Магнитные полимерные частицы на основе поливинилового спирта, способ их получения

 

Изобретение относится к магнитным, гранулообразным носителям, которые получают суспендированием содержащей магнитные коллоиды поливинилового спирта - полимерной фазы в органической фазе, которая содержит специальную смесь эмульгаторов. Получают частицы с размером частиц 1 - 8 мкм, которые могут химически связывать лиганды. Носители можно применять для выделения и обнаружения биомолекул, клеток, антител и нуклеиновых кислот. 2 с. и 13 з.п. ф-лы.

Предметом настоящего изобретения являются способы получения грануло- или шарообразных полимерных частиц на основе поливинилового спирта (PVAL), в которых заключен магнитный коллоид, придающий полимерным частицам магнитные свойства и способный связывать биомолекулы или клетки.

Магнитные полимерные частицы применяли в последние годы прежде всего в биохимии и медицине, главным образом, для отделения клеток, протеинов и нуклеиновых кислот. На основании магнитных свойств их можно использовать также как системы переноса для определенных лекарств в определенные области тела. Применение магнитных частиц, с точки зрения практики, дает большие преимущества по сравнению с традиционными системами отделения, так как существующие в большинстве случаев в виде тонких суспензий или эмульсий магнитные частицы можно легко отделять из смеси при помощи магнитных сил. Эта техника отделения делает излишним обычное центрифугирование. Далее, магнитную фракцию можно отделять в течение одной минуты, что, по сравнению с традиционными методами отделения при помощи хроматографической колонки, означает большую экономию времени. При последнем методе оказывают большое влияние прежде всего долговременное достижение равновесия и элюирование, следовательно, процессы, которые в технологии магнитного шарика практически неприемлемы. Другое значительное преимущество, которое отличает технологию магнитного шарика, заключается в кинетике реакции. Для сред наполнителей в колоночной хроматографии возвращаются, как правило, к размеру частиц 50-100 мкм. Однако, так как при таких размерах частиц емкости разделения часто недостаточно, возрастает тенденция по применению частиц с размером < 50 мкм и даже < 10 мкм. Чтобы противостоять высокому давлению, образовавшемуся при прохождении через колонку, такие среды практически не обладают пористостью, поэтому на практике нужно переходить от прозрачных колонок из пластмассы или стекла к устойчивым при сжатии стальным колонкам. Используемые для этого мощные насосные системы являются следующим недостатком современной техники колоночной хроматографии. Этих недостатков, которые, в конечном счете вызваны неудовлетворительной кинетикой превращения, можно полностью избежать, применяя технологию магнитных частиц.

Благодаря применению тонкодисперсных PVAL-частиц, которые имеют размер частиц 1-10 мкм, предпочтительно 1-4 мкм, частицы остаются в течение нескольких часов в суспендированном состоянии, так что кинетика превращения соответствует в некотором роде однородному раствору. Вследствие стойкой суспензии можно также в большинстве случаев отказаться от перемешивания или взбалтывания.

Способы получения магнитных микрочастиц из декстрана железа описаны в патенте США 4452773. Смешиванием солевого раствора Fe (II)- и Fe (III)- в присутствии определенного количества декстрана и последующим добавлением щелочи получают коллоидные частицы окиси Fe- с размером 30 - 40 нм, на которых адсорбирован декстран. Подобный способ описан в PCT заявке WO 90/07380. Солевые растворы Fe(II)- и Fe(III) - при добавлении декстрана обрабатывают при 40^oC и затем титруют при помощи NaOH, в результате чего получают суперпарамагнитные частицы размером 40 - 100 нм. Недостаток обоих способов, принимая во внимание быстрое и простое отделение, заключается в том, что из-за дисперсности частиц отделение можно осуществлять только при помощи высокоградиентного магнитного поля. Это высокоградиентное магнитное поле образовано разделительной колонкой, которая плотно наполнена стальными нитями или веществами из подобных микрочастиц и находится между полюсными наконечниками двух сильных электродов или ручных магнитов. Отделение частиц производят пропусканием суспензии через наполненную разделительную колонку. Отделение таких коллоидов невозможно при помощи традиционных ручных магнитов. Следовательно, принципиальные экспериментальные различия в традиционной технике хроматографии практически отсутствуют. Следующий недостаток известных способов получения заключается в том, что в результате описанных способов получения не получают стандартного размера частиц, такие частицы получают лишь фракционированным магнитным разделением. Кроме этого, затрудняет подтверждение наличия таких магнитных частиц то обстоятельство, что частицы невидимы под световым микроскопом. В другом способе, который описан в патенте США 4070246, магнитные частицы получают взаимодействием п-аминобензойной кислоты и альдегида при добавлении ферромагнитного порошка. Получение определенных гранулообразных частиц, которые требуются для диагностических тестов, при помощи этого способа невозможно. Химическое связывание биомолекул с носителем также невозможно. То же самое действительно также для описанных в патентах США 4106448, 4136683 и 4735796 способах получения магнитных частиц с включенным декстраном для диагностики и для лечения опухолей. В вышеназванных способах также не описано ковалентное связывание биомолекул. В патенте США 4647447 описано получение ферромагнитных частиц для диагностики методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР). При этом исходят или из солевых растворов Fe(II)/Fe(III), или непосредственно из ферритов в форме микрочастиц, которые в присутствии комплексообразователя в виде сывороточного альбумина, полисахаридов, декстрана или декстрина подвергают взаимодействию до получения магнитных суспензий. Другие ферромагнитные частицы, которые включены в силановую матрицу, рассматривают в патенте США 4628037. В качестве контрастного вещества для ЯМР-диагностики служат также суперпарамагнитные окиси железа, которые описаны в патенте США 4827945. Осаждением смесей солей Fe(II)/Fe(III) при помощи оснований в присутствии сывороточного альбумина, полипептидов или полисахаридов можно получать покрытые этими веществами магнитные частицы. Связыванием определенных антител с матрицей можно направлять магнитные частицы в определенные области тела (мишени). Получение окисей железа осаждением солей железа в присутствии, например, декстранов или полиглутаровых альдегидов описано в патентах США 2870740 и 4267234. Общим для всех вышеназванных способов и продуктов является то, что ферромагнитные или суперпарамагнитные частицы получают лишь осаждением солевого раствора железа, который предполагает определенное молярное соотношение солей Fe(II) и Fe (III) в присутствии комплексообразователя или покрывающего агента. Описанные частицы имеют более или менее широкое распределение размеров частиц. Определенные грануло- или шарообразные частицы нельзя получить при помощи вышеназванных способов. Описанные средства имеют более или менее аморфную геометрическую структуру. Из-за своей дисперсности, которая лежит всегда в нм-области, они применяются поэтому предпочтительно как контрастные вещества для ЯМР-диагностики или как индикаторы клеток. Кроме того, отделение магнитных фракций при помощи простых ручных магнитов, которые предпочтительны в быстрых диагностических тестах или в разделениях путем аффинной хроматографии, в большинстве случаев невозможны.

Получение магнитных микрочастиц альбумина или протеина, которые покрыты определенными связывающими агентами и которые можно применять для разделения вирусов и клеток, а также для диагностических тестов, описаны в патентах США 4345588; 4169804; 4115534; 4230685; 4247406 и 4357259.

