Новые опиоидоподобные пептиды, способ их получения, фармацевтическая композиция
Описываются новые опиоидоподобные пептиды формулы I Х-R1-R2-R3-R4-N(Z)-Y, а также их соли, производные и аналоги, где Х - водород; R1 - Tyr; R2 - D-Ala или D-Arg; R3 - Phe (p-F); R4 - Phe или Phe (p-F); Y и Z представляют H. Новые соединения обладают анальгезирующей активностью периферического действия и избирательностью к подтипу -опиоидных рецепторов. Описываются также способ их получения, фармацевтическая композиция. 3 с. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл.
Настоящее изобретение относится к опиоидоподобным пептидным соединениям. Более конкретно, оно относится к опиоидоподобным пептидным соединениям, которые обладают анальгезирующей активностью периферического действия и избирательностью к подтипу -опиоидных рецепторов.
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/948.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/948.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/948.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/img_pat/36/364224.gif)
Y и Z - независимо представляют H, аралкил или C1-6-алкил. В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим соединения формулы (I) в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или вторым терапевтически активным агентом. В следующем аспекте, настоящее изобретение относится к способу устранения боли, предусматривающему введение млекопитающему, нуждающемуся в таком введении фармацевтически эффективного количества соединения формулы (I). В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к использованию соединения формулы (I) для получения болеутоляющего лекарственного препарата. Краткое описание чертежей
Фиг. 1, 2 и 4 иллюстрируют ингибирующее действие соединений настоящего изобретения в двух различных тестах, проводимых с использованием "горячей платформы". Фиг. 3 иллюстрирует ингибирующее действие H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH2 в тесте с использованием "горячей платформы". Фиг. 5 иллюстрирует ингибирующее действие соединений настоящего изобретения в тесте на резкие движения хвостом. Описание изобретения
В описании и формуле изобретения используются следующие общепринятые сокращения:
Ala - аланин
Arg - аргинин
Phe - фенилаланин
Ser - серин
Tyr - тирозин
TAPP - H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH2
GPI - подвздошная кишка морской свинки
MVD - мышь vas deferens
Phe(p-F) - пара-фторфенилаланин
HOBT - N-гидроксибензотиазол
BOP - бензотриазолил-N-окси-трис(диметиламино) фосфонийгексафторфосфат
DMF - диметилформамид
TFA - трифторуксусная кислота
tBU - трет-бутил
Pmc - 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил
FMOC - 9-флуоренилметилоксикарбонил
PBQ - фенил-пара-бензохинон. Величина "ED50", представленная в таблице для теста с PBQ-индуцированными судорогами, означает дозу лекарства, которая вызывает уменьшение количества судорог на 50% по сравнению с контролем. Величина "Ki", представленная в таблице 1 для анализа на связывание, означает константу ингибирования, полученную с использованием известного лиганда DAMGO для
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/948.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/948.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/948.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/img_pat/36/364225.gif)
а также их соли, производные и аналоги. X представляет H или метил, предпочтительно Н;
R1 представляет Tyr или 2'6'-диметилтирозин, предпочтительно Tyr, альфа-аминогруппа R1 замещена X с образованием аминогруппы, в случае если X представляет H, или алкиламиногруппы, если X представляет метил;
R2 представляет D-Ala или D-Arg, предпочтительно D-Ala;
R3 представляет Phe(p-F);
R4 представляет Phe или Phe(p-F), предпочтительно Phe;
Y и Z независимо представляют H, аралкил, такой как бензил, или C1-6-алкил, такой как метил, предпочтительно, чтобы Y и Z оба были Н. Соединениями настоящего изобретения являются следующие соединения, но не ограничиваются только ими:
Соединение # 1B H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2;
Соединение # 1C H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2;
