Циклопептолиды

 

Описаны циклопептолиды формулы I в свободной форме, в форме соли или сложного эфира где А обозначает остаток гликолевой кислоты, необязательно -замещенной метилом, этилом, необязательно замещенным тиазолом; В обозначает остаток -амино--метилзамещенной октановой кислоты; R₁ обозначает метил; С обозначает остаток N-метилтриптофана формулы II где R₁ обозначает алкокси; R₄ обозначает метил; R₅ - метил; символ обозначает двойную связь; Х обозначает -аминозамещенной (С₂-С₁₄)карбоновой кислоты и Y обозначает остаток N-метил--аминозамещенной (С₂-С₁₀)карбоновой кислоты, которые являются ингибиторами экспрессии молекул адгезии и ингибиторами высвобождения TNF и которые вследствие этого пригодны для лечения воспалительных и других заболеваний, обусловленных повышенными уровнями экспрессии молекул адгезии, и/или опосредованы TNF. Описана также терапевтическая композиция, обладающая цитотоксической активностью, активностью в отношении ингибирования экспрессии I CAM-1, V CAM-1 и Е - селектина, высвобождения TNF и пролиферации клеток, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п.1 или 2. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл.

Изобретение относится к циклопептолидам и к их терапевтическому применению в качестве ингибиторов экспрессии молекул адгезии.

Молекулы клеточной адгезии, такие как ICAM-1 (молекула межклеточной адгезии), VCAM-1 (молекула сосудистой адгезии) и E-селектин, экспрессируются на поверхности эндотелиальных клеток, а также, в случае ICAM-1, на поверхности кератиноцитов в ответ на появление медиаторов, которые являются предшественниками воспаления, таких как TNF (фактор-альфа некроза опухоли), IFN ( -интерферон), IL1 (интерлейкин 1) и LPS (липополисахариды). Соответствующие антилиганды, например, LFA-1, VLA-4 и SLE^x, экспрессируются на поверхности клеток, находящихся в кровотоке.

Трансэндотелиальная миграция лейкоцитов во время воспалительных процессов, а также внесосудистые взаимосвязи клетка-клетка регулируется в результате взаимодействий между этими молекулами адгезии и их антилингандами.

Следовательно, ингибиторы экспрессии молекул адгезии потенциально пригодны для лечения многих болезненных состояний.

Циклопептолиды представляют собой циклические молекулы, содержащие аминокислотные остатки, сцепленные вместе пептидными связями, и по крайней мере одну гидроксигруппу, замещенную остатком карбоновой кислоты, который связан через свой гидроксильный радикал с соседним остатком кислоты с помощью эфирной связи.

В заявке WO 96/03430 описаны новые циклогептапептолиды, которые являются ингибиторами экспрессии ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина. Согласно настоящему изобретению были созданы дополнительные новые циклогептапептолиды из этого же общего класса соединений, в том числе соединения, обладающие особенно важными целевыми свойствами.

Настоящее изобретение относится к циклогептапептолидам формулы I где A обозначает остаток гликолевой кислоты, необязательно -замещенный метилом, этилом или винилом, необязательно замещенным галогеном, алкоксигруппой, необязательно защищенной гидрокси- или аминозащитной группой, CSNH₂, COOR₂, винилом или -CCH или тиазолом, где R₂ обозначает H или (низш.)алкил, необязательно замещенный алкилом, галогеном, циклоалкилом, необязательно замещенным тиазолом, COOR₂ или -CCH, где R₂ имеет указанное выше значение; B обозначает остаток -амино- -метилзамещенной октановой кислоты; R₁ обозначает водород или метил;
C обозначает триптофан или остаток N-метилтриптофана формулы II

где R₃ обозначает водород, алкокси, алкил или бензил, R₄ обозначает водород или галоген, R₅ обозначает водород или метил и символ обозначает простую или двойную связь;
X обозначает остаток -аминозамещенной C₂-C₁₄ карбоновой кислоты и
Y обозначает остаток -амино- или N-метил- -аминозамещенной C₂-С₁₀ карбоновой кислоты, при условии, что A не обозначает остаток незамещенной -гидроксизамещенной масляной кислоты, и при условии, что, когда A обозначает остаток гликолевой кислоты, -замещенной этилом, этильный остаток необязательно замещен только амино-, гидроксигруппой, хлором, алкоксигруппой, необязательно замещенной тиазолом, необязательно замещенным винилом, циклопропилом, CSNH₂ или -CCH.
В формуле I ориентация аминокислотных остатков от N-конца к C-концу происходит по часовой стрелке, а пептолидная эфирная связь находится между остатками A и Y. Когда R₁ обозначает метил, остатки R₁-Leu и Leu обозначают остатки N-метиллейцина и лейцина соответственно.

Предпочтительно A обозначает остаток гликолевой кислоты, -замещенной метилом или этилом, необязательно замещенным амино-, гидроксигруппой, хлором, алкоксигруппой, необязательно замещенной тиазолом, необязательно замещенным винилом, циклопропилом, CSNH₂ или -CCH.
Предпочтительно C обозначает остаток N-метилтриптофана формулы II, где R₃ обозначает водород, C₁-C₄ алкокси (прежде всего метокси) или алкил и R₄ обозначает водород или галоген.

Предпочтительно X обозначает остаток -аминозамещенной C₄-C₈ карбоновой кислоты, который необязательно является - или -замещенным C₁-C₄ алкилом. Наиболее предпочтительно X обозначает остаток октановой или масляной кислоты, -амино- - или -замещенный C₁-C₄ алкилом, предпочтительно метилом.

Предпочтительно Y обозначает остаток N-метил- -аминозамещенной C₂-C₄ карбоновой кислоты, который необязательно является - или -замещенным C₁-C₄ алкилом. Наиболее предпочтительно Y обозначает остаток N-метилаланина или N-метилвалина.

Изобретение включает пептиды или пептолиды с открытой цепью, соответствующие соединениям формулы I; например, молекулы с открытой цепью, полученные в результате разрыва сложноэфирной химической связи между остатками Y и A или разрыва амидной связи между любой другой соседней парой остатков кислоты. Предпочтительно производные с открытой цепью представляют собой соединения формул IV или V
H-C-X-Y-A-B-R₁Leu-Leu.OR₇ (IV)
и
HA-B-R₁Leu-Leu-C-X-Y.OR₇, (V)
где R₇ обозначает водород или алкил, например, C₁-C₄ (низш.)алкил.

В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения предпочтительными являются соединения формулы I_p

где A_p обозначает остаток гликолевой кислоты, необязательно -замещенной метилом;
B_p обозначает остаток -амино- -метилзамещенной октановой кислоты;
R_1p обозначает водород или метил;
C обозначает триптофан или остаток N-метилтриптофана, который необязательно замещен N'-C₁-C₄ алкоксигруппой;
X_p обозначает остаток -аминозамещенной C₂-C₁₄ карбоновой кислоты;
Y_p обозначает остаток -амино- или N-метил- -аминозамещенной C₂-C₁₀ карбоновой кислоты.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предпочтительными являются соединения формулы I'_p

где B_p, R_1p, C_p, X_p и Y_p имеют значения, указанные выше, а A'_p обозначает остаток -гидроксизамещенной масляной кислоты, -замещенный группой формулы VI

где R₂ обозначает (низш. )алкильную группу, например, C₁-C₄ (низш. )алкильную группу.

Наиболее предпочтительно R₂ обозначает метил или этил.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предпочтительными являются соединения формулы I''_p

где B_p, R_1p, C_p, X_p и Y_p имеют значения, указанные выше, а A''_p обозначает остаток -гидроксизамещенной масляной кислоты, -змещенный группой формулы VII
, (VII)
где R₆ обозначает водород, (низш.)алкил или фенил или образует карбоциклическое кольцо, соединяясь в положении 5 с тиазолильным кольцом.

Соединения формул I, IV, V, I_p, I'_p и I''_p в контексте настоящего описания далее обозначены как "соединения по изобретению", и это понятие также включает все соединения по изобретению, которые находятся в форме соли или сложного эфира или в свободной форме.

Соединения по изобретению содержат асимметричные атомы и, следовательно, могут находиться в различных эпимерных формах. Все возможные эпимеры, а также их диастереоизомерные смеси подпадают под объем изобретения. Предпочтительными являются эпимеры, которые обладают способностью ингибировать экспрессию молекул адгезии. В целом, например, для фармацевтического применения в соответствии с изобретением предпочтительными будут являться эпимеры, которые обладают способностью ингибировать экспрессию молекул адгезии, в чистой или в практически чистой форме (т.е. свободные или практически свободные от эпимеров, которые не обладают способностью ингибировать экспрессию молекул адгезии), например, содержащие по крайней мере 90%, например, по крайней мере 95%, активного эпимера (т.е. содержащие менее 10%, например, менее 5%, неактивного эпимера). Наиболее предпочтительные соединения по изобретению имеют такую же стереохимическую конформацию циклопептолидного кольца, которая характерна для наиболее предпочтительного соединения формулы VII, приведенного ниже.