Магнитные частицы с определенной гранулообразной структурой известны из патентов США 4861705. Предметом вышеназванного патента являются композитные частицы агарозы-полиальдегида, которые получают путем суспендирования полимерной фазы в масляной фазе. Примешиванием феррофлюидов, которые по определению представляют очень тонкие суперпарамагнитные, водные коллоиды окиси железа, к полимерной фазе получают магнитные полимерные частицы с размером частиц 40-1000 мкм.

Идеальные шарообразные частицы описаны в патенте США 4654267. Способ, в принципе, отличается от вышеназванных тем, что в качестве матрицы применяют полиакрилаты или полистирол, которые сначала посредством радикальной суспензионной полимеризации полимеризуют до гранулообразных частиц. Затем частицы набухают в органической фазе при определенных условиях. Происходит инкубирование полимерных частиц в солевом растворе Fe(II)/Fe(III), которые затем, после его диффундирования в частицы, окисляют при помощи аммиака до суперпарамагнитных окисей железа. Способ позволяет получить гранулообразные частицы с размерами частиц между 0,5 и 20 мкм. Способ связан с очень высокими техническими затратами. Наряду с применением высокотоксичных веществ затраты времени на получение основной матрицы составляют 10-30 часов. Далее требуются дополнительные нитро-, нитрозо- или аминогруппы, которые на дополнительной стадии получения вводят в полимерную матрицу, чтобы обеспечить достаточную абсорбцию Fe-солей. Основной недостаток описанных там частиц заключается в основном полимере полистироле. Полистирол является исключительно гидрофобным материалом, который при контакте с растворами протеина или другими биомолекулами имеет сильную склонность к неспецифической адсорбции, феномен, который имеет отрицательное значение особенно при иммуноанализах и в аффинной хроматографии. Недостатки вышеназванных способов относительно затрат на получение, геометрии частиц, магнитной способности при разделении, свойств полимерной матрицы или вида способа связывания можно избежать благодаря новому суспензионному "вода в масле" способу.

В качестве полимерной матрицы применяют поливиниловый спирт (PVAL), который в виде водного раствора суспендируют и сшивают в органической, не смешиваемой с водой фазе при перемешивании. Примеры для таких органических фаз известны из уровня техники суспензионной полимеризации. Для способа согласно изобретению применяют предпочтительно обычные в торговле растительные масла. Чтобы получать желательные магнитные свойства полимерных частиц, полимерную фазу перед суспензией смешивают с магнитным коллоидом, например, в виде порошков окиси железа или феррожидкостей и затем суспендируют в масляной фазе. Получение гранулообразных частиц PVAL путем суспендирования водного полимерного раствора описано в заявке на патент ФРГ 4127657. Добавлением магнитного порошка к полимерному раствору можно получать магнитные частицы. В описанном способе применяют полимерные растворы и масляные фазы, которые не содержат добавок в виде эмульгаторов или других поверхностно-активных веществ. Этим обусловлено то, что размеры частиц составляют всегда от 50 до 500 мкм. Размеры частиц при вышеназванных способах определяют, в первую очередь, вязкостью органической и/или полимерной фазы.

Целью настоящего изобретения являются, напротив, магнитные частицы, которые имеют размер в области 1-10 мкм, предпочтительно между 1-4 мкм, и имеют, кроме того, очень узкое распределение частиц по размерам. Только такие частицы могут применяться для маркировки и разделения клеток, для очистки биовеществ в суспензии, а также для диагностических анализов.

Неожиданно оказалось, что такие полимерные частицы можно получать добавлением определенных смесей эмульгаторов к масляной фазе. Понятие эмульгатор относится в последующем, с точки зрения определения как ограничительное понятие для всех поверхностно-активных веществ, к поверхностно-активным веществам, детергентам или стабилизаторам суспензии. Эмульгаторы, которые применяют как добавки для масляной фазы, представляют, например, блок-сополимеры окиси пропилена и окиси этилена, сложные эфиры жирной кислоты и сорбитана, комплексный смешанный сложный эфир из сложного эфира жирной кислоты и пентаэритрита с лимонной кислотой, производные полиэтиленгликоля и касторового масла, блок-сополимеры из производных касторового масла, полиэтиленгликоли, модифицированные сложные полиэфиры, сложные эфиры жирной кислоты и полиоксиэтилена и сорбитана, блок-сополимеры полиоксиэтилена, полиоксипропилена и этилендиамина, производные полиглицерила, производные полиоксиэтилена и спирта, производные алкилфенилполиэтиленгликоля, блоксополимеры полиоксижирной кислоты и полиэтиленгликоля, производные полиэтиленгликолевых эфиров. Вещества этого вида известны, в частности, в продаже под торговыми наименованиями: Плюроник, Сипероник, Тетроник, Тритон, Арлацел, Спан, Твин, Брий, Ренекс, Гипермер, Ламеформ, Дегимулс или Эвмулгин..

Принимая во внимание стандартные, гранулообразные полимерные частицы с требуемыми размерами частиц 1-10 мкм, неожиданно оказалось, что для масляной фазы вводят только одну смесь, по меньшей мере, двух, предпочтительно от трех до четырех поверхностно-активных веществ для требуемой спецификации частиц. Предпосылкой получения частиц требуемого размера является соответствующее уменьшение поверхностного натяжения фаз. Неожиданно это оказывается возможным благодаря смешиванию липофильной компоненты эмульгатора по меньшей мере с одним эмульгатором, который имеет полугидрофильные свойства, т. е. который растворим как в воде, так и в масле. Эмульгаторами, которые обладают указанными свойствами, являются, например: производные блок-сополимеров окиси этилена и окиси пропилена с преобладающим количеством окиси этилена, гексадециловый эфир полиэтиленгликоля, сложные короткоцепочечные эфиры полиоксиэтилена, сорбитана и жирной кислоты, полиэтиленгликоли или сложные короткоцепочечные эфиры сорбитана и жирной кислоты.

Концентрация эмульгаторов в масляной фазе составляет, как правило, 2-6 объем. %, предпочтительно 3,5-5,0 объем.%. Принимая во внимание дисперсность и узкое распределение размеров частиц полимерных капелек, преимущество имеют такие смеси эмульгаторов, которые содержат, по меньшей мере, две липофильные компоненты и один полугидрофильный эмульгатор. Концентрация полугидрофильного эмульгатора составляет, как правило, между 15 и 30 объем.% в пересчете на общее количество эмульгатора. Способы по изобретению, наряду с дисперсностью частиц, позволяют получать такие гранулообразные частицы, которые являются предпосылкой для гомогенной суспензии. Благодаря этому возможен точный отбор пипеткой, который требуется в биохимической аналитике/диагностике в медицине.

Наряду с эмульгаторами для масляной фазы специальные поверхностно-активные вещества, которые растворимы в водной полимерной фазе, также вносят свой вклад в улучшение качества суспензии прежде всего полимерных растворов с низкими молекулярными массами (20.000 - 80.000). Кроме того, неожиданно оказалось, что добавленные в твердом виде магнитные коллоиды легко образуют тонкую дисперсию лишь при добавлении ионных эмульгаторов. Примерами таких эмульгаторов, которые можно применять также как бинарные смеси, являются: сывороточный альбумин, желатин, алифатические и ароматические производные сульфокислоты, полиэтиленгликоли, поли-N-винилпирролидон или бутират ацетилцеллюлозы. Количества введенных эмульгаторов составляют, как правило, 0,01-2 вес.% в пересчете на полимерную фазу, причем концентрация ионных эмульгаторов составляет всегда от 0,01 от 0,05 вес.%.

