Биотехнологический способ получения ранозаживляющего препарата

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Способ получения ранозаживляющего препарата осуществляют культивированием штаммов - продуцентов низшего гриба Blakeslea trispora (+) Т и (-) Т с последующим отделением биомассы. Биомассу обрабатывают химическими реагентами и проводят диализ. После диализа к лиофилизированному или нелиофилизированному продукту добавляют аминогликозидный антибиотик (гентамицин или тобрамицин) и воду. Способ обеспечивает увеличение выхода конечного продукта и его антимикробной активности. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и может быть использовано для получения из субстанции "Микоран" ранозаживляющих препаратов с повышенной антибактериальной активностью.

В последние годы в фармацевтической промышленности отмечается увеличение интереса к созданию ранозаживляющих препаратов. Этот интерес обусловлен следующими причинами: прогрессирующим ростом травм среди населения, возможностью прогнозировать медицинские препараты с определенными медико-биологическими свойствами благодаря успехам в химии природных полимеров и достижениям в области биотехнологии и микологии [1], возможностью использовать при создании лекарств вместо продуктов химического синтеза природные биологически активные соединения, обладающие высокой регенерирующей способностью и отсутствием токсических эффектов [2].

Среди природных соединений перспективны природные полисахариды, обладающие указанными выше свойствами и выгодно отличающиеся отсутствием иммунного ответа от лекарственных ранозаживляющих препаратов, созданных на основе белка (коллагена).

Из известных лекарственных средств наиболее активную пролиферацию фибробластов вызывают полисахариды, в частности полиаминосахариды - хитин и особенно хитозан [3]. Последние используют для создания противоожоговых лекарств на основе хитина и хитозана крабов. Этот препарат получил название - Beschitin-W[4]. На основе хитина базидиальных грибов также создан препарат " Микотон" [5] , который по мнению авторов может найти широкое применение в медицине как иммуномодулирующее средство. Хитин и хитозан содержатся и в мицелии низших грибов, например мукоровых (Blakeslea trispora). На основе использования этого продуцента была разработана биотехнология получения ранозаживляющего препарата - "Микоран" [6].

На основании клинических испытаний и дальнейшей апробации опытных партий этот препарат был разрешен к медицинскому применению на основании приказа Минздрава РФ N 368 от 28.10.96. Препарат показал высокую ранозаживляющую активность, отсутствие токсических свойств, высокую биосовместимость и был рекомендован для лечения ожогов IIIа и IIIб степени, подготовки ран к аутодермапластике, ускорения эпителизации длительно незаживающих ран и поверхностных ожогов. Активным началом этого препарата являются хитин и хитозан низших грибов, которые стимулируют пролиферацию фибробластов в большей степени, чем полиаминосахариды, полученные из крабов [7].

Однако недостатком указанных препаратов, обладающих высокой ранозаживляющей способностью, является недостаточная антибактериальная активность в отношении патогенной микрофлоры ран, особенно Staphilococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa.

Наиболее близким к поставленной цели является способ получения ранозаживляющего препарата "Микоран, 4,0 г", а именно субстанции "Микоран" [6, 7], согласно которому мицелиальные грибы, относящиеся к порядку Phycomycetes - Blakeslea trispora А-732-3 (+) и А-732-3 (-) выращивают в погруженной культуре.

Кипячение с водой способствует удалению водорастворимых несвязанных ковалентно или ионными связями соединений: белков, углеводов, органических кислот и др. Обработка 1 н. щелочью с детергентом дает возможность удалить часть прочносвязанных щелочерастворимых белков, липидов и полисахаридов. Разрыву межмолекулярных связей в биополимерах значительно способствует введение детергента. Обработка щелочью с этанолом приводит к дальнейшему удалению цитоплазматического содержимого мицелия грибов, включая белки, углеводы и особенно жирорастворимые соединения.

Недостатком данного способа является низкий выход конечного продукта и недостаточная антибактериальная активность в отношении патогенной микрофлоры.