Особенно предпочтительными соединениями по изобретению являются соединения формул VIII, IX и X



Соединения формулы VIII были выделены из культур штамма грибов F/94-499709, образцы которого в соответствии с Будапештским соглашением депонированы в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSM) 18 сентября 1995 г. и получили регистрационный номер DSM 10275.

Характеристики штамма грибов F/94-499709 приведены ниже в примере 1 настоящего описания. Соединение формулы VIII является заслуживающим особого внимания соединением по изобретению.

Образцы штамма F/94-499709 также могут быть получены на фирме Sandox Ltd., CH-4002, Базель, Швейцария.

При этом следует отметить, что доступ к образцам DSM 10275 ограничен в соответствии с условиями правила 28(4) и (5) Европейской патентной конвенции.

Изобретение включает штамм F/94-499709 (DSM 10275) в выделенной форме и его мутанты и производные, а также новые циклопептолиды, которые продуцируются этим штаммом.

Соединения формулы VIII и родственные соединения могут быть получены при культивировании штамма F/94- 499709 (DSM 10275) или его мутанта или производного или близких к нему видов грибов в питательной среде и путем выделения из нее соединений, например, согласно примеру 2.

Характеристики соединения формулы VIII приведены в примере 3.

Соединения по изобретению могут быть получены путем образования производных соединений формул XI или XII (как представлено ниже в настоящем описании) или VIII способом, включающим
а) для получения соединений формулы I, где A замещен группой COOR₂, взаимодействие соединений формулы I, где A замещен CN, с нуклеофилами, предпочтительно со спиртом, в присутствии пригодного основного или кислотного катализатора, предпочтительно соляной кислоты, в органических растворителях, предпочтительно в простом эфире, или
б) для получения соединений формулы I, где A замещен алкоксиметилом, взаимодействие соединений формулы I, где A замещен группой CH₂-OH, с алкилирующими соединениями, такими, как алкилгалогениды или диазосоединения, в присутствии катализатора или без него, или
в) для получения соединений формулы I, где A замещен группой COOR₂, образование сложных эфиров соответствующих соединений формулы I, где A замещен группой COOH, стандартными методами, предпочтительно превращением в хлорангидрид с помощью, например, тионилхлорида, и обработки соответствующим спиртом в присутствии акцептора кислоты или без него, или
г) для получения соединений формулы I, где A замещен CH₂OH, восстановление соответствующих соединений формулы I, где A замещен группой COOR₂, гидридами металлов или борангидридами, предпочтительно комплексом боран-диметилсульфид, в органических растворителях, или
д) для получения соединений формулы I, где A замещен необязательно замещенным винилом, взаимодействие соединений формулы I, где A замещен группой CHO, с реагентом Виттига, или
е) для получения соединений формулы I, где A замещен CH₂NH₂, восстановление соответствующих соединений формулы I, где A замещен группой CH₂N₃, или
ж) для получения соединений формулы I, где A замещен группой дегидрирование соответствующих соединений формулы I, где A замещен группой CH= CBr₂, или
з) для получения соединений формулы I, где A замещен циклопропилом, взаимодействие соответствующих соединений формулы I, где A замещен винилом, с диазометаном, или
и) для получения соединений формулы I, где A замещен группой CSNH₂, взаимодействие соответствующих соединений формулы I, где A замещен группой CN, с производными серы, предпочтительно с дифенилфосфиндитионовой кислотой, например, путем кипячения с обратным холодильником раствора серусодержащего соединения с соединением формулы I, где A замещен группой CN, или
к) для получения предпочтительных соединений формулы I''_p

где заместители имеют значения, указанные выше, взаимодействие соединения формулы I''_p, где A''_p обозначает остаток -гидроксизамещенной масляной кислоты, -замещенный группой -CS-NH₂, с -галоидкарбонильным соединением формулы XIII
Hal-CH₂-CO-R₆, (XIII)
где R₆ имеет значения, указанные выше, a Hal обозначает галоген, или с ацеталем соединения формулы XIII
(реакция может быть проведена в соответствии с известными методами, например, взаимодействием раствора соединения формулы II в растворителе, инертном в условиях реакции, например, в диметилформамиде или пиридине, при повышенной температуре, предпочтительно при 60-100^oC; конечный продукт может быть выделен и очищен общепринятыми способами), или
л) для получения предпочтительных соединений формулы I'_p

где заместители имеют значения, указанные выше, взаимодействие соединения формулы I'_p, где A'_p обозначает остаток -гидроксизамещенной масляной кислоты, -замещенный группой -CHO, с алкоксикарбонилметилентрифенилфосфораном и выделение соединений формулы I'_p, или
м) для получения соединений формулы I, где R₃ обозначает водород, удаление метоксигруппы из соединений формулы I, где R₃ обозначает OCH₃, или
н) для получения соединений формулы I, в которых символ обозначает простую связь, восстановление соединений формулы I, в которых символ обозначает двойную связь, или
о) для получения соединений формулы I, где R₃ обозначает алкил или бензил, введение этих групп в соединения формулы I, где R₃ обозначает водород, или
п) для получения соединений формулы I, где R₄ обозначает галоген, галогенирование соединений формулы I, где R₄ обозначает водород, или
р) для получения соединений формулы I, где R₃ обозначает алкокси и символ обозначает двойную связь, взаимодействие соединения формулы I,
где R₃ обозначает водород и символ обозначает простую связь, с щелочным вольфраматом и перекисью водорода и алкилирование N-гидроксииндольного промежуточного продукта и при необходимости выделение соединения формулы I.

В предпочтительных, указанных выше вариантах осуществления а)-и) соединения формулы I представляют собой те соединения формулы I, в которых A обозначает остаток -гидроксимасляной кислоты, -замещенный группой COOR₂, CN, алкоксиметилом, CH₂-OH, COOH, при необходимости необязательно замещенным винилом, CHO, CH₂NH₂, CH₂N₃, CCH, CH=CBr₂, циклопропилом или винилом.

Промежуточные продукты для получения соединений формулы I могут быть получены следующим образом:
(I) для получения промежуточных продуктов, в которых A замещен -CHO, окислением соответствующих соединений формулы I, в которых A замещен -CH₂OH, и
(II) для получения промежуточных продуктов, в которых A замещен -COOH, гидролизом соответствующих соединений формулы I, в которых A замещен COO алкилом, с помощью неорганической кислоты, например, HCl, в водном спиртовом растворе или с помощью основания.

Промежуточные продукты для получения соединений формулы I, в которых A замещен -CN, включают природные соединения. Например, соединения формул XI и XII


могут быть получены в виде изолятов из культур штамма гриба F92-4471/08, депонированного в соответствии с Будапештским соглашением в Коллекции культур департамента сельского хозяйства США (NRRL) 2 июля 1993 г. и получившего регистрационный номер NRRL 21123. Характеристики штамма гриба F92-4471/08 и выделение соединений XI и XII подробно описаны в международной заявке WO 96/03430.

Соединения по изобретению могут быть получены также путем химического синтеза, например, с использованием общепринятых методов синтеза пептидов. Обычно конечной стадией при получении соединений является стадия циклизации, при которой линейный пептид или пептолид, содержащий остатки кислот A, B, R₁Leu, Leu, C, X или Y, связанные друг с другом соответствующим образом, циклизуют с помощью реакции, приводящей к образованию амидной или сложноэфирной связи.

Таким образом, изобретение относится к способу получения циклического пептолида формулы I, включающему циклизацию линейного пептида или пептолида, содержащего остатки кислот A, B, R₁Leu, Leu, C, X или Y, связанные друг с другом соответствующим образом.

Соединения по изобретению обладают фармакологической активностью и, следовательно, пригодны для применения в качестве фармацевтических препаратов. В частности, соединения по изобретению являются ингибиторами стимулированной экспрессии молекул клеточной адгезии, прежде всего эффективными ингибиторами экспрессии VCAM-1 по сравнению с E-селектином и ICAM-1. В частности, соединения по изобретению также являются ингибиторами высвобождения TNF, например, ингибиторами высвобождения TNF.
Исследования, которые могут применяться для выявления ингибирования экспрессии ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина и для выявления ингибирования высвобождения TNF соединениями по изобретению, описаны ниже в примерах.

