей - 2; паралич нижних конечностей - 3; паралич верхних конечностей - 4; смерть - 5.

Симптомы каждой крысы ежедневно численно оценивают, и в каждой группе устанавливают день начала болезни и накопленные клинические оценки. Достоверное отклонение определяют по тесту Student'а.

(3) Результаты
По набранным клиническим оценкам установлено достоверное отклонение (p<0,05) между DS группой (12,41,7) и контрольной группой (16,35,9), подтверждающее, что DS подавляет симптомы. Кроме того, средний день начала болезни в DS группе составляет 9,50,5, а в контрольной группе 9,10,3, это свидетельствует о том, что выражение симптомов склонно к замедлению в DS группе и что DS подавляет проявление симптомов. Из этих результатов следует, что DS является эффективным агентом для лечения MS, поскольку EAE является моделью MS на животных.

Пример 5
Испытание токсичности путем единичного внутривенного введения дерматансульфата
(1) Экспериментальный способ
В качестве экспериментальных животных используют пятинедельных самок и самцов Crj; CD-I мышей (Japanese Charles-river (n = 5 каждый). Раствор DS, полученный по способу ссылочного примера 1, делают изотоническим, используя стерильную дистиллированную воду и стерильный физиологический раствор, и вводят внутривенно в хвостовую вену мышей одноразово-2000 мг/кг DS и проводят клинические наблюдения в течение 14 дней.

(2) Результаты
После 14 дней наблюдения не отмечается смертельных случаев как среди 5 самок, так и среди 5 самцов мышей. Соответственно, летальную дозу DS в данных условиях оценивают выше 2000 мг/кг.

Пример 6
Фармацевтический препарат
(1) Инъекции, включающие дерматансульфат в качестве эффективного ингредиента
DS (5000 мг) растворяют в 100 мл физиологического раствора, стерилизуют и впрыскивают в ампулы (5 мл каждая), которые используют для внутрисосудистого, подкожного или внутримышечного вливания.

(2) Совместное применение с иммунодепрессантом
Различные виды иммунодепрессантов при указанной ниже дозе растворяют в 100 мл физиологического раствора, стерилизуют и впрыскивают в ампулы. В зависимости от вида иммунодепрессанта его доза определяется следующим образом: циклофосфамид, 30 мг; азатиоприн, 30 мг; мизорибин, 150 мг; метотрексат, 3 мг; такролимусгидрат, 3 мг; циклоспорин, 15 мг.

Эти иммунодепрессанты смешивают с DS-инъекциями, полученными выше по п. 1.

Препараты DS могут быть введены до или после введения вышеуказанных иммунодепрессантов. Например, можно использовать 25 мг/день преднизолона, 30 мг/день циклофосфамида или азатиоприна, 150 мг/день мизорибина, 3 мг/день метотрексата или такролимусгидрата или 15 мг/день циклоспорина.

Воздействия этих иммунодепрессантов на различные болезни могут быть усилены введением препаратов DS до или после их применения. Вдобавок, эта доза может варьироваться в зависимости от тяжести состояния пациента. Из этих агентов преднизолон, циклофосфамид, метотрексат и циклоспорин могут вводиться интраваскулярно или перорально. Лучший способ введения других агентов per os (через рот).

Промышленная применимость
Дерматансульфат или его фармацевтическая соль могут применяться в качестве полезного противовоспалительного средства, не оказывающего неблагоприятные воздействия для подавления трудноизлечимых или затянувшихся воспалительных процессов или воспалений, при которых задействован иммунологический механизм.

Кроме того, при использовании содержащего сульфатную группу гликозаминогликана или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с иммунодепрессантом, таким как адренокортикальный стероид, циклофосфамид, азатиоприн, мизорибин, циклоспорин, метотрексат, такролимусгидрат и т.д., меньшее количество иммунодепрессанта, чем в случае отдельного введения иммунодепрессанта, может приводить к тому же эффекту, выражающемуся в снижении нежелательных воздействий, вызываемых иммунодепрессантом.

Формула изобретения

1. Средство, усиливающее противовоспалительное действие иммунодепрессанта, представляющее собой по меньшей мере один гликозаминогликан, выбранный из группы, включающей дерматансульфат, гепарин, гепарансульфат, хондроитинсульфат и кератансульфат и их фармацевтически приемлемые соли.

2. Средство по п.1, представляющее собой дерматансульфат.

3. Средство, по п.1, в котором указанный иммунодепрессант включает по меньшей мере один вид иммунодепрессанта, выбранного из группы, включающей адренокортикостероид, циклофосфамид, азатиоприн, мизорибин, циклоспорин, метотрексат и такролимусгидрат.

4. Средство, включающее иммунодепрессант и гликозаминогликан, выбранный из группы, включающей дерматансульфат, гепарин, гепарансульфат, хондроитинсульфат и кератансульфат или их фармацевтически приемлемые соли.

5. Средство, по п. 4, в котором гликозаминогликан представляет собой дерматансульфат.

6. Средство по п.4 или 5, в котором указанный иммунодепрессант включает по меньшей мере один вид иммунодепрессанта, выбранного из группы, содержащей адренокортикостероид, циклофосфамид, азатиоприн, мизорибин, циклоспорин, метотрексат и такролимусгидрат.

7. Способ усиления противовоспалительного действия иммунодепрессанта, заключающийся в том, что указанный иммунодепрессант используют в комбинации с гликозаминогликаном, выбранным из группы, включающей дерматансульфат, гепарин, гепарансульфат, хондроитинсульфат и кератансульфат и их фармацевтически приемлемые соли, причем временной режим введения или способ введения могут меняться.

8. Способ по п.7, где указанный гликозаминогликан или его фармацевтически приемлемую соль вводят в виде инъекции, а указанный иммунодепрессант - в виде перорального лекарственного средства или инъекции.

9. Способ по пп.7 и 8, где указанный гликозаминогликан представляет собой дерматансульфат.

10. Способ по пп.7 - 9, где указанный иммунодепрессант включает по меньшей мере один вид иммунодепрессанта, выбранного из группы, содержащей адренокортикостероид, циклофосфамид, азатиоприн, мизорибин, циклоспорин, метотрексат и такролимусгидрат.

11. Способ лечения воспаления, включающий введение иммунодепрессанта и эффективного количества противовоспалительного средства, включающего дерматансульфат или его фармацевтически приемлемую соль, млекопитающему, страдающему воспалительным заболеванием.

12. Способ по п.11, где указанным воспалительным заболеванием является затянувшийся воспалительный процесс.

13. Способ по п.12, где указанным воспалительным заболеванием является воспалительный процесс, в котором задействован иммунологический механизм.

14. Применение дерматансульфата или его фармацевтически приемлемой соли в качестве средства, усиливающего противовоспалительное действие иммунодепрессанта.

15. Применение по п.14, в котором имуннодепрессант предназначен для лечения затянувшегося воспаления.

16. Применение по п.14, в котором имуннодепрессант предназначен для лечения воспалительного процесса, в котором задействован иммунологический механизм.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13