Целью данного изобретения является разработка нового способа получения из мицелия грибов хитинсодержащих, ранозаживляющих препаратов, обладающих повышенной антибактериальной активностью, расширение числа используемых продуцентов и увеличение выхода конечного продукта.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что мицелиальные грибы, относящиеся к порядку Phycomycetes, семейству Choanephoraceae, штаммы Blakeslea trispora Т (+) и Т (-) культивируют в погруженной культуре. Выращенную биомассу отделяют от среды культивирования и прогревают на водяной бане при температуре 98^oC в течение одного часа. Отфильтрованную биомассу гомогенизируют и обрабатывают 1 н. щелочью с добавлением детергента в течение 12 ч при температуре 28^oC и интенсивном перемешивании. Следующая стадия очистки включает повторную гомогенизацию целевого продукта и его обработку 1% этанолом в 0,3 н. щелочи при температуре 98^oC в течение 1 ч. Далее целевой продукт диализируют в течение 12 ч против дистиллированной воды и к лиофилизированному или нелиофилизированному продукту добавляют антибиотические вещества аминогликозидной природы: гентамицин или тобрамицин. Готовят растворы гентамицина или тобрамицина и добавляют их в такой концентрации, чтобы суточная доза составляла соответственно 6 мг и 8 мг на 1 кг веса тела.

Первая часть заявленного способа аналогична биотехнологическому способу получения субстанции "Микоран" и ее лекарственной формы "Микоран 4,0 г", на которые получены ВФС (7). Однако для этой цели впервые использовали в качестве продуцента (+) и (-) Т штаммы B.trispora (8). Штаммы (+) и (-) Т B. trispora отличались от штаммов B. trispora А-732-3 (+) и А-732-3 (-) (прототип) по следующим признакам: (1) большая скорость роста, позволяющая сократить процесс выращивания мицелия с 96 до 86 часов; (2) увеличение выхода биомассы, соответственно с 15 г/л до 20 г/л; (3) (+) и (-) Т штаммы имели утолщенные клеточные стенки, более устойчивые к действию литических ферментов, и содержали в 1,5 раза больше полиаминосахаридов (хитина и хитозана). Указанные свойства (+) и (-) Т штаммов B.trispora обеспечивали во время биотехнологического процесса большие и стабильные выходы конечного продукта в среднем на 20- 25%.

Препарату с добавлением гентамицина дано название "Микогент" (МГ), с добавлением тобрамицина - "Микотобр" (МТ). Полученные препараты наносят ровным тонким слоем из расчета 8-10 мг на 1 см² обожженной поверхности желательно сразу после получения ожоговой травмы и далее после иссечения струпа и затем ежедневно в течение двух дней. Согласно медико-биологическим испытаниям уже на 7 сутки общее состояние животных при введении этих препаратов заметно улучшается, причем изучение динамики обсемененности ран показали уменьшение содержания микробов на 30-40% по сравнению с контролем.

Пример 1 Штаммы мицелиального гриба Blakeslea trispora Т (+) и Т (-) выращивают на среде следующего состава: соевая мука - 4%, кукурузная мука -1,73%, KH₂PO₄ - 0,05%; pH среды - 5,8; стерилизация ведется при 1 атмосфере в течение 30 мин. Полученную биомассу отделяют от среды выращивания и в количестве 20 г (влажность биомассы 70-80%) подвергают гомогенизации 3 раза в течение 3 минут для удаления цитоплазматического содержимого. Далее гомогенизированную биомассу, содержащую фрагменты мицелия, помещают в колбу, добавляют четырехкратный объем воды и прогревают 1 ч при 98^oC, не допуская кипения. Биомассу отфильтровывают, делят на 4 равные части и помещают в колбы на 2,5 л, куда добавляют 0,5 л 0,2% раствора детергента в 1 н NaOH. В качестве детергента используют стиральный порошок "Лотос". Колбы с биомассой выдерживают при интенсивном перемешивании в течение 12 ч при температуре 28^oC. Далее для нейтрализации добавляют 0,5 л 1 н. HCl. Осадок отмывают горячей водой (98^oC), затем холодной водой до рН воды. Осуществляют микроскопический контроль за удалением цитоплазматического содержимого мицелия. Следующая стадия обработки включает повторную гомогенизацию целевого продукта, его обработку 1% этанолом в 0,3 н. щелочи при температуре 98^oC в течение 1 ч при интенсивном перемешивании. Затем нейтрализуют 0,3 н. соляной кислотой и отмывают горячей и холодной водой до pH воды. На этой стадии обработки микроскопический контроль должен показать значительную потерю цитоплазматического содержимого мицелия и преобладание фракции клеточных стенок, в противном случае щелочную обработку необходимо повторить. Следующий этап обработки - проведение диализа против дистиллированной воды (целевой продукт помещают в целлофановый мешочек) в течение 12 ч для удаления следов щелочи и других низкомолекулярных соединений.