Таким образом, с точки зрения их активности в качестве ингибиторов экспрессии молекул клеточной адгезии соединения пригодны для лечения или профилактики болезненных состояний, которые вызывают экспрессию молекул клеточной адгезии. Эти болезненные состояния включают целый ряд приобретенных и врожденных заболеваний/расстройств, при которых происходит активация лейкоцитов, а их транспорт играет основную роль в патогенном процессе, в том числе большинство известных острых и хронических воспалений (например, аллергию, астму, дерматит, псориаз, повреждение при реперфузии и септический шок), аутоиммунные состояния (например, диабет, рассеянный склероз и ревматоидный артрит) и опосредованную иммунной системой нейродегенерацию (например, приобретенные нарушения, связанные с иммунодефицитом). Другие показания для соединений по изобретению включают метастаз опухоли (например, меланомы, остеокарциномы), атеросклероз и отторжение аллотрансплантата/ксенотрансплантата, поскольку известно, что ингибирование молекул сосудистой адгезии может в значительной степени улучшить прогноз в отношении этих процессов.

Соединения по изобретению также обладают терапевтическим потенциалом в отношении гиперпролиферативных заболеваний кожи (например, псориаза), а также различных злокачественных заболеваний, принимая во внимание их ингибирующую активность в субмикромолярных концентрациях, которая выявлена при тестировании в течение 72 ч в опытах по изучению пролиферации кератиноцитов, а также других клеток.

Соединения по изобретению обладают активностью в отношении ингибирования ВИЧ, индуцированного TNF /IL-6, в клеточной линии моноцитов U1, что показано с помощью метода p24 ELISA, и, следовательно, пригодны для лечения заболеваний, связанных с иммунодефицитом, и заболеваний вирусной этиологии, прежде всего для лечения СПИДа.

Таким образом, принимая во внимание их активность в качестве ингибиторов высвобождения TNF, соединения по изобретению пригодны для профилактики и лечения заболеваний или патологических состояний, опосредованных TNF, прежде всего TNF , например, воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, тяжелых инфекций и отторжений трансплантата органа или ткани, включая как отторжение аллотрансплантата, так и ксенотрансплантата, например, для лечения реципиентов, имеющих трансплантаты сердца, легкого, комбинации сердце-легкое, печени, почки, панкреатической железы, кожи или роговицы, и для предупреждения реакции "трансплантат против хозяина", такой, как возникающая после трансплантаций костного мозга.

Соединения по изобретению особенно пригодны для лечения, предупреждения или уменьшения интенсивности заболевания и воспалительных состояний, в частности, воспалительных состояний, этиология которых включает аутоиммунный компонент, таких, как артрит (например, ревматоидный артрит, хронический прогрессирующий артрит и деформирующий артрит) и ревматические заболевания. Конкретные аутоиммунные заболевания, для которых могут применяться соединения по изобретению, включают аутоиммунные гематологические расстройства (включая, например, гемолитическую анемию, апластическую анемию, чистую анемию красных клеток и идиопатическую тромбоцитопению), красную волчанку, полихондрит, склеродому, гранулематоз Вегенера, дерматомиозит, хронический активный гепатит, тяжелую псевдопаралитическую миастению, псориаз, синдром Стивенса-Джонсона, идиопатическую спру, аутоиммунное воспалительное заболевание пищеварительного тракта (включая, например, язвенный колит и болезнь Крона), эндокринную офталмопатию, болезнь Грейвса, саркоидоз, рассеянный склероз, первичный билиарный цирроз, юношеский диабет (сахарный диабет типа I), увеит (передней и задней сосудистой оболочки глазного яблока), кератоконъюнктивит сухой и весенний кератоконъюнктивит, интерстициальный фиброз легкого, псориатический артрит и гломерулонефрит (без нефротического синдрома или с нефротическим синдромом, например, включающим идиопатический нефротический синдром или минимальное изменение нефропатии).

Соединения по изобретению также пригодны для лечения, предупреждения или улучшения симптомов астмы, бронхита, пневмокониоза, эмфиземы легкого и других обструктивных или воспалительных заболеваний дыхательных путей.

Соединения по изобретению пригодны для лечения нежелательных острых и гиперактивных воспалительных реакций, которые опосредованы TNF, прежде всего TNF , например, таких, как острые инфекции, в том числе септический шок (например, эндотоксический шок и респираторный дистресс-синдром взрослых), менингит, пневмония; и тяжелые ожоги; а также для лечения кахексии или синдрома истощения, связанного с патологическим высвобождением TNF, в результате инфекции, рака или дисфункции органа, прежде всего, связанной со СПИДом кахексии, например, связанной с ВИЧ-инфекцией или обусловленной ей.

Таким образом, изобретение также относится к терапевтическим композициям, содержащим соединения по изобретению и их терапевтическое применение.

В частности, изобретение относится к способам лечения или профилактики заболевания, при котором происходит экспрессия молекул адгезии, включающим введение пациенту терапевтически эффективного или эффективного с точки зрения профилактики количества соединения по изобретению.

В изобретении также предлагаются терапевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество соединения по изобретению.

Кроме того, изобретение относится к применению соединения по изобретению для изготовления лекарственных средств, предназначенных для лечения или профилактики заболеваний, при которых происходит экспрессия молекул адгезии.

В частности, изобретение также относится к нескольким дополнительным объектам, которыми являются следующие.

А. Способ ингибирования производства растворимого TNF, прежде всего ТНФ , или уменьшения воспаления у пациента (т.е. у млекопитающего, прежде всего у человека), нуждающегося в таком лечении, включающий введение этому пациенту эффективного количества соединения по изобретению, или способ лечения любого из вышеуказанных состояний, в частности, способ лечения воспалительного или аутоиммунного заболевания или состояния, например, рассеянного склероза или ревматоидного артрита, или облегчения одного или нескольких симптомов любого из вышеуказанных состояний.

Б. Соединение по изобретению для применения в качестве фармацевтического препарата, например, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или патологических состояний, опосредованных TNF, например, в качестве иммуннодепрессанта или противовоспалительного агента, или для применения с целью предупреждения, уменьшения интенсивности или лечения любого заболевания или состояния, описанного выше, например, аутоиммунного или воспалительного заболевания или состояния.

В. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по изобретению вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, например, предназначенная для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или патологических состояний, опосредованных TNF, например, в качестве иммуннодепрессанта или противовоспалительного агента, или для применения с целью предупреждения, уменьшения интенсивности или лечения любого заболевания или состояния, описанного выше, например, аутоиммунного или воспалительного заболевания или состояния.

Г. Применение соединения по изобретению при изготовлении лекарственного средства, предназначенного для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или патологических состояний, опосредованных TNF, например, в качестве иммуннодепрессанта или противовоспалительного агента, или для применения с целью предупреждения, уменьшения интенсивности или лечения любого заболевания или состояния, описанного выше, например, аутоиммунного или воспалительного заболевания или состояния.

Композиции могут быть предназначены для парентерального, орального введения, для применения в виде аэрозоля, для ингаляции или для местного нанесения и обычно включают один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или эксципиентов и могут содержать добавки, такие, как стабилизаторы и т.п.

Применяемые дозы соединений могут изменяться в зависимости от состояния или заболевания, подлежащего лечению, в зависимости от того, применяются ли они для лечения или профилактики, в том числе в зависимости от механизма и пути введения. В целом, хотя удовлетворительные результаты получают при введении оральным путем доз от приблизительно 0,05 до приблизительно 10 мг/кг/день, предпочтительно применять от приблизительно 0,1 до приблизительно 7,5 мг/кг/день, более предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мг/кг/день, при использовании однократных или разделенных доз (2-4 раза в день). Альтернативно этому для парентерального введения, например, с помощью капельного внутривенного вливания или инфузии, могут применяться дозы от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мг/кг/день, предпочтительно от приблизительно 0,05 до приблизительно 1 мг/кг/день и более предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 1,0 мг/кг/день.

Таким образом, приемлемые суточные дозы для больных людей составляют от приблизительно 2,5 до приблизительно 500 мг перорально, предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 250 мг перорально, более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 100 мг перорально; или от приблизительно 0,5 до приблизительно 250 мг внутривенно, предпочтительно от приблизительно 2,5 до приблизительно 125 мг внутривенно и более предпочтительно от приблизительно 2,5 до приблизительно 50 мг внутривенно.

Соединения можно вводить с помощью любого принятого метода, в том числе энтерально, парентерально или местно либо с помощью ингалятора. Приемлемыми формами для энтерального введения являются растворы для питья, таблетки или капсулы. Приемлемыми формами для парентерального введения являются инъецируемые растворы или суспензии. Приемлемые формы для местного нанесения включают кремы, лосьоны и т.п. в диапазоне концентраций соединения от 0,01 до 10%, предпочтительно от 0,1 до 1 мас.% в пересчете на массу таких композиций. Пригодные стандартные дозируемые формы для орального введения могут содержать от 1 до 50 мг соединения, обычно от 1 до 10 мг.

