Полипептиды, обладающие активностью легочно-поверхностно активного вещества, и фармкомпозиция
Описываются полипептиды формулы (I) где А - Н или Phe; B - Phe или Trp и С - Ile, Leu или Ser, которые обладают активностью легочного поверхностно-активного вещества, которые получают с высоким выходом и высокой степенью чистоты и которые по своей эффективности не уступают природным легочным поверхностно-активным веществам. Они пригодны для получения фармацевтических композиций для лечения синдрома удушья новорожденных и взрослых. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 1 табл.
Изобретение относится к легочным поверхностно-активным полипептидам, способу их получения и к содержащим их композициям.
Легкие всех позвоночных животных содержат смесь веществ, называемую как "легочное поверхностно-активное вещество". Она проявляет поверхностно-активные свойства и настолько понижает поверхностное натяжение в альвеолярной области легких, что предотвращается коллапс конечных участков дыхательных путей при выдохе. Эта смесь веществ регулирует поверхностное натяжение динамическим образом, так что ожидаемый согласно закону Лапласа коллапс мелких альвеол в пользу более крупных благодаря соответствующей адаптации поверхностного натяжения не происходит. В результате этого образуется хорошо сбалансированная, гистологически и физиологически стабильная структура легких. Легочное поверхностно-активное вещество выделяется альвеолярными пневмоцитами типа II в виде пластинчатых телец. Они представляют собой компактные образования из фосфолипидных двойных слоев с высоким содержанием дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и фосфатидилглицерина (ФГ). Другими основными компонентами, содержащимися в легочных поверхностно-активных веществах, являются протеины, которые обозначаются как SP-A, SP-B и SP-C. SP-A представляет собой высокомолекулярный гликопротеин, играющий основную роль в регуляции секреции. Протеины SP-C и в меньшей степени SP-B выполняют функцию "термодинамических катализаторов" при формировании мономолекулярной поверхностной пленки (в более узком смысле - поверхностно-активного вещества). Благодаря наличию этих протеинов кинетика расширения чрезвычайно ускоряется. Только вследствие этого без задержек возможна адаптация состава поверхностно-активного вещества к соответствующим требованиям поверхностного натяжения. Эти свойства отражаются в крайне гидрофобном характере протеинов, в частности SP-C. Путем экстракции легочной ткани или промывки легких животных можно получить препараты поверхностно-активного вещества, которые как в физико-химической измерительной аппаратуре, например, на животных моделях, так и при клиническом применении проявляют способность компенсировать недостаток поверхностно-активного вещества и тем самым пригодны, например, для терапии детского синдрома удушья (респираторный дистресс-синдром новорожденных (РДСН)). Однако этим препаратам, полученным из животных, присущи серьезные недостатки. Состав фосфолипидов сильно зависит от вида животного, его здоровья и состояния питания и может быть лишь в ограниченной степени сбалансирован примешиванием определенных компонентов. Содержание поверхностно-активных протеинов, а также соотношение SP-B/SP-C подвержено тем же неопределенностям. Кроме того, в терапевтически применяемой смеси также содержатся возможные продукты протеолитического разложения протеинов или модифицированные производные (например, в результате окисления метионина). При продолжительном применении или аппликации больших количеств поверхностно-активного вещества, что может быть необходимо, например, при синдроме удушья у взрослых (шоковые легкие, респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ)) или в других случаях применения, например, при использовании поверхностно-активного вещества в качестве "буксира" для других веществ при легочной аппликации, вопрос, связанный с пополнением вещества, остается открытым. Поэтому эти проблемы предлагается решать путем получения протеинов методами генной инженерии. Так как рекомбинантные протеины, в частности при применении бактериальных систем экспрессии, могут быть получены практически в неограниченных количествах, и существует возможность применения современных методов анализа и контроля качества, то, используя синтетические фосфолипиды, можно получить поверхностно-активное вещество точно определенного состава. Это вещество может оптимально удовлетворять терапевтическим требованиям. Центральная часть человеческого протеина SP-C (см. формулу I, где A - H или Phe; B - Cys; C - Met), который особенно важен для кинетики расширения, состоит исключительно из алифатических, очень гидрофобных аминокислот, таких как валин, лейцин и изолейцин. Длина этой центральной части (аминокислоты 12-34) позволяет интегрировать пептид в мономолекулярную фосфолипидную пленку. В последовательности Pro-Cys-Cys-Pro (позиция 3-6) оба Cys-остатка тиоэтерифицированы пальмитиновой кислотой по SH-группам. Пальмитиновая