Влияние скорости перемешивания, концентрации и вязкости обеих фаз на размер частиц, как показано в заявке ФРГ 4127657, в способе согласно изобретению при добавлении эмульгатора играет лишь второстепенную роль. Для получения требуемых размеров частиц 1 - 10 мкм достаточны скорости перемешивания 1500- 2000 об/мин, причем применяют обычные двухлопастные пропеллерные мешалки. Определенное влияние эмульгаторов согласно настоящему способу на размер частиц видно из того, что при снижении скорости перемешивания с 2000 до 1300 об/мин размеры частиц возрастают от 1-5 мкм до 2-8 мкм. При повышении скорости перемешивания с 2000 до 5000 об/мин практически не установлено никакого изменения размеров частиц. Напротив, размеры частиц, полученных по вышеназванному способу, изменяются при аналогичном изменении скоростей перемешивания от 10 до 80 мкм. Наблюдаемое в вышеназванном патенте влияние вязкостей как суспензионной фазы, так и полимерной фазы на размеры частиц сказывается в способе согласно изобретению, в противоположность влиянию эмульгаторов, только в минимальной степени. Так, размеры частиц PVAL колеблются при изменении вязкости полимерной фазы от 10 до 1000 мРа/сек, в способе по изобретению только между 2 и 8 мкм, при вышеназванном способе, при прочих одинаковых условиях, напротив, между 50 и 140 мкм.

В качестве магнитных частиц, которые включаются в полимерную матрицу во время процесса суспензионного сшивания, можно применять в принципе такие ферро- или суперпарамагнитные коллоиды, которые имеют соответствующий размер частиц и, как правило, магнитное насыщение 50 - 400 гаусс. Другим требованием, которому должны соответствовать магнитные частицы, является диспергируемость в водной полимерной фазе. В противоположность описанному в патенте США 4654267 способу получения магнитных частиц, в основе которого лежит связанный с затратами процесс набухания с солями железа и последующим окислением до магнитных коллоидов, в настоящем способе можно получать дисперсию магнитных коллоидов непосредственно в полимерной фазе. При последующем суспендировании в органической фазе магнитные коллоиды в этом случае одновременно включаются в полимерные капельки. Этот способ является определенно технологическим упрощением по сравнению с вышеназванным способом, с чем связана значительная экономия времени процесса получения. В то время как для получения вышеназванных средств на основе полистирола требуются время от 10 до 30 ч, при способе по изобретению требуется только 5 - 30 мин для получения основной магнитной частицы.

В качестве магнитных коллоидов применяют предпочтительно магнетиты с размерами частиц 10 - 200 нм, причем способ по изобретению не ограничен этим классом соединений. Такие вещества имеются в продаже под торговым наименованием Байферрокс или Феррофлюиды. Так как получение таких коллоидов соответствует общему уровню техники, магнитные частицы можно получать также известными способами, которые описаны, например, Шинкай и др., Биокатализ, т. 5, 1991, 61, Раймерс и Калафалла, патент Бразилии 1439031 или Кондо и др. , Appl. Microbiol. Biotechnol., т. 41, 1994, 99. Концентрации коллоидов в полимерной фазе соответственно в пересчете на полимерную фазу составляют, как правило, между 4 и 14 объем.% для коллоидов, которые получены уже в виде водных коллоидов, и 0,3-2 вес.% для твердых веществ. В процессе получения магнитные коллоиды примешивают непосредственно к полимерной фазе. Чтобы обеспечивать мелкодисперсное, равномерное распределение частиц, полезно осуществлять кратковременное перемешивание водной дисперсии при помощи диспергирующего устройства с большим числом оборотов в минуту (Ультра-Турракс) с последующей ультразвуковой обработкой. Необходимая для получения магнитных частиц полимерная фаза состоит, как правило, из 2,5 - 10 вес.% раствора PVAL. Как известно из заявки ФРГ 4127657, пористость полимерных частиц определяют, в конечном счете, плотностью клубка, которая, в свою очередь, зависит от средней молекулярной массы полимера и концентрации. Возрастающая молекулярная масса и/или пониженная концентрация полимера означает меньшую плотность клубка и тем самым возрастающую пористость. Так как практичность метода испытаний особенно в рамках обычных диагностических или аналитических способов зависит также от количества абсорбированных на количество носителя веществ, пористость играет существенную роль при изготовлении магнитных частиц как решающий параметр. Поэтому в средствах по изобретению применяют предпочтительно концентрацию полимера 2,5 - 5 вес.% и молекулярные массы > 50000. Полученные таким способом полимерные частицы имеют высокую пористость и соответственно высокую емкость связывания как относительно связанных с матрицей лигандов, так и для связанных лигандами лигатов или биомолекул. Другим фактором, который определяет пористость и, следовательно, также функционирование магнитных частиц, является выбор сшивающего агента и его концентрации. Принимая во внимание высокую загрузку, концентрацию сшивающего агента выбирают таким образом, чтобы обеспечить соответствующую пористость в сочетании с достаточной устойчивостью формы. В качестве сшивающих агентов применяют, в принципе, все водорастворимые, реагирующие с гидроксильными группами PVAL бифункциональные соединения, как, например, альдегиды, хлорангидриды кислоты или дивинилсульфон. Предпочтительно в качестве сшивающего агента применяют глутаровый альдегид при кислотном катализе, так как это вещество уже в течение нескольких минут реагирует с полимером с образованием прочно сшитых частиц. В случае других веществ требуется время реакции от одного до двух часов. Кроме того, применение глутарового альдегида неожиданно позволяет одновременным добавлением водорастворимого диамина, например этилендиамина или гексаметилендиамина, соответственно удлинять звено сшивающего агента на длину диаминовой цепи и повышать в результате этого пористость полимерной матрицы. Концентрация сшивающего агента, в пересчете на водную полимерную фазу, составляет, как правило, между 0,2 и 1 объем.% и для глутарового альдегида между 2 и 7 объем.%. Глутаровый альдегид применяют всегда в форме 6 - 25%-ного водного раствора. В случае диаминов их применяют, как правило, от 10 до 50 мол.% в пересчете на количество глутарового альдегида. Для получения магнитных частиц обычно используют сначала 20-25- кратное количество объема органической фазы, предпочтительно стандартного растительного масла, в котором затем суспендируют при перемешивании смесь полимера и магнитного коллоида. При этом добавление кислоты в случае сшивания глутаровым альдегидом определяет стабильность магнитного коллоида. Многие магнитные коллоиды при добавлении кислоты агломерируют. Неожиданно оказалось, что этого можно избежать, добавляя кислоту лишь во время или в конце процесса суспендирования. Так как магнитные коллоиды к этому моменту уже распределены мелкодисперсно в полимерной матрице, можно полностью избежать агломерации. В случае кислотостойких магнитных коллоидов кислоту можно также перед процессом суспендирования добавлять непосредственно в полимерную фазу. Добавление сшивающего агента происходит соответственно во время процесса суспендирования. Кроме описанных до сих пор, определяющих размер и геометрию частиц параметров неожиданно оказалось, что концентрация кислоты оказывает решающее влияние на суспендирование магнитных частиц. Хорошее суспендирование означает, что частицы полностью изолированы друг от друга и в водных растворах не образуют агломератов. Это свойство, определяющее длительность пребывания в суспендированном состоянии, обеспечивают концентрациями кислоты 15 - 50 объем.% в пересчете на полимерную фазу. Предпочтительно применяют 1-3 H HCl. Время пребывания в суспензии очень высоко соответственно для PVAL-частиц, оно составляет между 12 и 48 часами в противоположность 4 часам полистирольным шарикам из патента США 4654267. Для полученных таким способом магнитных частиц, особые преимущества которых выражены многими технологическими параметрами и такими свойствами, как пористость, размер частиц, магнитные свойства и химическая функциональность, открываются многочисленные возможности для применения, которые, в целом, недоступны для описанных до сих пор магнитных носителей. Благодаря высокой химической функциональности основного полимера PVAL в средствах согласно изобретению можно применять все способы активирования и связывания, известные для традиционных сред аффинной хроматографии. Примерами таких агентов активирования являются: BrCN, 2-фтор-1-метил-пиридин-толуол-4-сульфонат, 1,1'- карбонил-диимидазол, эпихлоргидрин, гексаметилендиизоцианат или 1-циано-4-диметиламино-пиридин-тетрафторборат. Соответствующие способы связывания биолигандов или биомолекул известны из общего уровня техники и описаны, например, в "Методы в энзимологии", т. 135, издатель К. Мозбах, 1987. Способы связывания в вышеназванном патенте США 4654267, напротив, ограничены активированием и связыванием карбоксильных групп. Кроме того, имеющиеся гидроксильные группы описанного основного полимера согласно изобретению неожиданно позволяют прививать виниловый мономер к полимерной матрице. В результате этой прививки можно вводить дополнительные функциональные молекулярные цепи (спейсерные молекулы). Связывание биомолекул с такими спейсерными молекулами ускоряет в целом получение нативной структуры и тем самым способствует биологической активности связанных биомолекул. Вследствие того что биомолекула больше не вступает в прямой контакт с поверхностью матрицы, пресекаются возможные изменения конформаций внутри биомолекулы. Прививку с виниловыми мономерами осуществляют при каталитическом действии солей Cr (IV), например, Cer (IV)-нитрата аммония или Cer (IV)-сульфата аммония, которые действуют как окислительно-восстановительные инициаторы для радикальной полимеризации. Соли Cer (IV) применяют предпочтительно в виде 0,03 - 0,1 молярных растворов в 0,5-1 H серной кислоте или азотной кислоте. В качестве виниловых мономеров применяют такие соединения, которые имеют функциональные или реактивные группы, например, в форме НО-, HOOC-, NH₂-, NCO-, СHO- или оксирановых групп. Относительно деталей известного способа прививки дается ссылка на способы, описанные в неакцептованных заявках на патенты ФРГ 2157902 и 3811042. Однако представленные полимерные матрицы согласно изобретению, в принципе, отличаются по своей физической и химической структуре, свойствам и возможностям применения от вышеназванных прививаемых матриц. Другое отличие от вышеназванных способов прививки заключается в том, что в средствах согласно изобретению работают, не исключая кислород, а также достаточно присутствия не смешиваемого с водой органического растворителя, как, например, гексана, гептана, циклогексана или петролейного эфира, чтобы получать высокий выход прививки. Кроме того, время прививки, по сравнению с вышеназванными способами, может сокращаться до 90%. Количество введенных виниловых мономеров изменяется от 10 до 50 объем.% в пересчете на суспензию магнитных частиц.