Ниже изобретение более подробно поясняется на примерах со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых показано:
на фиг. 1 - УФ-спектр соединения формулы VIII,
на фиг. 2 - ИК-спектр соединения формулы VIII,
на фиг. 3 - FD-масс-спектр соединения формулы VIII,
на фиг. 4 - FD-масс-спектр (с добавлением LiI) соединения формулы VIII и
на фиг. 5 - ¹H-ЯМР-спектр соединения формулы VIII в CDCl₃.

Примеры
Пример 1: Характеристики штамма F/94-499709 (DSM 10275)
Для получения характеристик штамма F/94-499709 используют следующую среду, где концентрации компонентов среды указаны в % в отношении массы к объему (мас. /об. ) в деионизированной воде, а тепловую стерилизацию осуществляют выдержкой в течение 20 мин при 121^oC:
MEA: 2%-ный экстракт солода, 0,4%-ный экстракт дрожжей, 2%-ный агар.

При точечной инокуляции на среду MEA в чашках Петри и при инкубации в темноте для штамма F/94-499709 получены следующие характеристики:
Оптимальная для роста температура составляет 24-30^oC.

После 14 дней инкубации колонии достигают диаметра 25-32 мм при 24^oC, 30-37 мм при 27^oC и 7-15 мм при 33^oC. При температуре выше 37^oC и ниже 13^oC не обнаружено никакого роста штамма F/94-499709.

Колонии, растущие в темноте при 27^oC, обычно имеют цвет от кремового до цвета светлой буйволовой кожи, сохраняют форму от относительно плоской до слегка вспученной с развившимся в центре небольшим и ограниченным воздушным мицелием с цветом от белесого до светло-серого. Радиальные бороздки могут становиться заметными, а при виде снизу более темные концентрические зоны могут быть преобладающими. В созревших культурах воздушный и субстратный мицелий в центральных частях колоний может стать темно-серым, в то время как края колоний сохраняют цвет от кремового до цвета светлой буйволовой кожи.

При микроскопическом исследовании не обнаружено никаких спорулирующих структур, и, следовательно, штамм F/94-499709 условно можно назвать mycelium sterilum (штаммом со стерильным мицелием).

Пример 2: Ферментация штамма F/94-499709
Для получения соединения формулы VIII путем ферментации штамма F/94-499709 пригодными для применения являются следующая среда и процессы. Если не указано иное, все концентрации компонентов среды указаны в % в отношении массы к объему (мас./об.) в деионизированной воде, а тепловую стерилизацию осуществляют выдержкой в течение 20 мин при 121^oC:
PCM: (предкультуральная и промежуточная культуральная среда): 2%-ный экстракт солода, 0,4%-ный экстракт дрожжей, 0,1%-ный агар.

PRM (продуцирующая среда): 2%-ный раствор крахмала, 0,5%-ный экстракт дрожжей, 2%-ная глюкоза, 2%-ный экстракт замоченной кукурузы, 0,5%-ный пептон, 0,2%-ный карбонат кальция.

Предкультуры получают путем оттаивания 2 мл выcеянной суспензии штамма F/94-499709, замороженной жидким азотом, внесения посевного материала в колбу Эрленмейера объемом 500 мл, содержащую 200 мл среды PCM, и инкубации при 24^oC в течение 7 дней на роторном шейкере при 200 об/мин.

Для получения первичной промежуточной культуры в каждую из четырнадцати колб Эрленмейера объемом 500 мл, содержащих по 200 мл PCM, в качестве посевного материала вносят 5 мл предкультуры.

Вторичные промежуточные культуры получают путем внесения в качестве посевного материала 1,4 л первичных промежуточных культур в каждый из двух 50-литровых ферментеров, содержащих PCM. Ферментацию проводят в течение 6 дней в следующих условиях: 24^oC, 1 л воздуха/мин/1 л среды, лопастные мешалки, вращающиеся со скоростью 150 об/мин, и давление 0,5 бар. Для получения соединения формулы VIII и родственных соединений 13 л вторичной промежуточной культуры вносят в качестве посевного материала в каждый из трех 500-литровых ферментеров, содержащих PRM. Ферментацию проводят в следующих условиях: 21^oC, 1 л воздуха/мин/1 л среды, лопастные мешалки, вращающиеся сначала со скоростью 100 об/мин с постепенным повышением скорости до 150 об/мин, и давление 0,5 бар. Через 96 ч собирают 1500 л продукта ферментации и объединяют для выделения целевого соединения формулы VIII и родственных соединений.

Пример 3: Выделение пептолида формулы VIII из штамма F/94-499709
Жидкую среду из 1500 л продукта ферментации вместе с 1700 л этилацетата гомогенизируют в реакторе типа Dispax и интенсивно перемешивают в течение 3 ч. Органическую фазу отделяют с помощью сепаратора типа Westfalia. Эту стадию экстракции повторяют и органические фазы совместно упаривают при пониженном давлении, получая 2745 г экстракта. Экстракт обезжиривают путем трехступенчатой экстракции с использованием 40 л смеси метанол/вода (9:1) и 40 л циклогексана. Метанольные фракции объединяют и упаривают досуха при пониженном давлении, получая 960 г обезжиренного экстракта. Этот экстракт хроматографируют на колонке, содержащей 15 кг сефадекса LH20 в растворе метанола, получая фракции общей массой 135 г, содержащие пептолид формулы VIII. 300 г силикагеля импрегнируют всей фракцией массой 135 г и импрегнированный силикагель затем добавляют в верхнюю часть колонки, содержащей 1,5 кг силикагеля фирмы Merk с зернистостью 0,04-0,063 мм и хроматографируют с использованием 1 л смеси метил-трет-бутиловый эфир/циклогексан в соотношении 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1, 3 л МТБЭ и 3 л смеси МТБЭ/метанол (95: 5). Фракцию объемом 1 л собирают и анализируют с помощью ЖХВР (жидкостная хроматография высокого разрешения) и ТСХ (тонкослойная хроматография). Фракции 8 и 9 объединяют и упаривают досуха. После кристаллизации из простого эфира получают 21,9 г чистого пептолида формулы VIII. Дальнейшая очистка маточного раствора и фракций 10-13 с помощью хроматографии на силикагеле H Merck (750 г), которую проводят аналогично описанному выше способу, позволяет получить дополнительную порцию кристаллического циклопептолида формулы VIII.

Установлено, что при очистке из простого эфира пептолид имеет температуру плавления (t_пл) 143-146^oC и оптическое вращение []²_D⁰ =-233,9^o (с = 0,908, метанол). Значение IC₅₀-показателя пептолид формулы VIII составляет приблизительно 2 нМ при определении VCAM-1 методом клеточного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Молекулярная формула: C₅₁H₈₃N₇O₉ (938,3)
УФ-спектр в метаноле: = 290 (5,4), 279 (5,08), 220 (38,1), 197 (55,7) (см. фиг. 1).

ИК (KBr)-спектр приведен на фиг. 2.

МС-БТЯ- спектр приведен на фиг. 3.

МС-БТЯ-спектр (с LiI) приведен на фиг. 4.

¹Н-ЯМР-спектр в CDCl₃ приведен на фиг. 5.

МТБЭ обозначает метил-трет-бутиловый эфир.

VCAM обозначает молекулу сосудистой адгезии.

Пример 4: Синтез N1'-дезметоксильного производного соединения формулы VIII
Раствор, содержащий 4,9 г соединения формулы VIII, растворяют в 3 мл метанола и добавляют 8 г палладия на угле (10%-ного). Смесь перемешивают в атмосфере водорода в течение 2 ч, промывают струей аргона, фильтруют и упаривают, получая указанное в заголовке соединение в виде бесцветной пены. Соединение анализируют с помощью тонкослойной хроматографии и ЯМР-спектроскопии, получая следующие результаты:
ТСХ: силикагель, толуол/метанол 9/1, Rf=0,28;
¹H-ЯМР (3 конформера 56:37:7, обозначенные символами ^*, ^o, ', приведены характеристические сигналы): 8,72^* (d, J=10 Гц, NH); 8,08 (s, br, индол, NH); 6,97^*, 6,90^o (2d, J=2 Гц, индол Н-2); 6,34^o (d, J=9,5 Гц, NH); 6,00^* (d, J=6,5 Гц, NH); 5,83' (d, NH); 5,32 (ddd, PrLeu -H); 5,12^o, 5,08^* (2q, J=7 Гц, молочная кислота Me); 4,50^* (dd, MeLeu -H); 4,10^* (ddd, Leu -H); 3,42 (q, J=7 Гц, MeAla -H); 3,43^o, 3,19^o, 3,12^*, 2,93^*, 2,53^*, 2,35^o (6s, NMe); 1,54^*, 1,50^o (2d, J=7 Гц, MeAla -H); 1,38^o, 1,24^* (2d, J=7 Гц, молочная кислота -Н); 0,57^*, -0,01^* (2d, J=6,5 Гц, Me); -0,19^* (ddd, Leu -H).