Соединение # 2B H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2;
Соединение # 2C H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2. В предпочтительном варианте соединения настоящего изобретения выбираются из группы, включающей
Соединение # 1C H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2;
Соединение # 2C H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2. В более предпочтительном варианте соединением настоящего изобретения является
Соединение # 1C H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2. В опиоидных пептидных соединениях тирозин может быть заменен на аминокислотное производное 2'6'-диметилтирозин (Dmt). Эксперименты показали, что замена тирозина на Dmt в положении R1 первого аминокислотного остатка в общей формуле I увеличивает эффективность опиоидного пептида при связывании с
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/948.gif)
(i) пилюли, таблетки, капсулы или жидкость для перорального введения пациенту;
(ii) жидкость или мазь для введения путем ингаляции, чрескожно, интраназально, ректально или под язык;
(iii) раствор для внутривенного, парентерального, подкожного или внутрибрюшинного введения;
(iv) неоральный или парентеральный препарат пролонгированного действия. Настоящее изобретение также относится к способу устранения боли у млекопитающих, включая человека. Этот способ предусматривает введение фармацевтически эффективного количества пептида формулы I или его фармацевтически пригодной соли или композиции одним из традиционных способов, т.е. орально, парентерально, чрескожно иди через слизистые. В виде препарата пролонгированного действия с использованием биологически совместимого полимера или посредством направленной доставки в нужные ткани-мишени с использованием мицелл, гелей и липосом. Пептиды могут быть введены человеку в дозе от 0,01 до 100 мг/кг, предпочтительно от 0,05 до 20 мг/кг и наиболее предпочтительно от 0,1 до 1 мкг. Нижеследующие примеры приводятся для лучшего описания изобретения. Эти примеры представлены лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как некое ограничение изобретения. Пример 1
Получение 1C H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2
Синтетический пептид был получен с использованием смолы (полимерный носитель) Knorr. Использованные аминокислоты имели Fmoc-замещенные альфа-аминогруппы и tBU-защищенную боковую цепь тирозина. Диметилформамид, использованный на стадии присоединения, не содержал диметиламина. DMF, использованный на стадии отмывки, и TFA были биологически чистыми (Biograde). Для стадии очистки использовались очищенная H2O (USP) и ацетонитрил, очищенный с помощью ВЭЖХ. Все оставшиеся растворители были ACS (спектрофотометрически) чистыми и использовались без дополнительной очистки. Твердофазный синтез был проведен вручную на геле с нагрузкой в 0,84 мМоль/г. Конденсацию пептидов осуществляли с использованием по 1,5-2 эквивалента (каждого) Fmoc-аминокислоты, HOBT и BOP в DMF в течение 3-24 часов при комнатной температуре. Стадии по снятию Fmoc-защиты с альфа-аминогрупп были проведены с использованием 20% (v/v) пиперидина в DMF в течение 25 минут. Расщепление пептида и снятие защиты с боковых цепей осуществляли путем обработки TFA/CH2Cl2/анизолем. Пептидный полимерный носитель обрабатывали TFA в течение двух периодов по 90 минут при комнатной температуре в атмосфере азота. После отмывания CH2Cl2 и высушивания остаток обрабатывали этиловым эфиром, осадок фильтровали и осушали в условиях вакуума. Полученный неочищенный пептид был очищен с помощью ВЭЖХ на колонке C1810
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
Таким же методом были синтезированы следующие пептиды:
1A H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH2
1B H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2. Пример 2