На основании разнообразных возможностей активирования и модификаций PVAL-магнитных частиц можно связывать с матрицей практически неограниченное число биомолекул. Имеются такие широкие возможности применения, которые простираются от медицинской диагностики до молекулярнобиологического анализа. Важное применение в области бионаук состоит в разделении по аффинному принципу. Однако применяемая обычно для этой цели колоночная техника связана со значительными экспериментальными затратами, так что прежде всего для небольших, обычных разделений желательны практические альтернативы. Средства по изобретению предлагают такие альтернативы, так как временные и технические затраты по сравнению с традиционными методами составляют ничтожную часть. В качестве лигандов могли бы использоваться основные на сегодняшний день лиганды, используемые в аффинной хроматографии. Примерами для этого, которые открывают интересные перспективы также с практической точки зрения, являются: протеин A, протеин G, гепарин, антитело, сывороточный альбумин, желатина, лизин, конкавалин A, олигосахариды, олигонуклеотиды или энзимы. Специальные разделения, которые можно проводить с такими аффинными матрицами, относятся к общему уровню техники. Относительно деталей этих известных способов дается ссылка на разработки в Журнале Хроматография, т. 510, 1990. Однако наряду с экспериментальным упрощением особое преимущество технологии магнитных частиц заключается в определенном сокращении времени разделения. Это обосновано тем, что суспензия магнитных частиц представляет в известной степени однородную фазу, которая делает кинетику превращения аналогичной однородному раствору. Таким способом можно осуществлять разделения без высоких затрат в зависимости от размера исходной смеси в течение 2 - 5 минут. Другой интересной областью, связанной с технологией магнитных частиц, является область диагностики, особенно область иммуноанализа. Другой основополагающий принцип заключается в том, чтобы количественно регистрировать специфические вещества. При этом качество обнаружения связано непосредственно со специфическим выделением соответствующего вещества, будь то хроматографическими способами или связыванием с полимерным твердым телом. На практике это осуществляют специфическим связыванием, как правило, через иммобилизированное антитело, которое затем анализируют фотометрией или нефелометрией. Разработанные недавно PVAL-среды предлагают теперь очень хорошую основу для применения иммуноанализов. Для этого антитела относительно определенных, релевантных для диагноза антигенов известным химическим способом связывают с магнитными частицами. Примеры таких антител: антиинсулин, антитироксин, антитело против тироидстимулирующего гормона (TSH), антитело против тироидсвязывающего глобулина, антикортизон, антиферритин, антихорионик-гонадотропин, антиканцерогенный эмбриональный антиген (CEA), антипрогестерон, антитестостерон, антиэстрадиол, антипролактин, человеческий антигормон роста, антидигоксин, анти- 2-микроглобулин, анти- 2-макроглобулин, антивитамин B12, антифактор VIII или анти-AFP. Продолжительность инкубационного периода магнитных частиц, связанных с антителом, со смесями веществ составляет, как правило, 2-5 минут. После магнитного отделения количество выделенных комплексов антитело-антиген обнаруживают фотометрией при помощи известных методов анализа. В результате применения технологии магнитных частиц можно сократить продолжительность инкубационного периода в 10 - 100 раз по сравнению с обычной техникой микротитровальных планшетов или разделения на колонках, как это описано в заявке ФРГ 4126436. Кроме антител другие вещества можно также связывать магнитными частицами и использовать для обнаружения определенных веществ. Таким веществом является 3-аминофенилбороновая кислота, которая связана с PVAL-матрицей и которую применяют для обнаружения содержания сахара в крови. Для иммобилизации лиганда PVAL-носитель на первой стадии активируют при помощи диизоцианатов. Затем происходит взаимодействие с лигандом. Для взаимодействия применяют, как правило, 15 - 30 мг 3-аминофенилбороновой кислоты на 100 мг магнитной фазы. Анализ содержания сахара в крови осуществляют через имеющийся в крови гликированный гемоглобин, который специфически связывается лигандом бороновой кислоты. Затем элюируют связанную гликированную фракцию с матрицы и определяют фракцию количественно при помощи фотометрических методов. Особым преимуществом по сравнению с более ранними методами испытаний являются меньшие технические затраты. Поэтому этот метод можно применять преимущественно для обычных анализов. Молекулярнобиологические анализы, особенно разработанные в последние годы в ходе новых терапевтических и диагностических мероприятий, представляют широкую область для применения PVAL- магнитных частиц. При многих аналитических способах в области молекулярной биологии используют высокое сродство между стрептавидином/авидином и биотином. Связыванием стрептавидина или авидина с полимерными твердыми фазами можно выделять биотинилированные биомолекулы каждого вида, как, например, ДНК-фрагменты, олигонуклеотиды, протеины, антитела или антигены. Применение PVAL-матрицы благодаря простой технике связывания в сочетании с высокой суспендирующей способностью позволяет в этом случае осуществлять такое разделение простым способом. Практические области применения, где можно преимущественно использовать технику магнитных шариков, представляют, например: последовательность ДНК-твердая фаза, ДНК-синтезы или цепные реакции полимеразы (PCR). Далее, PVAL-магнитные частицы путем связывания антител, которые направлены против определенных индикаторов клеток, например, анти-CD4, анти-CD15, анти-CD35, анти-CD8, позволяют осуществлять разделение клеток и введение меченых атомов (Labelling). Относительно деталей ссылаются на известную литературу: Гауканес и Крам, Биотехнология, т. 11, 1993, 60.