Пример 5: Синтез N1'-метильного производного соединения формулы VIII
Раствор, содержащий 5 мг продукта, полученного в примере 4, в 0,5 мл безводного ДМФ смешивают со 100 мл йодметана и добавляют раствор, содержащий 3 мг бис(триметилсилил)амида натрия в 0,3 мл ДМФ. После перемешивания реакционной смеси в течение 1,5 ч при комнатной температуре смесь сливают на 0,1М водный раствор HCl, экстрагируют этилацетатом и распределяют между этилацетатом и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу промывают соляным раствором, сушат над сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Неочищенный продукт очищают с помощью хроматографии на силикагеле (градиент: толуол/метанол в соотношении от 100/0,25 до 100/2,5), получая указанное в заголовке соединение в виде бесцветной пены. Соединение анализируют с помощью тонкослойной хроматографии и ЯМР- спектроскопии с получением следующих результатов:
ТСХ: силикагель, толуол/метанол 9/1, Rf=0,40;
¹H-ЯМР (2 конформера 60:40, обозначенные символами ^*, ^o, приведены характеристические сигналы): 8,72^* (d, J=10 Гц, NH); 6,79^*, 6,74^o (2s, индол, H-2); 6,35^o (d, J=9,5 Гц, NH); 5,98^* (d, J=6,5 Гц, NH); 5,32^o (ddd, PrLeu -H); 5,12^o, 5,08^* (2q, J=7 Гц, молочная кислота Me); 4,50^* (dd, MeLeu -H); 4,06^* (ddd, Leu -H); 3,73 (s, индол, NMe); 3,44^o, 3,19^o, 3,15^* 2,93^*, 2,53^*, 2,35^o (6s, NMe); 1,55^*, 1,51^o (2d, J=7 Гц, MeAla -H); 1,39^o, 1,24^* (2d, J= 7 Гц, молочная кислота -H); 0,57^*, -0,09^* (2d, J=6,5 Гц, Me); -0,32^* (ddd, Leu -H).

Пример 6: Метиловый эфир 5-[8,11-диизобутил-14-(1-метокси- 1H-индол-3-илметил)-7,13,9,20-тетраметил-5,17-бис(2-метилгексил)- 3,6,9,12,15,18,21-гептаоксо-1-окса-4,7,10,13,16,19- гексаазациклогенеикос-2-ил]-пент-2-еновой кислоты
Раствор, содержащий 185 мг соединения формулы XV (см. ниже) и 1,26 г метоксикарбонилметилентрифенилфосфорана в толуоле, перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем растворитель выпаривают в вакууме, остаток хроматографируют на колонке для гель-фильтрации типа LH-20 в метаноле, фракции, содержащие продукт, упаривают в вакууме и дополнительно очищают с помощью хроматографии на силикагеле (элюент: градиент смеси толуол/метанол от 99,5/0,5 до 96/4), получая указанный в заголовке продукт в виде бесцветной твердой пены. Этот продукт подвергают лиофилизации из бензола.

¹H-ЯМР (CDCl₃ характеристические сигналы, 3 конформера 53:41: 6, обозначенные символами ^*, ^o, '): 8,67^* (d, J=10 Гц, C₉AA NH); 7,87^* (d, J=10 Гц, C₉AA NH); 7,80^o (d, J=10 Гц, NH); 7,69^o (d, J=10 Гц, NH); 7,45-7,35 (4d, MeMe ОТrр H-4', H-7'); 7,23^*, 7,22^o (2m, MeMe ОТrр Н-6'); 7,4 (2m, MeMe ОТrр H-5'); 7,06^*, 7,00^o (2s, MeMeОТrр H-2'); 6,88^o (ddd, J=15 Гц, J=7 Гц, -CH=); 6,76^* (ddd, J=15 Гц, J=7 Гц, -CH=); 6,24^o (d, J=10 Гц, Leu NH); 6,04^* (d, J= 6 Гц, Leu NH); 5,82^o, 5,78^* (2d, J=15 Гц, =CH-CO); 5,29^o (ddd, MeAla -H); 5,07-4,98 (m, -H); 4,92 (dd, MeМеОТrр -Н); 4,86^* (ddd, C₉AA -Н); 4,78^* (dd, Leu -H); 4,71 (m, -H); 4,48^* (dd, MeLeu -H); 4,17^* (ddd, Leu -H); 4,06^*, 4,03', 4,02^o (3s, N-OMe); 3,75^*, 3,74^o (2s, COOMe); 3,43^o (s, N-Me); 3,20^* (s, MeAla NMe); 3,17^o (s, N-Me); 2,92^* (s, MeMeОТrр-N-Me); 2,52^* (s, MeLeu N-Me); 2,47^o (s, N-Me); 1,51^*, 1,48^o (2d, J=7 Гц, MeAla -Me); 1,04 (d, J=6...5 Гц, MeLeu Me); 0,98-0,84 (m); 0,63^* (d, J=6,6 Гц, Leu Me); 0,56', 0,39' (2d); 0,06^* (d, J=6,6 Гц, Leu Me); -0,11 (ddd, Leu -CH).

Работая аналогично примеру 6, получают этиловый эфир.

Исходный продукт формулы XV

является известным (WO 96/03430). В этой формуле заместители имеют следующие значения:
B' означает

X означает

C' означает

Y' означает

В следующих примерах 7-11 применяют такие же сокращения, за исключением того, что
A'' означает

C'' означает

Пример 7: Соединение формулы IX
(т. е. соединение формулы I, в котором A означает A'', R₈ означает тиазол-2-ил, B означает В', R₁ означает CH₃, C означает C'', R₃ означает OCH₃, символ означает двойную связь, X означает X', Y означает Y').

Раствор, содержащий 400 мг соединения формулы I, в котором A означает A'', R₈ означает -CSNH₂, B означает В', R₁ означает CH₃, C означает C'', R₃ означает OCH₃, символ означает двойную связь, X означает X', Y означает Y', и 0,5 мл гидрата хлорацетальдегида в 8 мл безводного диметилформамида перемешивают с 0,5 г молекулярных сит с размером пор 4 и нагревают до 60^oC в течение 5 ч. Затем смесь разбавляют этилацетатом, фильтруют и экстрагируют 0,1 н. HCl. Органическую фазу промывают соляным раствором, сушат и упаривают в вакууме. Сырой продукт очищают с помощью хроматографии на силикагеле (элюент: градиент смеси толуол/метанол от 99,5/0,5 до 98/2), получая указанное в заголовке соединение в виде твердой пены.

Работая аналогично примеру 7, получают следующие соединения формулы I (A означает A'', В означает В', R₁ означает CH₃, C означает C'', R₃ означает OCH₃, символ означает двойную связь, X означает X', Y означает Y') (табл. 1).

Исходный продукт, т.е. соединение формулы I, в котором A означает A'', R₈ означает -CSNH₂, В означает В', R₁ означает CH₃, C означает C', R₄ означает OCH₃, символ означает двойную связь, X означает X', Y означает Y', получают следующим образом.

Раствор, содержащий 1,1 г соединения формулы XI (A обозначает остаток -гидроксизамещенной масляной кислоты, -замещенный -CN, В означает В', R₁ означает CH₃, C означает C', R₄ означает OCH₃, символ означает двойную связь, X означает X', Y означает Y') и 1,8 г дифенилфосфиндитионовой кислоты в 25 мл изопропанола, нагревают с обратным холодильником в течение 7 ч. Реакционную смесь упаривают в вакууме, растворяют в этилацетате и экстрагируют раствором бикарбоната натрия и соляным раствором. После выпаривания органического слоя сырой продукт очищают с помощью хроматографии на силикагеле (элюент: градиент смеси толуол/метанол от 99,5/0,5 до 98/2), получая исходное соединение в виде бесцветной пены.

Соединения из примеров 4-11 обладают активностью, аналогичной таковой соединения формулы VIII при определении VCAM-1 методом клеточного ELISA.