Получение 2C H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2. Синтетический пептид был получен с использованием Knorr. Использованные аминокислоты имели Fmoc-защищенную альфа-аминогруппу, и Pmc-защищенную боковую цепь для D-аргинина, и tBU-защищенную боковую цепь для тирозина. Диметилформамид, использованный на стадии присоединения, не содержал диметиламина. DMF, использованный на стадии промывания, и TFA были биологически чистыми (Biograde). Для стадии очистки использовались USP-очищенная H2O и ацетонитрил, очищенный с помощью ВЭЖХ. Все оставшиеся растворители были ACS-чистыми и использовались как таковые без какой-либо очистки. Твердофазный синтез был проведен вручную на полимерном носителе с нагрузкой в 0,84 мМоль/г. Конденсацию пептидов осуществляли с использованием по 2 эквивалента (каждого): Fmoc-аминокислоты HOBT и BOP в DMF в течение 2 - 5 часов при комнатной температуре. Стадии снятия Fmoc-защиты с альфа-аминогрупп были проведены с использованием 20% (v/v) (объемные проценты) пиперидина в DMF в течение 25 минут. Отщепление пептида и снятие защиты с боковых цепей осуществляли путем обработки TFA/CH2Cl2/анизолем. Пептидный полимер обрабатывали TFA в течение двух периодов по 90 минут при комнатной температуре в атмосфере азота. После промывания CH2Cl2 и высушивания остаток обрабатывали этиловым эфиром, а осадок фильтровали и осушали в условиях вакуума. Полученный неочищенный пептид очищали с помощью ВЭЖХ на колонке C1810
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
2A H-Tyr-D-Arg-Phe-Phe-NH2
2B H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2. Пример 3
Анализ на связывание радиоактивного меченого лиганда
Подготовка мембраны
Самцов крыс Sprague-Dawley весом от 350 до 450 г умерщвляли путем ингаляции CO2. Крыс обезглавливали, и головной мозг без мозжечка извлекали, помещали в ледяной (охлажденной до температуры льда) солевой раствор, а затем гомогенизировали в 50 mM холодного (температуры льда) буфера трис (pH 7,4) (10 мл/мозга). Мембраны были центрифугированы при 14000 об/мин в течение 30 минут при 4oC. Осадки после центрифугирования ресуспендировали в 50 mM ледяного буфера Трис (pH 7,4), приблизительно в соотношении 6 мл/мозг, и помещали на хранение при -78oC вплоть до использования. Количественную оценку белка в гомогенате головного мозга проводили с использованием имеющегося в продаже набора для анализа белков (Bio-Rad). Ингибирование радиолиганда
(3H)-DAMGO и (3H)-DAGLE были использованы в качестве радиоактивных лигандов для
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/948.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
Тест с использованием "горячей платформы" (измерение анальгезирующей активности) проводили при 55oC. Для этого теста использовали самцов мыши CD # 1 весом от 20 до 25 г. Мыши были взвешены, помечены и разделены на группы по 10. Мышам была сделана подкожная инъекция соединения (или стандартного соединения, или среды) с объемом инъекции, эквивалентным 0,1 мл/10 г. р.с. (10 мл/кг). Мышей индивидуально оценивали по времени реакции на "горячей платформе". Температура горячей платформы (Sorel, модель DS37) составляла 55oC. У мыши наблюдались признаки дискомфорта, такие как облизывание или подергивание лап, попытка ухода (спрыгнуть с платформы) или дрожание. Время реакции регистрировали, когда появлялся одни из этих признаков, и выражали в "секундах". Каждую мышь наблюдали максимум в течение 30 секунд, чтобы предотвратить поражение ткани лапы. В каждом случае регистрации времени среднее время реакции в контрольной группе умножали на 1,5. Время реакции каждой тестируемой мыши сравнивали со "средним контрольным х 1,5". Если время реакции было меньше, чем "среднее контрольное х 1,5", то считали, что у мыши анальгезирующий эффект отсутствует. Если время реакции было выше, чем "среднее контрольное х 1,5", считали, что анальгезирующий эффект есть. Процент анальгезирующего действия соединения для данного времени теста определяли по числу анальгезированных (не чувствительных к боли) мышей в группе. Если процент анальгезирования был ниже 30%, то соединение считалось неактивным. Результаты показаны на фиг. 1-3. Пример 5
Тест с индуцированием судорог