Изобретение поясняют подробнее следующими примерами.

Пример 1 Получают коллоид из магнетита аналогично методике Кондо и др., Appl. Microbiol Biotechnologie, т. 41, 1994, 99-105. 10 мл коллоида диспергируют в смеси, состоящей из 80 мл 10%-ного PVAL-раствора (средняя молярная масса 48.000), 5 мл 2,5%-ного раствора поливинилпирролидона, 20 мл 2 н. HCl и 0,4 мл 3,5 %-ного додецилсульфата Na. После одноминутной обработки в ультразвуковой ванне (100 ватт) смесь при 20^oC суспендируют при перемешивании в 2 литрах обычного растительного масла, которое содержит 2% Плюроник 6100, 0,8 % Плюроник 6200, 0,4% Дегимул FCE и 0,6% Дегимул HRE 7. Скорость перемешивания составляет 2000 об/мин. Через 10 с добавляют 6,4 мл 12 %-ного раствора глутарового альдегида. Перемешивают еще 20 с. После этого суспензию центрифугируют при 5000 g 30 с и масляную фазу декантируют. Оставшуюся суспензию промывают один раз приблизительно 300 мл н-гексана и метилэтилкетона. Полученную магнитную суспензию диспергируют приблизительно в 400 мл воды/метанола 1: 1 (объем/объем) и снова центрифугируют. После этого проводят 10-кратную промывку магнитной фракции диспергированием приблизительно в 400 мл воды соответственно с включением промежуточной стадии центрифугирования. Получают магнитные частицы с распределением размеров 2 - 4 мкм и с содержанием железа 7%. (Все %-данные здесь и ниже приведены в объем.%, поскольку речь идет о жидком веществе, и в вес.%, поскольку речь идет о твердом веществе).

Пример 2 5 мл магнитного коллоида по примеру 1 диспергируют в 40 мл PVAL-фазы по примеру 1 и затем в 880 мл имеющегося в торговле растительного масла, в котором растворены 1,5% Плюроник 8100, 0,4% Плюроник 6200 и 0,4% Дегимула FCE, суспендируют при перемешивании (скорость перемешивания 2000 об/мин). После этого добавляют 4% 25%-ного раствора глутарового альдегида; суспензию перемешивают еще 10 с Через 10 мин суспензию центрифугируют и промывают по примеру 1 метанолом/водой, н-гексаном и метилэтилкетоном. Получают магнитные частицы размером 1 - 3 мкм. Количество окиси железа составляет 7,3%.

Пример 3 4 мл феррофлюидов EMG 807 диспергируют в 100 мл 5%-ного PVAL-раствора (средняя молярная масса 224.000). Дисперсию обрабатывают 5 мин в ультразвуковой ванне и затем в 2300 мл растительного масла, которое содержит 2% глицерилмоностеарата 83, 0,8% Твин 85 и 0,4% Дегимула FCE, суспендируют при перемешивании (скорость перемешивания 1800 об/мин). Через 5 с добавляют 25 мл 2,5 н. HCl и еще через 5 с 7 мл 12%-ного раствора глутарового альдегида. Перемешивают еще 10 с. Суспензию через 10 мин, как описано в примере 1, центрифугируют и промывают. Образуются магнитные частицы с размером 2 - 5 мкм и с содержанием окиси железа 24,6%.

Пример 4 180 мг железоокисного пигмента Байферрокс PR 5044 N перемешивают в 20 мл 7%-ного PVAL-раствора (средняя молярная масса 88.000), который содержит 0,01% полистирол сульфокислоты и 0,05% полиэтиленгликоля 1000 и диспергируют в диспергаторе (Ультра-Турракс) при 20.000 об/мин. Проводят два раза двухминутную обработку в ультразвуковой ванне. Затем смесь при перемешивании (скорость перемешивания 2000) диспергируют в 460 мл растительного масла, которое содержит 1,9% глицерилмоностеарата 83, 0,4% Твин 20, 0,3% Дегимула FCE и 1% Дегимула HRE 7. Через 10 с добавляют 0,8 мл 25 %-ного раствора глутарового альдегида и еще через 5 с 8 мл 1 н. HCl. Суспензию перемешивают еще 10 сек. Через 10 мин проводят выделение и переработку фракции по примеру 1. Получают магнитные частицы с распределением размеров частиц 2 - 4 мкм и с содержанием окиси железа 12,3%.

Пример 5 50 мг Байферрокс 318 М в 10 мл смеси, состоящей из 5% PVAL (средняя молярная масса 224.000), 0,01% додецилсульфата Na и 0,1% полиэтиленгликоля 1000, диспергируют при помощи Ультра-Турракс (20000 об/мин). Затем суспендируют при перемешивании (скорость перемешивания 1800) полимерную фазу в 250 мл растительного масла, которое содержит 2,2% Спан 80, 0,4% Дегимула FCE и 0,4% Плюроник 6200. Через 5 с добавляют 10 мл 1 н. HCl и еще через 10 с 0,6 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида. Перемешивают дальше 10 с и центрифугируют суспензию через 5 минут. Полученную фракцию промывают по примеру 1. Образуются магнитные частицы с распределением частиц по размерам 3 - 6 мкм, содержание в них железа составляет 10,2%.