¹H-ЯМР-спектр (CDCL₃)
Примеры
7. 3 конформера 46:51:3, обозначенные символами ^*, ^o, ': 8,70^* (d, J=10 Гц, LeuPr NH); 7,89^* (d, J=10 Гц, NH); 7,83^o (d, J=9 Гц, NH); 7,69, 7,66 (2d, J=3,3 Гц, тиазол Н); 7,58 (d, J=10 Гц, NH); 7,53^*, 7,47^o (2dm, J=7 Гц, MeТrрOMe Н-4'); 7,38^*, 7,37^o (2dm, J=8 Гц, MeТrрOMe Н-7'); 7,22^*, 7,20^o (2tm, MeТrрOMe, Н-6'); 7,17, 7,16 (2d, J=3,3 Гц, тиазол Н); 7,09 (s, MeТrрOMe Н-2'); 7,03^*, 7,00^o (2dd, MeТrрOMe Н-5'); 6,98^o (s, MeТrрOMe Н-2'); 6,18^o (d, J=10 Гц, Leu NH); 6,03^* (d, J=7 Гц, Leu NH); 5,80' (d, J=10 Гц, Leu NH); 5,30^o (ddd, LeuPr -H); 5,11^* (dd, гидроксимасляная кислота -H); 5,05-4,98 (m, -Н); 4,94 (dd, MeТrрOMe -H); 4,86^o (ddd, LeuPr -H); 4,73 (m, -H); 4,49^* (dd, MeLeu -H); 4,23^* (ddd, Leu -H); 4,02, 4,00 (2s, N-OMe); 3,84^o (m, -H); 3,59-3,40 (m); 3,38 (q, J=7 Гц, MeAla -H); 3,33 (s, N-Me); 3,2-2,85 (m); 3,21 (s, N-Me); 3,07 (s, N-Me); 2,93^* (s, MeТrрOMe N-Me); 2,53^* (s, MeLeu N-Me); 2,49 (s, N-Me); 2,43- 2,28 (m); 2,18 (m); 1,98 (m); 1,81 (m); 1,7-1,1 (m); 1,48, 1,46 (2d, J=7 Гц, MeAla -Me); 1,06^* (d, J= 6,5 Гц, MeLeu Me); 1,00- 0,84 (m); 0,61^* (d, J=6,6 Гц, Leu Me); 0,54' (d, J=6,6 Гц, Leu Me); 0,35' (d, J=6,6 Гц, Leu Me); 0,10^* (d, J=6,6 Гц, Leu Me); -0,12^* (ddd, Leu -CH).

8. 3 конформера 47:48:5, обозначенные символами ^*, ^o, ': 8,64^* (d, J=10 Гц, LeuPr NH); 7,82 (2d, J=10 Гц, NH); 7,63^o (d, J=10 Гц, NH); 7,23, 7,17, 7,08, 6,97 (4t, аром. H); 7,32, 7,28 (2s, тиазол H); 7,07 (s, MeТrрOMe Н-2'); 6,81 (s, MeТrрOMe H-2'); 6,22^o (d, J=10 Гц, Leu NH); 6,07^* (d, J=7 Гц, Leu NH); 5,80' (d, J=10 Гц, Leu NH); 5,29^o (ddd, LeuPr -H); 5,20^* (dd, MeТrрOMe -H); 5,12^o (dd, гидроксимасляная кислота -H); 5,03^o (ddd, LeuPr -H); 4,97^* (ddd, LeuPr -H); 4,85 (m, гидроксимасляная кислота + LeuPr -H); 4,71^o (ddd, Leu -H); 4,52^* (dd, MeLeu -H); 4,21^* (ddd, Leu -H); 4,02, 3,90 (2s, N-OMe); 3,34 (s, N-Me); 3,22 (s, N-Me); 3,02 (s, N-Me); 2,93 (s, N-Me); 2,53 (s, N-Me); 2,48 (s, N-Me); 1,43, 1,42 (2d, J=7 Гц, MeAla -Ме); 1,06^* (d, J=6,5 Гц, MeLeu Me); 0,62^* (d, J=6,6 Гц, Leu Me); 0,10^* (d, J=6,6 Гц, Leu Me); -0,04^* (ddd, Leu -CH).

9. 3 конформера 42:52:6, обозначенные символами ^*, ^oC, ': 8,67 (d, J=10 Гц, LeuPr NH); 7,83, 7,80 (2d, J=10 Гц, NH); 7,63^o (d, J=10 Гц, NH); 7,55, 7,42, 7,39, 7,36 (4d, MeТrрOMe аром.); 7,22, 7,18, 7,05, 6,97 (4dd, MeТrрOMe H-5', Н-6'); 7,06^o (s, MeТrрOMe Н-2'); 6,88^* (s, MeТrрOMe Н-2'); 6,22^o (d, J= 10 Гц, Leu NH); 6,02^* (d, J=7 Гц, Leu NH); 5,77' (d, J=10 Гц, Leu NH); 5,30^o (ddd, LeuPr -H); 5,21^* (dd, MeТrрOMe -H); 5,0 (m, -H); 4,85 (m, -H); 4,65 (ddd, Leu -H); 4,49^* (dd, MeLeu -H); 4,13^* (ddd, Leu -H); 4,03, 3,98 (2s, N-OMe); 3,70 (m); 3,55 (m); 3,45
(q, J=7 Гц, MeAla -H); 3,37, 3,20, 3,11, 2,93, 2,52, 2,43 (6s, N-Me); 2,73 (m, тетрагидробензотиазол); 1,50, 1,48 (2d, J=7 Гц, MeAla -Me); 1,04^* (d, J= 6,5 Гц, MeLeu Me); 0,58^* (d, J=6,6 Гц, Leu Me); 0,50' (d, J=6,6 Гц, Leu Me); 0,30' (d, J=6,6 Гц, Leu Me); 0,03^* (d, J=6,6 Гц, Leu Me); -0,22^* (ddd, Leu -CH).

10. 3 конформера 44:51:5, обозначенные символами ^*, ^o, ': 8,66^* (d, J=10 Гц, LeuPr NH); 7,83, 7,81 (2d, J=10 Гц, NH); 7,63^o (d, J=10 Гц, NH); 7,57^*, 7,43^o, 7,38^*, 7,36^o (4d, J=8 Гц, индол-H); 7,21^*, 7,18^o, 7,05, 6,97 (4t, индол-H); 7,06^* (s, MeТrрOMe Н- 2'); 6,88^o (s, MeТrрOMe Н-2'); 6,70^o, 6,69^* (2q, J= 1 Гц, тиазол-H); 6,23^o (d, J=10 Гц, Leu NH); 6,05^o (d, J=7 Гц, Leu NH); 5,80' (d, J=10 Гц, Leu NH); 5,29^o (ddd, LeuPr -H); 5,11^o (dd, гидроксимасляная кислота -Н); 5,01 (m); 4,97 (dd, -H); 4,85 (m, 2х -Н); 4,69^o (ddd, Leu NH); 4,57' (dd, -H); 4,48^* (dd, MeLeu -H); 4,16^* (ddd, Leu -H); 4,03, 3,98 (2s, N-OMe); 3,43 (q, J=7 Гц, MeAla -H); 3,37, 3,20, 3,10, 2,92, 2,52, 2,46 (6s, N-Me); 2,40, 2,39 (2d, J=1 Гц, Me-тиазол); 1,48, 1,47 (2d, J=7 Гц, MeAla -Me); 1,05^* (d, J=6,5 Гц, MeLeu d-Me); 0,60^* (d, J= 6,6 Гц, Leu d-Me); 0,52', 0,33' (2d, J=6,5 Гц, Leu d-Me); 0,05^* (d, J=6,6 Гц, Leu d-Me); -0,14^* (ddd, Leu -CH).

11. 3 конформера 47:50:3, обозначенные символами ^*, ^o, ': 8,69 (d, J=10 Гц, LeuPr NH); 7,79, 7,78 (2d, J=10 Гц, NH); 7,65^o (d, J=10 Гц, NH); 7,51^*, 7,41^o, 7,39^*, 7,38^o (4d, J=8 Гц, индол-H); 7,23^*, 7,20^o, 7,07, 7,00 (4t, индол-H); 7,04^* (s, MeТrрOMe Н-2'); 6,85^o (s, MeТrрOMe Н-2'); 6,71^* (s, тиазол-H); 6,25^o (d, J=10 Гц, Leu NH); 6,04^* (d, J=7 Гц, Leu NH); 5,80' (d, J= 10 Гц, Leu NH); 5,30^o (ddd, LeuPr -H); 5,10^o (dd, гидроксимасляная кислота -Н); 5,02 (m); 4,97 (dd, -H); 4,85 (m, 2x -H); 4,72^o (ddd, Leu -H); 4,60' (dd, -H); 4,50^* (dd, MeLeu -H); 4,17^* (ddd, Leu -Н); 4,04, 4,00 (2s, N-OMe); 3,48 (q, J=7 Гц, MeAla -H); 3,41, 3,21, 3,17, 2,92, 2,53, 2,47 (6s, N-Me); 0,97, 0,96 (2s, трет-Bu-тиазол); 1,50, 1,49 (2d, J=7 Гц, MeAla -Me); 1,06^* (d, J=6,5 Гц, MeLeu d-Me); 0,62^* (d, J=6,6 Гц, Leu d-Me); 0,53', 0,35' (2d, J=6,5 Гц, Leu d-Me); 0,07^* (d, J=6,6 Гц, Leu d-Me); -0,08^* (ddd, Leu -CH).