Полученный препарат не подвергают лиофилизации и добавляют к нему антибиотики из расчета: к 26 г сырой субстанции (2,5 г по сухой массе) вносят 12 мг гентамицина в 10 мл воды. Полученную смесь тщательно растирают в ступке и далее лиофилизируют. Полученный препарат подвергают измельчению и используют для лечения ожоговых ран. На экспериментальный ожог площадью 25 см² наносят около 125 мг препарата, содержащего суточную дозу гентамицина (0,6 мг для крысы весом 200 г).

Медико-биологические испытания [9] на крысах-самцах весом 120-150 г показали, что раны, обсемененные после термического поражения S.aureus и P.aeruginosa (210⁶ бактерий в 1 мл) при лечении МГ показывают явно выраженный ранозаживляющий и антимикробный эффект препарата.

Ожоги у животных опытных и контрольных групп проводились открытым способом. МГ применяли сразу после нанесения травмы, далее после иссечения струпа и затем в течение двух последующих суток ежедневно. На 7 сутки сокращение площади ран составляло 8% от исходной величины, а в контроле площадь ран не только не менялась, но даже увеличивалась на 2-5%, к 15 суткам разница в сокращении площади ран по сравнению с контрольной группой животных составляла 15-20%, на 21 сутки разница в площади ран была 30-35%.

На 7 сутки после нанесения ожога в контрольной группе наиболее выражен вторичный некроз, который сопровождается перифокальным воспалением мягких тканей и появлением первых признаков нагноения ран. При лечении МГ клиническая картина носит диаметрально противоположный характер - раневое отделение скудное и серозное, участки вторичного некроза едва различимы, на большой площади ран появляется тонкий пласт грануляционной ткани, а в ряде случаев отмечается тонкая кайма красного эпителия. Эти данные свидетельствуют о том, что ранозаживляющий эффект МГ проявляется уже в самом начале процесса лечения ран. При гистологическом исследовании уже на 7 сутки обнаружены существенные различия в морфологии ран. При действии МГ отмечается явно более благоприятное течение раневого процесса. Вторичный некроз очень слабо выражен и носит поверхностный характер. Жизнеспособный слой представлен грануляционной тканью, которая характеризовалась небольшим числом капилляров, наличием умеренно набухших фибробластов, значительным количеством волокнистых структур. В отличие от контроля, граница между пораженными и здоровыми тканями четкая, при этом воспалительных инфильтратов в тканях не наблюдалось. Отмечается наличие грануляционной ткани уже на 3-4 сутки.

Результаты исследования антибактериальных свойств МГ показали, что этот препарат имеет значительно большую антибактериальную активность по отношению к контролю (на 7 сутки на 35,2%; на 21 сутки - 30,4%).

Пример 2. То же, что в примере 1, но гентамицин добавляют к лиофилизированному препарату. После этого субстанция с антибиотиком растирается в ступке или гомогенизируется в гомогенизаторе, а далее подвергается лиофильной сушке. Проведенные испытания на питательном агаре с использованием дисков, пропитанных гентамицином, показали, что антибактериальная активность МГ против S. aureus и P. aeruginosa, ниже на 30-40%, чем если препарат приготовлен согласно примеру 1.

Пример 3. То же, что и в примере 1, но в качестве антибиотика используют тобрамицин в концентрации 8 мг/кг веса тела животного из расчета: к 26 г сырой субстанции с влажностью 90% добавляют 16 мг тобрамицина в 10 мл воды.