Пример 6 В смеси, состоящей из 50 мл 4%-ного PVAL-раствора (средняя молярная масса 103.000), в которой растворены 0,1% сывороточного альбумина крупного рогатого скота и 0,5% полиэтиленгликоля 1000, диспергируют 6,4 мл магнитного коллоида по примеру 1. Дисперсию 5 мин облучают в ультразвуковой ванне и затем суспендируют в 1100 мл растительного масла, которое содержит 1,8% Спан 85, 0,8% Синпероник P1 61, 0,8% Тетроник 901 и 0,4% Дегимула FCE (скорость перемешивания 2000). Через 10 с добавляют 4 мл 12%-ного раствора глутарового альдегида и еще через 5 с 12,5 мл 2,5 н. HCl. Суспензию перемешивают дальше еще 10 с. Через 15 мин проводят центрифугирование и дальнейшую обработку по примеру 1. Получают магнитные частицы с распределением размеров частиц 1 - 3 мкм и с содержанием окиси железа 8,3%.

Пример 7 100 мл 3,5%-ного PVAL-раствора (средняя молярная масса 224.000), который содержит 20% 3 н. HCl, перемешивают с 13 мл феррофлюидов EMG 507 и 0,5 мин облучают в ультразвуковой ванне. После этого магнитную полимерную фазу суспендируют при перемешивании (скорость перемешивания 2000) в 2,3 литра растительного масла, которое содержит 1,8% Плюроник 6100, 0,2% Плюроник 6200, 0,2% Гипермер A60 и 1,8% Дегимул HRE 7. Через 10 с добавляют 8 мл 12%-ного раствора глутарового альдегида и перемешивают дальше 15 с. Через 10 мин суспензию центрифугируют и промывают по примеру 1. Полученные частицы имеют распределение размеров частиц 1 - 2 мкм и содержание окиси железа 14,2%.

Пример 8 100 мл 7,5%-ного PVAL-раствора (средняя молярная масса 88.000), в котором растворены 0,05% желатины, перемешивают с 12,5 мл феррофлюидов EMG 707 и обрабатывают 3 мин в ультразвуковой ванне. Затем смесь суспендируют при перемешивании (скорость перемешивания 2000) в 2,5 литра растительного масла, которое содержит 1% глицерилмоностеарата 83, 0,4% Плюроник 6100 и 0,2% Брий 52 и 0,4% Твин 60. Через 10 с добавляют 4 мл 12%-ного раствора глутарового альдегида и еще через 5 с 26,5 мл 1 н. HCl. Суспензию перемешивают дальше еще 15 с. Через 15 мин суспензию центрифугируют и промывают по примеру 1. Получают магнитные частицы с размером 2 - 4 мкм и с содержанием окиси железа 26,0%.

Пример 9 10 мл 7,5%-ного PVAL-раствора (средняя молярная масса 103.000) доводят при помощи 0,5 н. NaOH до pH 9,5 и вводят пипеткой 75 мкл дивинилсульфона. После этого в водной фазе диспергируют 1,2 мл магнитного коллоида по примеру 1. После 3-минутного облучения в ультразвуковой ванне смесь при перемешивании суспендируют (скорость перемешивания 2000) в 220 мл растительного масла, в котором растворены 2% Спан 60, 0,4% Твин 80 и 0,4% Дегимула FCE. Перемешивают дальше еще 30 с. После этого суспензию оставляют на 60 мин при комнатной температуре и затем обрабатывают по примеру 1. Получают частицы с распределением частиц по размерам 4 - 8 мкм. Содержание окиси железа составляет 7,7%.

Пример 10
100 мл 3,5%-ного PVAL-раствора (средняя молярная масса 224.000), в котором растворены 40% 1 н. HCl и 0,015% додецилсульфата натрия, перемешивают с 5 мл феррофлюидов EMG 707 и облучают 1 мин в ультразвуковой ванне. После этого полимерную фазу суспендируют при перемешивании (скорость перемешивания 2000) в 2,3 литра растительного масла, в котором растворены 1% глицерилмоностеарата 83, 1% Плюроник 6100, 0,8% Твин 80 и 2% Дегимула HRE, 10 с. Через 10 с добавляют 6 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида; перемешивают дальше 10 с. Через 10 мин суспензию центрифугируют и промывают по примеру 1. Образуются магнитные частицы с распределением размеров частиц 2 - 4 мкм, которые имеют содержание окиси железа 24%.

Пример 11
14,5 мл магнитного коллоида по примеру 1 диспергируют в 100 мл полимерной фазы, которая содержит 4% PVAL (средняя молярная масса 224.000) и 0,1% сывороточного альбумина крупного рогатого скота, и одну минуту обрабатывают в ультразвуковой ванне. После этого дисперсию сначала 15 с суспендируют при перемешивании (скорость перемешивания 2000) в 2,5 литра растительного масла, в котором растворены 3,8% Плюроник 3100, 0,8% Плюроник 6200 и 1,5% Тетроник 304. Затем добавляют 7,5 мл 12%-ного раствора глутарового альдегида и еще через 10 с 25 мл 3 н. НCl; перемешивают дальше еще 10 с. Через 10 мин суспензию обрабатывают по примеру 1. Получают магнитные частицы с распределением размера частиц 1 - 2 мкм и с содержанием окиси железа 9,6%.

Пример 12
В 1200 мл растительного масла, которое содержит 2,2% глицерилмоностеарата 80, 0,8% Спан 85 и 0,8% Тритона CF 10, суспендируют 10 с при перемешивании (скорость перемешивания 1800) 50 мл полимерной фазы, состоящей из 5% PVAL (средняя молярная масса 224.000), 0,5% полиэтиленгликоля 3350 и 12% феррофлюидов EMG 707. Добавляют с интервалами по 5 с 4 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида и 25 мл 1 н. HCl. Продолжают перемешивание 15 с. Через 10 мин центрифугируют и промывают по примеру 1. Получают магнитные частицы, которые имеют распределение размеров частиц 1 - 2 мкм и содержание окиси железа 18,3%.

Пример 13
В 100 мл 5%-ного PVAL-раствора (средняя молярная масса 203.000), в котором растворены 0,05% полистиролсульфокислоты и 0,1% поливинилпирролидона, образуют дисперсию с 12 мл коллоида из магнетита и облучают 2 мин в ультразвуковой ванне. Получают суспензию в 2,2 литра растительного масла, состав которого аналогичен примеру 12. Через 10 с с интервалами по 10 с добавляют 8 мл 12%-ного раствора глутарового альдегида и 20 мл 2,5 н. HCl. После соответствующей обработки аналогично примеру 1 получают магнитные частицы с размером 2 - 4 мкм, с содержанием окиси железа 7,5%.

Пример 14
6,5 мл феррофлюидов EMG 807 диспергируют в 100 мл полимерной фазы, состоящей из 10% PVAL (средняя молярная масса 88.000), 0,05% ацетат-бутирата целлюлозы и 0,1% поливинилпирролидона, и облучают 3 мин в ультразвуковой ванне. Затем дисперсию суспендируют при перемешивании (скорость перемешивания 2000 об/мин) в 2300 мл растительного масла, которое содержит 1,8% Синпероник L61, 0,2% Тетроник 1101 и 1% Дегимула FCE. Через 10 с добавляют с интервалами по 10 с 8 мл 12%-ного раствора глутарового альдегида, который содержит 20 мол.% этилендиамина, и 23 мл 2,5 н. HCl. Перемешивают дальше 10 с и через 10 мин обрабатывают суспензию аналогично примеру 1. Получают магнитные частицы с распределением размеров частиц 1 - 3 мкм и с содержанием окиси железа 10,4%.