А. 3 конформера 44: 30: 26, обозначенные символами ^*, ^o, ': 8,85 (d, CSNH₂); 8,60^* (d, LeuPr NH); 8,17 (d, CSNH₂); 8,03, 8,00 (2d, NH); 7,88 (m, CSNH₂); 7,6-7,1 (аром.); 6,28^* (d, 10 Гц, Leu NH); 6,07^o (d, 7 Гц, Leu NH); 5,87 (d, 9 Гц, Leu NH); 5,26^* (ddd, LeuPr -H); 5,22 (dd, гидроксимасляная кислота -Н); 5,15-4,95, 5,08^* (dd, гидроксимасляная кислота -H); 4,83^o (ddd, LeuPr -Н); 4,50^* (ddd, Leu -H); 4,37^* (dd, MeТrрOMe -H); 4,25^o (ddd, Leu -H); 4,09, 4,05, 4,03^* (3s, OMe); 3,89 (m, -Н); 3,65, 3,63', 3,52^o (3q, 7 Гц, MeAla -Н); 3,57 (m); 3,17, 3,16, 3,15, 3,22, 3,20, 3,05, 2,92, 2,55, 2,53 (9s, N-Me); 1,8-1,1, 1,05 (d, 7 Гц); 0,99-0,82, 0,60^o, 0,55', 0,23', 0,17^o (4d, 7 Гц, Leu d-Me); -0,15^o, -0,17' (ddd, Leu -CH). PKF 285-916 (тиазол)
Биологическая активность
Активность соединений по изобретению тестируют в отношении цитотоксичности и ингибирования экспрессии ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина, пролиферации клеток, а также в отношении ингибирования высвобождения TNF и связанной с этим цитотоксичности.

Анализы проводят следующим образом.

Клетки линии НаСаТ, случайным образом трансформированной, неонкогенной линии клеток кератиноцитов человека, у которой в значительной степени сохранились характеристики фенотипической дифференциации нормальных кератиноцитов (Boukamp и др., 1988 J. Cell Biol. 106, 761-771), применяют как для анализа пролиферации клеток, так и для анализа ICAM-1 методом клеточного ELISA.

А. Анализ ICAM-1 методом клеточного ELISA
I. Анализ ICAM-1 кератиноцитов методом клеточного ELISA
Анализ ICAM-1 методом клеточного ELISA применяют для определения ингибирования экспрессии ICAM-1 в основном аналогично методу, описанному у Winiski и Foster (1992, J. Invest. Dermatol., 99, 48-52). Клетки линии НаСаТ высевают на 96-луночные микротитрационные планшеты (2х10⁴ клеток/лунку в следующую культуральную среду: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM) с 5%-ной ФТС (фетальная телячья сыворотка), 100 ед./мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамином, 1 мМ пируватом натрия), выращивают до слияния и затем инкубируют в течение примерно 24 ч в свежей среде для анализа (такая же среда, как и культуральная, но содержащая 0,5% ФТС вместо 5%) с добавлением среды, стимулированной IFN- /TNF- (среда для анализа + 1000 ед. /мл IFN- /3 нг/мл TNF- ), или без нее в присутствии тестируемого соединения или без него. Затем среду отмывают и клеточные монослои фиксируют 1%-ным параформальдегидом. Монослои инкубируют с насыщающими количествами первичного антитела (мышиное анти-ICAM-1 моноклональное) и вторичного антитела (козлиное антимышиное, связанное с пероксидазой). Далее проводят пероксидазную реакцию с использованием в качестве субстрата 3- амино-9-этилкарбазоля (AEC) и получают нерастворимый, окрашенный продукт, который легко поддается измерению в стандартном аппарате для прочтения микротитрационных планшетов.

II. Оценка цитоксичности
По завершении реакции с использованием AEC для выявления ICAM-1 монослои НаСаТ промывают ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) (200 мл), ЗФР сбрасывают с планшетов, которые затем сушат концом бумажного полотенца для удаления избытка жидкости. Поверхность дна микротитрационных планшетов осторожно протирают полоской влажной ткани и затем вновь сушат полоской ткани и определяют абсорбцию при 492 нм. До того, как слои могут высохнуть, в каждую лунку добавляют 0,1 мл 0,1%-ного раствора кристаллического фиолетового в ЗФА (предварительно пропущенного через фильтр с диаметром пор 0,2 мм). Затем планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, тщательно пятикратно промывают ЗФР, избыток жидкости удаляют, как описано выше, и вновь определяют абсорбцию при 492 нм до того, как слои могут высохнуть. Разница между оптическими плотностями до и после окрашивания дает значения, полученные в результате окрашивания кристаллическим фиолетовым, и, следовательно, они связаны с величиной клеточного монослоя, присутствующего в лунках. Эти значения применяют для корректировки значений, полученных для AEC.

Б. Анализ VCAM-1, ICAM-1 и E-селектина в эндотелиальной клетке методом клеточного ELISA
Анализ основан на применении метода клеточного ELISA на 96-луночном планшете с использованием линии клеток эндотелия микрососудов человека (HMEC-1) и клеток эндотелия пупочной вены человека (HUVEC). Клетки предварительно обрабатывают в течение 4 ч тестируемым соединением, стимулируют в течение последующих 6-16 ч TNF , а затем фиксируют параформальдегидом для последующей оценки экспрессии VCAM-1, ICAM-1 и E-селектина методом непрямого иммунопероксидазного окрашивания. Цитотоксические воздействия определяют, подсчитывая относительное количество клеток (окрашивание ядра по Гимзе) после экспонирования тестируемыми соединениями, по сравнению с контрольными лунками (содержащими только растворитель и среду). Соединения рассматриваются как дающие положительную реакцию, если они ингибируют VCAM-1, ICAM-1 или E-селектин на 50%, при этом потеря клеток составляет <25%.

I. Линия клеток: Для анализа VCAM-1 и ICAM-1 используют иммортализованную (большим T-ангигеном вируса SV-40) линию клеток эндотелия микрососудов человека (HMEC-1; Ades и др., J. Invest. Dermatol. 99: 683-690, 1992). Клетки линии HMEC-1 постоянно экспрессируют низкие уровни ICAM-1, активируемые медиаторами воспаления. Однако они экспрессируют только VCAM-1 после стимуляции цитокином. Для определения оптимальных условий для индукции экспрессии VCAM-1 и ICAM-1 проводили эксперименты по определению зависимости реакции от дозы и от времени.

II. Условия выращивания: Клетки линии HMEC-1 выращивают в колбах типа T-75 (Nunc) в стандартных условиях (37^oC, 5% CO₂) из расчета 1,5х10⁶ клеток на мл культуральной среды (КС означает основную среду для эндотелиальных клеток [ЕВМ; фирма Clonetics], дополненная 10%-ной ФТС, 10 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста (EGF) (фирма Boehringer), 1 мг/мл гидрокортизона (фирма Sigma N 0888), 2,2 г/л NaHCO₃, 15 мМ Hepes, 0,11 г/л пирувата натрия, 4 мМ глютамином, 100 ед./мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина). После мягкой обработки трипсином (0,25%-ный трипсин + 0,1%-ная ЭДТК в течение 8 мин) и ресуспендирования клетки пересевают каждые 2-3 дня с коэффициентом разведения 1:3.

III. Метод клеточного ELISA для VCAM-1 и ICAM-1
96-луночные плоскодонные микротитрационные планшеты предварительно покрывают бычьим фибронектином (FN, фирма Sigma, N F1141), а затем засевают из расчета 2х10⁴ клеток/лунку в 200 мл среды для выращивания ЕВМ и инкубируют в течение ночи. На следующий день культуральную среду (КС) сначала заменяют из расчета 200 мл/лунку средой для анализа ЕВМ (КС, дополненная 5%-ной ФТС вместо 10%-ной) и затем заменяют 180 мл среды, содержащей либо (1) определенные концентрации тестируемого соединения, либо (2) соответствующие концентрации растворителя/среды, экстрагированной метанолом, либо (3) одну среду для анализа ЕВМ, и инкубируют в течение 4 ч при 37^oC. Каждый анализ 96-луночного планшета осуществляют с дублированием лунок. Затем клетки стимулируют, добавляя 20 мл концентрированного раствора цитокина (2000 ед./мл TNF ), и инкубируют в течение 16 ч при 37^oC.

