Штамм бактерий vibrio cholerae cholerae 5 серовара огава - продуцент антител холерной огава сыворотки

 

Изобретение предназначено для лабораторной диагностики холеры, а также для иммунологических и генетических исследований. Штамм Vibrio cholerae cholerae 01KM 193 5 серовара Огава является продуцентом антител. Он используется для получения холерной агглютинирующей Огава сыворотки. Штамм обладает хорошо амплифицируемыми последовательностями оперона гена, детерминирующего синтез A и B субъединиц холерного энтеротоксина. Штамм высокоантигенен. При иммунизации лошадей и кроликов корпускулярным О-антигеном стимулирует образование специфических антител в высоких титрах. Изобретение позволит повысить активность и специфичность холерной Огава сыворотки.

Изобретение относится к области микробиологии, в частности к лабораторной диагностике холеры и к штаммам-продуцентам диагностических сывороток, может быть использовано в иммунологических, генетических исследованиях и для получения холерной агглютинирующей Огава сыворотки.

При получении холерной сыворотки Огава, согласно регламенту производства N 144-97, используют для иммунизации животных штаммы V.cholerae O-1 группы серовара Огава. Штаммы холерных вибрионов должны обладать типичными для S-формы морфологическими, культуральными, биохимическими и серологическими свойствами.

Холерные штаммы O-1 группы, используемые в качестве антигенов для иммунизации, необходимо подбирать из числа наиболее агглютина-бельных. Культуры этих штаммов должны агглютинироваться до титра гомологичными национальными отраслевыми стандартными образцами (ОСО).

Известен штамм серовара Огава, используемый для получения кроличьей холерной Огава сыворотки. Использовали корпускулярный O-антиген, приготовленный из штамма серовара Огава Vibrio cholerae cholerae 41. Штамм ранее использовался в качестве антигена для иммунизации животных - продуцентов Огава сыворотки, характеризуется как иммуногенный. Недостатки: при иммунизации животных антигеном этого штамма получают достаточно высокий процент неспецифических антител, что требует проведения 6-8 адсорбций (Отчет НИР (закл. ): Иркут. НИПЧИ. Рук. Тюменцев С.Н., Инв. N 0280063297, Иркутск, 1983).

Цель изобретения - штамм бактерий Vibrio cholerae cholerae 5 серовара Огава, позволяющий повысить активность и специфичность холерной Огава сыворотки.

Сущностью изобретения является использование штамма Vibrio cholerae cholerae 5 серовара Огава в качестве продуцента антител для получения холерной сыворотки Огава.

Штамм Vibrio cholerae cholerae 5 серовара Огава, особое название - "форма 30", инвентарный N4, родословная штамма - получен из фагового отдела ЦГНКИ в 1949 году. Депонирован нами в Государственной коллекции бактериальных возбудителей 1-2 групп патогенности при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" под N 01 KM 193. Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физико-биологическими признаками.

Культурально-морфологические признаки. На агаре Мартена или казеиново-дрожжевом агаре (pH 7,6) образует выпуклые колонии правильной округлой формы с ровными краями, гладкой поверхностью. Колонии при падающем свете голубоватые до 2 мм в диаметре; в бульоне Мартена или 1% пептонной воде (pH 7,6) при 37^oC через 24 часа - стойкое равномерное помутнение, на поверхности - нежная голубоватая пленка. При окраске по Граму - грамотрицательные тонкие с небольшой изогнутостью палочки, иногда встречаются короткие цепочки. Спор и капсул не образует.

Штамм Vibrio cholerae cholerae 5 растет на питательных средах, приготовленных из гидролизатов (мяса, казеина, дрожжей). Оптимальное значение pH 7,6-8,2. Оптимальная температура выращивания микроба - 37^oC. Аэроб. Штамм ферментирует с образованием кислоты глюкозу, левулезу, галактозу, сахарозу, маннит, мальтозу, не ферментирует лактозу, арабинозу, дульцит, сорбит. Молоко свертывает, не образует сероводород, выделяет индол, разжижает желатин. Проба на гемолиз отрицательная. Проба с холерным бактериофагом C-4 на твердой среде - положительная. Не лизируется фагами эльтор.

Генетические особенности: штамм Vibrio cholerae cholerae 5 обладает хорошо амплифицируемыми последовательностями оперона гена, детерминирующего синтез А и В субъединиц холерного энтеротоксина. Результат полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет идентифицировать штамм как потенциально холерогенный. Уровень свечения амплифицированного фрагмента после окраски геля бромистым этидиумом наибольший у штамма Vibrio cholerae cholerae 5.

В объемной реакции агглютинации (РА) агглютинируется ОСО следующим образом: холерной агглютинирующей O-сывороткой до титра (1:3200), холерной Огава - до титра (1:1600), холерной агглютинирующей Инаба и RO - не агглютинируется. Штамм Vibrio cholerae cholerae 5 высокоантигенен, при внутривенной иммунизации лошадей и кроликов корпускулярным O-антигеном стимулирует образование специфических антител в титрах 1:6400120 - 1:4800615, неспецифических антител в титрах 1:1600120 - 1:2200320.

Пример 1. Для получения кроличьей холерной агглютинирующей Огава сыворотки кроликов иммунизировали внутривенно корпускулярным О-антигеном с интервалом между инъекциями три дня в дозах 5, 9, 13 млрд. в 1 мл физ. раствора. На 7 день после последней инъекции антигена выполняли тотальное кровопускание. Полученную сыворотку проверяли в РА на наличие специфических и неспецифических антител. Выявлено, что иммунизация кроликов антигеном вышеназванного штамма вызывает образование специфических антител в сыворотке крови в титре 1:4800615, неспецифических - 1:1600120, т.е. видна разница в титрах специфических и неспецифических антител, что требует всего 2-3 адсорбции.

Пример 2. Для получения холерной лошадиной сыворотки продуцентов иммунизировали внутривенно корпускулярным O-антигеном в два цикла с интервалом между инъекциями в два дня в дозах согласно регламенту (Регламент производства N 144-97). На седьмой день после последней инъекции у лошадей производили забор крови в объеме 6 литров в первый день; через день проводили повторное кровопускание в том же объеме, что и первое. Сыворотку от двух кровопусканий объединяли. В полученной сыворотке проверяли в объемной РА наличие специфических и неспецифических антител, что составляло 1: 6400120 и 1: 2200320 соответственно, т.е. видна разница в титрах специфических и неспецифических антител, это требует так же, как и в кроличьих сыворотках две-три адсорбции.

Таким образом, штамм Vibrio cholerae cholerae 5 рекомендуется использовать в качестве продуцента для получения антител кроличьей холерной Огава сыворотки в промышленном производстве.

Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae cholerae 01 KM 193 5 серовара Огава - продуцент антител холерной Огава сыворотки.