Пример 15
300 мг полученных по примеру 1 полимерных частиц суспендируют в 10 мл воды, смешивают с 10 мл 3,5 М NaOH и 15 мл эпихлоргидрина и подвергают взаимодействию 2 часа при 55^oC при интенсивном перемешивании. После этого отделяют магнитные частицы при помощи неодим-железо-бор-магнита. Продукт суспендируют приблизительно в 10 мл воды и еще раз отделяют магнитом. Этот процесс промывки/отделения повторяют 10 раз, с последующей однократной промывкой ацетоном. Затем 30 мг активированных таким способом магнитных частиц подвергают взаимодействию при 50^oC 2 ч с 2 мл 0,1 М буферного раствора бората, pH 11,4, который содержит 10% гексаметилендиамина. Промывают 10 раз водой. Затем полученный продукт вступает в реакцию в течение 2 ч при 30^oC с 2 мл 0,1 М буферного раствора фосфата К, pH 7,0, в котором растворены 12,5% глутарового альдегида. Потом в течение 30 минут промывают сначала 10 раз водой и затем 2 раза 0,1 М буферным раствором фосфата калия, pH 7,5. Добавкой 1 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия, pH 7,5, в котором растворены 0,3 мг стрептавидина, связывают после 12-часовой инкубации при 4 С 0,11 мг стрептавидина с матрицей. С матрицей можно связывать известными методами биотинилированные ДНК-фрагменты, которые применяют для ДНК- последовательностей.

Пример 16
30 мг полученных по примеру 15, активированных эпихлоргидрином/гексаметилендиамином/глутаровым альдегидом магнитных частиц подвергают взаимодействию 24 ч при 4^oC с 2 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия, pH 7,5, в котором растворены 0,3 мг антиинсулин-антитело. Связывают 0.2.8 мг антитела.

Пример 17
60 мг магнитных частиц по примеру 3 обезвоживают последовательной добавкой смесей ацетона/воды 1:3, 1:1, 3:1 (объем/объем) и, наконец, абсолютного ацетона. После этого диспергируют суспензию в 2 мл абсолютного диметилсульфоксида, который содержит 0,1% октоата олова и активируют добавкой 0,5 мл гексаметилендиизоцианата в течение 30 минут при 45^oC. После этого промывают 5 раз по очереди с несколькими мл диметилсульфоксида и ацетона. 30 мг активированной фракции превращают 4 часа при 30^oC с 1 мл абсолютного диметилсульфоксида, в котором растворены 20% полиэтиленгликоля 400 и 0,05% DABCO. Промывают 1 раз диметилсульфоксидом и 5 раз водой и снова обезвоживают фракцию вышеуказанными смесями ацетона/воды. Связанную полиэтиленгликолем фракцию подвергают взаимодействию затем 45 минут при комнатной температуре с 1 мл диметилсульфоксида, в котором растворены 6 ммоль 4-диметиламинопиридина и 5 ммоль 2-фтор-метил-пиридин-толуол-сульфоната. Проводят 5-кратную по очереди промывку диметилсульфоксидом и ацетоном. Затем активированный продукт связывают при 4^oC инкубацией с раствором антитироксин-антитела (0,25 мг антитела/мл, 0,05 М буферного раствора фосфата K, pH 7,5). Связывают 0,23 мкг антитела. После многократной промывки буферным раствором для связывания остаточные активные группы дезактивируют 4-часовым инкубированием при помощи 0,1 М трис-HCl-буферного раствора, содержащего 20 ммоль меркаптоэтанола, pH 8,5. Затем магнитные частицы промывают при помощи PBS-буферного раствора. Связанные магнитные частицы применяют известными способами для определения тироксина.

Пример 18
30 мг активированной по примеру 17 при помощи гексаметилендиизоцианата фракции смешивают 5 ч с 2 мл 0,3 КОН/MeOH - раствора 1:1 (объем/объем). Через 5 ч реакции при комнатной температуре промывают несколько раз водой. Затем содержащую аминогруппы фракцию активируют по примеру 15 при помощи глутарового альдегида. Проводят многократную промывку водой с интервалом 30 мин, 20-часовым инкубированием при 4^oC с 1 мл буферным раствором фосфата К, pH 7,5, в котором растворены 0,35 мг антимышиного IgG, связывают 0,28 мг IgG. Связанный продукт применяют известными способами для разделения клеток.

Пример 19
30 мг магнитных частиц по примеру 10 при 0^oC смешивают с 4 мл воды, в которой растворены 100 мл BrCN. Добавкой 2 н NaOH устанавливают pH до 11,5. Реакцию заканчивают через 5 минут магнитным отделением магнитной фракции. Проводят 4-кратную промывку ледяной водой. После этого дополнительно промывают один раз при помощи 0,01 н. HCl и 0,1 М буферного раствора бикарбоната, pH 8,2. 1 мл 0,1 М буферного раствора бикарбоната, pH 8,2, в котором растворены 0,2 мг анти-CD4 антител, инкубируют с активированными магнитными шариками 12 ч при 4^oC. Дополнительно промывают несколько раз при помощи PBS-буферного раствора, pH 7,2, который содержит 0,5 М NaCl и 0,1% Тритона X100. Получают носитель, с которым связано 0,18 мг антител. Полученные носители применяют для выделения T-клеток-помощников.

Пример 20
30 мг магнитных клеток по примеру 5 активируют аналогично примеру 19 при помощи BrCN. Связывание гепарина (молярная масса 6000) производят 12-часовым инкубированием 1 мл буферного раствора бикарбоната, pH 8,2, который содержит 0,5 мг растворенного гепарина. После этого инкубируют 2 ч при комнатной температуре при помощи 0,1 М раствора этаноламина, pH 8,0, и затем 4 раза промывают при помощи 0,1 М буферного раствора ацетата, pH 4. Полученную фракцию применяют известными способами для отделения антитромбина III.

Пример 21
30 мг магнитных частиц по примеру 4 обезвоживают последовательной добавкой смесей ацетона/воды, как описано выше. По 1 мл диметилсульфоксила, в котором растворены 6 ммоль 4-диметиламино-пиридина и 5 ммоль 2-фтор-метил-пиридин-толуол- сульфоната инкубируют с магнитными шариками 45 мин при комнатной температуре. После этого промывали по 5 раз по очереди ацетоном и диметилсульфоксидом и 1 раз 0,05 М буферным раствором фосфата К, pH 7,5. Потом добавляли 1 мл 0,05 буферного раствора фосфата К, pH 7,5, который содержит 0,3 мг протеина A. Связывание проводят в течение 12 ч при комнатной температуре. Проводят многократную промывку PBS-буферным раствором, в котором растворены 0,5% NaCl и 0,1% тритона X100. Связывают 0,27 мг протеина. Магнитную фракцию используют для отделения IgG-подклассов аналогично известным метолам.

Пример 22
30 мг фракции магнитных частиц по примеру 12 промывают один раз 2 мл 0,5 М буферного раствора карбоната, pH 11. Последующее активирование при помощи 100 мкл дивинилсульфона осуществляют при добавке 1 мл промывочного буферного раствора в течение 70 мин при комнатной температуре. Проводят многократную промывку водой в течение 30 мин. 1 мл буферного раствора карбоната, pH 10, который содержит 10% лактозы, инкубируют 20 ч при комнатной температуре при помощи фракции магнитных шариков. Связывают 0,68 мг лактозы. Носитель применяют для очистки пектинов из экстрактов омелы известными способами.