После этого клеточный монослой промывают 1%-ным параформальдегидом в среде ЕВМ, фиксируют в 2%-ном параформальдегиде в течение 15 мин при комнатной температуре (КТ) и несколько раз промывают ЗФР. ЗФР удаляют с клеток и монослой инкубируют в течение 30 мин в ЗФР, содержащем 10%-ную нормальную козью сыворотку (NGS). Раствор NGS заменяют из расчета 100 мл/лунку моноклональным антителом к VCAM-1 или ICAM-1 и инкубируют при 4^oC в течение ночи. Раствор мАт (моноклональное антититело) затем удаляют и клетки несколько раз промывают ЗФР, а затем инкубируют с ЗФР, содержащим 10% NGS в течение 30-60 мин при КТ. Раствор NGS удаляют и добавляют 100 мл связанного с пероксидазой хрена козьего F(Ab')₂ антимышиного IgG антитела (фирма Tago; разбавление 1: 500 в ЗФР, содержащем 5% NGS) и планшеты инкубируют в течение 1 ч при КТ. Затем вторичное антитело удаляют и клетки промывают в ЗФР, который затем заменяют из расчета 150 мл/лунку свежеприготовленным и профильтрованным раствором AEC (3-амино-9-этилкарбазоль; фирма Sigma) и планшеты инкубируют в течение 45-60 мин при КТ. Субстрат для пероксидазы удаляют и клетки промывают в ЗФР. Значение абсорбции AEC определяют с помощью аппарата для прочтения микротитрационных планшетов при 550 нм и корректируют с учетом "чистых" или контрольных значений, полученных при 690 нм.

IV. Анализ Е-селектина
Анализ Е-селектина проводят с использованием свежевыделенных клеток линии HUVEC в основном аналогично тому, как это описано для анализа VCAM-1 и ICAM-1, за исключением более короткого времени стимуляции TNF (6-8 ч).

V. Оценка цитотоксичности (оценка потери клеток на основе окрашивания ядер)
Эндотелиальные клетки обесцвечивают путем замены ЗФР на 95%-ный этанол в течение 20 мин (две замены по 10 мин каждая), осуществляя контроль с помощью микроскопии. Затем клетки промывают дистиллированной водой (Aquadest) и монослой при КТ покрывают на 5 мин 33%-ным раствором Гимзе в Aquadest. Затем лунки промывают Aquadest и сушат на воздухе в течение по крайней мере 15 мин. Для контроля того, что окрашены только ядра и практически отсутствует окрашивание цитоплазмы, используют микроскопическое исследование. Значение абсорбции раствора Гимзе определяют с помощью аппарата для прочтения микротитрационных планшетов при 550 нм и корректируют с учетом "чистых" значений (ряды без клеток), полученных при 690 нм.

VI. Анализ данных
Значения AEC для конститутивной экспрессии VCAM-1 или Е-селектина (контрольные лунки без стимуляции) практически совпадают с таковыми для изотипически сходного контрольного мАт и представляют собой фоновую окраску. В каждом 96-луночном планшете среднее конститутивное значение вычитают из среднего значения AEC для каждой группы, стимулированной цитокином (контрольные группы с ЕВМ и растворителем, а также группа с тестируемым соединением), получая число, которое представляет собой экспрессию молекул клеточной адгезии (САМ), активированную в случае ICAM-1 и индуцированную в случае VCAM-1 или E-селектина (обозначенное как AEC-САМ). Каждое значение AEC-CAM затем делят на соответствующее среднее значение для раствора Гимзе, получая число, которое позволяет оценить относительные уровни экспрессии САМ при данной плотности клеток, основываясь на количестве ядер (обозначенное как отношение AEC:Гимзе)
AEC (стимуляция) - AEC (без стимуляции) = AEC-CAM,
AEC-САМ/Гимзе = отношение AEC:Гимзе.

Таким образом, "действительные значения" IC₅₀-показателя для САМ определяют путем сравнения значений AEC:Гимзе для тестируемого соединения со значением для стимулированного контроля (ЕВМ, растворитель). Эти значения затем анализируют относительно значений IC₅₀ для варианта только с раствором Гимзе. Точный критерий позволяет выявить удачный вариант взаимосвязи между ингибированием САМ и профилем цитотоксичности (с использованием раствора Гимзе), исследование которого может быть продолжено.

В. Анализ пролиферации клеток линии НаСаТ
Клетки линии НаСаТ культивируют в среде DMEM (фирма Gibco N 074-02100), дополненной 2,2 г/л NaHCO₃, 0,11 г/л пирувата натрия, 15 мМ Hepes, 5%-ной фетальной телячьей сывороткой (ФТС), пенициллином (100 ед./мл), стрептомицином (100 мг/мл) и глютамином (для повышения конечной концентрации до 4 мМ). Для анализа пролиферации клетки отделяют с помощью обработки трипсином, суспендируют в свежей среде и высевают на 96-луночные микротитрационные планшеты с конечной плотностью 4000 клеток/0,2 мл/лунку. Через 24 ч (день 0) среду заменяют свежей средой, содержащей ступенчато изменяющиеся концентрации тестируемого соединения. После трехдневной инкубации при 37^oC/5% CO₂ степень клеточной пролиферации в сравнении с таковой в контрольных группах, в которых использован только растворитель, оценивают колориметрическим методом, который позволяет измерить относительную клеточную массу с помощью красителя сульфородамина В (Skehan и др., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82, 1107-1112). "Исходное количество клеток" определяют измерением относительной клеточной массы в день 0. Результаты выражают в следующем виде: % ингибирования = 100% абсорбции в контроле (где контроль с растворителем = 100%) и выражают в виде среднего значения стандартное отклонение по трем измерениям. Кривую зависимости реакции от дозы строят в полулогарифмическом масштабе и с помощью линейной интерполяции определяют концентрацию, необходимую для ингибирования, составляющего половину от максимального (IC₅₀).

Максимальное ингибирование при отсутствии чистой потери клеток, которое представлено в виде "исходного количества клеток", обычно составляет 90-98%.

Г. Ингибирование высвобождения TNF
I. Одноядердные клетки получают из периферической крови здоровых добровольцев на основе разделения плотности в фиколе-гипаке в соответствии с методом Hansell и др. (J. Imm. Methods 1991, 145: 105) и применяют в концентрации 10⁵ клеток/лунку в среде RPMI 1640, дополненной 10%-ной ФТС. Клетки инкубируют с серийными разбавлениями тестируемых соединений в течение 30 мин при 37^oC перед добавлением INF (100 ед./мл) и LPS (5 мг/мл) и затем дополнительно инкубируют в течение 3 ч. Инкубацию прекращают путем центрифугирования при 1400 об/мин в течение 10 мин. Содержание TNF в супернатанте измеряют, используя коммерческий набор для ELISA (Innotest hTNF , поставляемый фирмой Innogenetics N.V., Zwijnaarde, Бельгия). Соединения тестируют в концентрациях от 0 до 10 мМ. Приведенные в примерах соединения формулы I, особенно предпочтительные соединения формул I, I'_p, I''_p, VII, IX и X, в этом опыте подавляют высвобождение TNF, причем значения IC₅₀ составляют от примерно 5 до примерно 1 нМ.

II. Цитотоксичность
Цитотоксичность определяют на клетках линии THP1 (510⁴ клеток/лунку), которые инкубируют в присутствии INF (100 ед./мл) и LPS (5 мг/мл) и в присутствии тестируемого соединения или без него в течение 24 ч при 37^oC. Проценты живых и мертвых клеток определяют с помощью колориметрического маркера (МТТ) [бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия] , который позволяет измерить митохондрильные дегидрогеназы в живых клетках, как описано у Mosman, J. Imm. Methods (1983) 65:55. Предпочтительные соединения по изобретению обычно обладают сравнительно низкой цитотоксичностью при оценке этим методом, например, значение IC₅₀ составляет от примерно 100 до 1000 нМ.

Формула изобретения

1. Циклогептапептолид формулы I в свободной форме, в форме соли или сложного эфира

где А обозначает остаток гликолевой кислоты, необязательно -замещенной метилом, этилом, необязательно замещенным тиазолом;
В обозначает остаток -аимно--метилзамещенной октановой кислоты;
R₁ обозначает метил;
С обозначает остаток N-метилтриптофана формулы II

где R₃ обозначает алкокси;
R₄ обозначает водород;
R₅ - метил;
символ обозначает двойную связь;
X обозначает остаток -аминозамещенной (C₂ - C₁₄)карбоновой кислоты;
Y обозначает остаток N-метил--аминозамещенной (C₂ - C₁₀)карбоновой кислоты.

2. Циклопептолид по п.1 формул VIII, IX или X



3. Терапевтическая композиция, обладающая цитотоксической активностью в отношении ингибирования экспрессии ICAM-1, VCAM-1 и Е-селектина, высвобождения TMF и пролиферации клеток, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п.1 или 2.

Приоритет по пунктам:
21.11.1995 - п.2 (формула VIII);
01.03.1996 - п.2 (формула IX);
04.07.1996 - п.2 (формула X).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6