Тест был проведен на самцах мыши CD # 1 весом от 18 до 22 г. Мыши были взвешены и помечены. Этим мышам инъецировали внутрибрюшинно (интраперитониально) 0,02% раствор фенилхинона в количестве 0,3 мл/20 г веса. Судороги, которые появлялись в течение 15 минутного периода времени после инъецирования, были подсчитаны. Фенилхинон подкожно инъецировали с интервалами времени в 5, 20 или 60 минут после введения соединения (или среды, или стандартного соединения). 0,02% раствор фенилхинона (2-фенил-1,4-бензохинон (Sigma)) был приготовлен следующим образом. 20 мг фенилхинона растворяли в 5 мл 90% этанола (Sigma, реактив, спирт). Растворенный фенилхинон медленно добавляли к 95 мл подогретой (не кипяченой) дистиллированной воды при постоянном встряхивании. Раствор фенилхинона выдерживали в течение 2 часов перед использованием и во всех случаях в условиях, защищенных от света. Каждый день для теста готовили новый раствор. Результаты опытов систематизированы в таблице. Можно видеть, что пептидные соединения настоящего изобретения, в том случае, если один или оба R3 или R4 представляют Phe (p-F), показывают более высокую селективность к
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/956.gif)
Тест с использованием горячей платформы (измерение анальгезирующей активности) проводили при 58oC. Для этого теста использовали самцов мыши NMRI весом от 20 до 25 г. Мыши были взвешены, помечены и разделены на группы по 6. Мышам была сделана подкожная инъекция соединения (или стандартного соединения, или среды) при объеме инъекции эквивалентом 0,1 мл/10 г. р.с. (10 мл/кг). Оценка времени реакции у мышей на горячей платформе была сделана индивидуально для каждой мыши. Температура горячей платформы (ПТС, Inc; модель 35-0) составляла 58oC. У мышей наблюдались признаки дискомфорта, такие как облизывание или подергивание лапы, попытка ухода (спрыгивания с платформы) или дрожание. Время реакции регистрировали, когда появлялся один из этих признаков, и выражали в "секундах". Каждую мышь наблюдали максимум в течение 20 секунд, чтобы предотвратить поражение ткани лапы. Считалось, что соединение обладает анальгезирующим действием, если время реакции имело статистически значимое (p<0,05; двухфакторный ANOVA (дисперсионный анализ), sigma slot) отличие от времени реакции контрольной группы. Результаты показаны на фиг. 4. Пример 7
Тест на резкие движения хвоста
Для осуществления этого теста использовали мышей-самцов NMRI весом от 20 до 25 г. Мышей взвешивали, помечали и разделяли на группы по 6. Мышам вводили подкожную инъекцию соединений (или стандартной среды при объеме инъекции, эквивалентном 0,1/10 г. р.с. (10 мл/кг)). Мышей индивидуально оценивали на время реакции в тесте на резкие движения хвоста. Латентный период времени до резкого движения хвостом измеряли в тот момент, когда регулируемый реостатом световой луч был направлен на кончик хвоста (ПТС Inc. Модель 33). Каждая мышь наблюдалась в течение максимум 10 секунд, чтобы предотвратить поражение тканей. Соединение считалось анальгетиком, если время реакции значительно отличалось (p<05, двухфакторный ANOVA (дисперсионный анализ), Sigma Stat) от времени реакции для контрольной группы. Результаты представлены на фиг. 5.
Формула изобретения
![](https://img.poleznayamodel.ru/img_pat/36/364226.gif)
а также его соли, производные и аналоги,
где X - водород;
R1 - Tyr;
R2 - D-Ala или D-Arg;
R3 - Phe (p-F);
R4 - Phe или Phe (p-F);
Y и Z независимо представляют H. 2. Соединение по п.1, где R2 представлен D-Ala. 3. Соединение по п.1, где R2 представлен D-Arg. 4. Соединение по п.1, где R4 представлен Phe. 5. Соединение по п.4, где R2 представлен D-Ala. 6. Соединение по п.4, где R2 представлен D-Arg. 7. Соединение по п.1, представляющее собой
H - Tyr - D - Ala - Phe (p-F) - Phe (p-F) - NH2. 8. Соединение по п.1, представляющее собой
H - Tyr - D - Ala - Phe (p-F) - Phe - NH2. 9. Соединение по п.1, представляющее собой
H - Tyr - D - Arg - Phe (p-F) - Phe (p-F) - NH2. 10. Соединение по п.1, представляющее собой
H - Tyr - D - Arg - Phe (p-F) - Phe - NH2. 11. Фармацевтическая композиция, обладающая анальгетической активностью, включающая эффективное количество соединения по любому из пп.1 - 10 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. 12. Соединения по любому из пп.1 - 10 полезные для изготовления препарата, эффективного для устранения боли. 13. Способ получения соединения по п.1 путем твердофазного синтеза. Приоритет по пунктам:
18.08.95 по пп.7 - 11;
07.11.95 по пп.1 - 6, 12 и 13.7
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6