Пример 23
30 мг магнитных частиц по примеру 7, которые активируют аналогично примеру 15 при помощи эпихлоргидрина, превращают 16 часов при комнатной температуре с 0,3 М гидразидом адипиновой кислоты в 0,2 М буферном растворе карбоната, pH 9, до производного гидразида. Промывают несколько раз 0,1 М буферным раствором трис-HCl, pH 8,5. Остаточные группы оксирана дезактивируют 4-часовым инкубированием с промывочным буферным раствором, содержащим 0,3 М раствор меркаптоэтанола. Промывают 3 мл 0,1 М буферного раствора ацетата Na, pH 5,5. 1 мл промывочного буферного раствора, в котором растворены 0,3 мг анти-HGH и 10 ммоль м-периодата Na, инкубируют при исключении света 40 мин при 4^oC. Осуществляют 5-кратную промывку буферным раствором ацетата Na и 2 раза PBS-буферным раствором. Связывают 0,21 мг антител. Связанный носитель применяют для определения HGH.

Пример 24
30 мг магнитных частиц по примеру 9 суспендируют в воде и отделяют ручным магнитом. Отделенную фракцию инкубируют 15 минут при комнатной температуре в 0,5 мл 0,1 М азотной кислоты, которая содержит 0,1 М Cer (IV)-нитрата аммония. После этого магнитные частицы отделяют магнитом и промывают один раз водой. Затем фракцию приводят в реакцию в течение 15 минут при 50^oC добавкой 0,5 мл акриловой кислоты и 0,5 мл н-гексана. Промывают 10 раз водой в течение 30 мин. Выход прививки составляет 85%. Привитую фракцию активируют 30 мин при комнатной температуре при помощи 1 мл 0,1 М MOPS-буферного раствора (3-морфолино-пропансульфокислоты), pH 7,5, который содержит 5% N-циклогексил-N'-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-метил-п-толуолсульфоната. Промывают 5 раз ледяной водой и добавляют 0,3 мг анти-LDL- антитела, растворенного в 1 мл MOPS-буферного раствора, pH 7,5. Время реакции 24 часа при 4^oC. После этого носитель дезактивируют 4-часовым инкубированием с 5 мл 5 мМ этаноламина/0,1 М трис-HCl-буферного раствора, pH 8,5. Связывают 0,25 мг антитела. Связанную матрицу применяют для удаления LDL (липопротеина низкой плотности) из биологических жидкостей.

Пример 25
30 мг магнитных частиц по примеру 3 прививают аналогично примеру 24 акриловой кислотой. 100 мкг олиго(dT)20 замещают соответственно методике, описанной в ДНК, т. 4, 1988, 327, этилендиамином на 5'-конце. NH₂-модифицированный олигонуклеотид растворяют в 1 мл 0,1 М буферного раствора имидазола, pH 7,0 и инкубируют с фракцией магнитных частиц 20 ч при комнатной температуре. После этого несколько раз промывают буферным раствором имидазола, который содержит 0,1% Тритона X100. Связывают 38 мкг олигонуклеотида. Полученные магнитные частицы применяют для выделения мРНК известными способами.

Пример 26
100 мг магнитных частиц по примеру 9 прежде всего обезвоживают при помощи смесей ацетона/воды по вышеупомянутому предписанию. Проводят активирование с помощью гексаметилендиизоцианата по примеру 17. 2 мл диметилсульфоксида, в котором растворены 0,1% октоата олова и 30 мг м-аминофенилбороновой кислоты, инкубируют с активированными частицами 6 ч при 30^oC. После этого промывают несколько раз водой. Связанные бороновой кислотой магнитные частицы применяют для определения гликированного гемоглобина в крови известными способами.

Пример 27
30 мг магнитных частиц соответственно примеру 14 перемешивают с 2 мл воды, в которой растворены 50 мг Цибакрона голубого F3G-A, и нагревают 30 мин при 60^oC. После этого добавляют 1 мл 25%-ного раствора NaCl и нагревают еще 1 час до 75^oC. После добавки 1 мл 10%-ного раствора карбоната Na нагревают еще 2 ч при 70^oC. Проводят многочасовую промывку водой. Полученную матрицу применяют для отделения спиртовой дегидрогеназы известными способами.

Формула изобретения

1. Способ получения гранулообразных или шарообразных частиц из поливинилового спирта, отличающийся тем, что водный раствор поливинилового спирта - полимерная фаза, в котором диспергирован магнитный коллоид, суспендируют при комнатной температуре при перемешивании в не смешивающейся с полимерной фазой органической фазе, которая содержит, по меньшей мере, два эмульгатора, и во время процесса суспендирования осуществляют сшивание добавлением водорастворимого агента, реагирующего с гидроксильными группами поливинилового спирта.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в органической фазе растворяют 2 - 6 об.% смеси эмульгаторов, состоящей, по меньшей мере, из двух различных компонентов, из которых, по меньшей мере, один компонент является частично водорастворимым.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в полимерной фазе растворяют 0,01 - 2 вес.% одного или нескольких эмульгаторов.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что эмульгаторы представляют собой протеины, производные целлюлозы, производные сульфокислоты, поливинилпирролидон, или полиэтиленгликоли, или их смеси.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что водный раствор поливинилового спирта содержит поливиниловый спирт в концентрации 2,5 - 12,5 вес.%.

6. Способ по пп.1 - 5, отличающийся тем, что к полимерной фазе примешивают магнитный коллоид в виде ферромагнитных или суперпарамагнитных веществ.

7. Способ по пп.1 - 6, отличающийся тем, что добавляют 2 - 7 об.% раствора сшивающего агента в расчете на полимерную фазу.

8. Способ по пп.1 - 7, отличающийся тем, что сшивающий агент - глутаровый альдегид вводят вместе с водорастворимым диамином.

9. Способ по пп.1 - 7, отличающийся тем, что сшивание проводят при помощи диальдегидов кислотным катализом, при этом концентрация кислоты составляет 15 - 50 об.% в расчете на полимерную фазу.

10. Гранулообразные или шарообразные магнитные частицы поливинилового спирта с размерами частиц 1 - 10 мкм, получаемые согласно способу по пп.1 - 9.

11. Гранулообразные или шарообразные частицы по п.10, отличающиеся тем, что их поверхности имеют химически связанные полимерные цепи и образующие полимерные цепи виниловые мономеры содержат карбоксильные, гидроксильные, амино-, альдегидо- или оксирановые группы.

12. Гранулообразные или шарообразные частицы по пп.10 и 11, отличающиеся тем, что на поверхности полимерных частиц имеются реактивные группы, связывающиеся с биомолекулами.

13. Гранулообразные или шарообразные частицы по п.12, отличающиеся тем, что связывающиеся группы вводятся во взаимодействие с антителами, пептидами, протеинами, энзимами, стрептавидином, авидином, олигонуклеотидами или ДНК-фрагментами.

14. Гранулообразные или шарообразные частицы по пп.10 - 13, отличающиеся тем, что они используются для фракционирования клеток, нуклеиновых кислот, протеинов, вирусов или бактерий.

15. Гранулообразные или шарообразные частицы по пп.10 - 13, отличающиеся тем, что они используются для иммуноанализа, для ДНК-последовательности или ДНК-синтеза.