Пример 4.

То же, что и в примере 3, но раствор тобрамицина добавляют к лиофилизированному препарату. После этого смесь растирается в ступке или гомогенизируется в гомогенизаторе, а затем подвергается лиофильной сушке.

В отличие от МГ ранозаживляющее действие МТ проявляется только на 7 сутки и составляет 7-8% по отношению к контролю, где площадь ран увеличилась на 2-3%. На последующие 15 и 21 сутки сокращение площади ран под действием МТ по сравнению с контролем не наблюдалось Тем не менее, обсемененность ран в присутствии МТ также меньше, чем в контрольной партии, и увеличение антибактериальной активности составляет на 7 сутки -18%, на 15 сутки - 20%. Гистология показала, что масштабы вторичного некроза больше, чем при действии МГ, однако последний не был, как в контроле, подвержен гнойному расслоению. Выявленное гнойное воспаление, не отмеченное при действии МТ, в отличие от контроля носит очень поверхностный характер. Наличие новых грануляций и по степени зрелости меньше, чем при действии МГ, но значительно превышает контроль.

Таким образом, результатом комплексного обследования (клиническая оценка процесса заживления ран, исследование антибактериальных свойств, гистологическая картина экспериментальных ожоговых ран) действия антибиотикосодержащих композиций на базе субстанции "Микоран" свидетельствуют о позитивном влиянии на заживление ран. Степень и характер влияния состоит в том, что биостимулирующее действие Микорана усиливается антибактериальным эффектом включенных в препарат аминогликозидных антибиотиков. Наиболее эффективно сочетание Микорана с гентамицином: эпителизация поверхностных ожогов к 15 суткам, что на 7 дней раньше, чем в контроле, появление отчетливой каймы краевого эпителия и первых грануляций при глубоких ожогах уже на 7 сутки, поверхностный характер или отсутствие явлений вторичного некроза, более быстрое по сравнению с контролем созревание грануляций, стабильно высокие и большие нежели в контроле и при действии МТ темпы сокращения величины глубоких ожоговых ран.

Снижая микробную обсемененность ран ниже критического уровня, препарат МГ исключает возможность развития микробной инвазии и прогрессивного некроза, что в свою очередь создает благоприятные условия для максимальной реализации биостимулирующего эффекта препарата "Микоран 4,0 г".

Литература
1. Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и полимерных имплантантов. Тезисы 1 Международной конференции. М., 1992.

2. Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантантов. Материалы 11 Международной конференции, М., 1995.

3. Dixon В. Using fungal dressing to heal wounds. Biotechnology, 1995, v. 13, p. 120-121.

4. Japans Unitika commercializes new chitin product. Bioprocess.Technol. 1988, v. 10, N 8, p. 4.

5. Gorovoj L. , Burdukova L. Chitin-containing material produced from fungi: medical application perspectives, I Inter. conferense of the european chitin Soc., Brest, 1995, p. 22.

6. Феофилова Е. П. , Терешина В.М., Алексеев А.А., Гришина И.А. Способ получения ранозаживляющего препарата. Патент РФ, N 2086247, 1994.

7. ВФС 42-2737, ВФС 42-2738.

8. Феофилова Е. П. Прогресс в области экспериментальной микологии как основа для создания современных биотехнологий. Микробиология, 1997, т. 66, с. 302-309.

9. Отчет о результатах медико-биологического исследования влияния антибиотиксодержащих композиций субстанции "Микоран" на процесс заживления ожоговых ран. Институт хирургии им. А.В.Вишневского РАМН, Центр термических поражений. М., 1997.

Формула изобретения

1. Способ получения ранозаживляющего препарата, предусматривающий культивирование штаммов-продуцентов низшего гриба Blakeslea trispora, отделение биомассы, ее последующую обработку химическими реагентами, диализ и лиофильную сушку, отличающийся тем, что в качестве продуцентов используют (+) Т и (-) Т штаммы Blakeslea trispora, после диализа к лиофилизированному или нелиофилизированному продукту добавляют аминогликозидный антибиотик и воду.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аминогликозидного антибиотика используют гентамицин или тобрамицин.