кислота дополнительно повышает гидрофобный характер всего протеина и одновременно закрывает обе SH-группы цистеинов и защищает их от окисления и образования дисульфидного мостика. Центральная область (аминокислоты 13-34) образует трансмембранную пространственную спираль. Эта область примыкает к N-концу с помощью полярной последовательности, содержащей положительно заряженные аминокислоты (Lys, 10: Arg, 11). В международной заявке WO 91/18015 описывается получение рекомбинантного SP-C и мутантов SP-C. В этой заявке, помимо прочего, предлагается заменить оба цистеина в положениях 4 и 5 двумя серинами. Преимущество этого при получении состоит в том, что после выделения очень гидрофобного протеина отпадает необходимость в технически трудоемком пальмитоилировании обоих цистеинов. Описание изобретения Неожиданно было обнаружено, что SP-C-мутанты, отличающиеся от человеческого белка SP-C заменой обоих цистеинов в положениях 4 и 5 фенилаланином или триптофаном и заменой метионина в положении 32 изолейцином, лейцином или серином, не обладают никакими функциональными потерями в сравнении с природным SP-C, а в отношении стабильности даже превосходят его. При этом значительно упрощается получение с использованием методов генной инженерии с достижением более высокого выхода. Новые полипептиды с легочной поверхностной активностью могут быть получены с высокой чистотой. Предметом изобретения являются поэтому полипептиды с легочной поверхностной активностью, имеющие аминокислотную последовательность общей формулы I![](https://img.poleznayamodel.ru/img_pat/25/256538.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/img_pat/25/256539.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/img_pat/25/256540.gif)
1. Штамм-продуцент
Применяемый штамм-продуцент E. coli 199 имеет происхождение из штамма MM294 E.coli K12, который депонирован под N 5208 в "Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ" (DSM, Брауншвейг). Вектор экспрессии pTrpAmpCAT152: : SPC34(FF/I), содержащий ген слитого протеина CAT152::SPC34(FF/I), был получен из ДНК-последовательности pBR322, т. е. ColEI-производного [E. Weber (ред.), (1988), Biologische Sicherheit, Bundesministerium fur Forschung und Technologie, Bonn]. В плазмиде pKK233-2, поставляемой фирмой Pharmacia, с помощью EcoRI/HindIII был вырезан Trc-промотор и заменен синтетическим Trp-промотором (pTrp233). Последний состоит из промоторной области (участок связывания РНК-полимеразы), операторной области (участок связывания Trp-репрессора), последовательности Шайна-Дальгарно (S/D-последовательности), а также сайтов рестрикции для клонирования. За Trp-промотором был вставлен ген (CAT152), кодирующий 152 аминокислоты 5'-части бактериальной хлорамфеникол-ацетил-трансферазы. С частью CAT152 ДНК-последовательности был слит синтетический фрагмент гена, кодирующий 34 аминокислоты подобного человеческому протеина SP-C(FF/I). Функциональный транскриптон CAT: : SPC(FF/I) заканчивается бактериальной rrnB-последовательностью T1T2, терминирующей транскрипцию. Полученная конструкция обозначается как pTrpAmpCAT152::SPC34(FF/I). Вектор pTrpAmpCAT::SPC(FF/I) имеет следующие функциональные элементы:
- ген CAT152::SPC34(FF/I), управляемый Trp-промотором и T1T2- терминатором транскрипции;
- ori-область и соседние области, которые управляют числом копий плазмиды;
- ген Amp
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/174.gif)
После помещения плазмиды в клетку-хозяина последняя имеет высокое число копий гена CAT::SPC(FF/I), контролируемого Trp-промотором. Trp-репрессор вырабатывает сама клетка-хозяин. Ферментативное получение rCAT::SPC регулируется концентрацией триптофана в среде, соответственно добавлением
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
С помощью пробирки Working Cell Bank (культура глицерина) культуральную среду (состав см. ниже) высевают в шейкер (предварительная или начальная культура 1 л) и при 37oC инкубируют при встряхивании и при сильной ампициллинзависимой селекции. За ростом следят по оптической плотности при 578 нм. По достижении начальной культурой E.coli 199 оптической плотности более 3 культуру высевают в 10-литровый ферментер и продолжают выращивание бактерий при уменьшенной ампициллинзависимой селекции. После достижения значения оптической плотности между 5 и 6 10-литровую культуру переносят в 100-литровый ферментер и продолжают инкубировать в тех же условиях. После достаточного роста путем добавления, например, 40 мг/л
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/183.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/183.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/8805.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/8776.gif)
100 г Сухих телец включения растворяют при легком нагревании в 1,6 л 8-молярного раствора гидрохлорида гуанидина (917,1 г). Нерастворившийся остаток отфильтровывают через складчатый фильтр. Для расщепления слитого протеина по месту связывания Asn-Gly к раствору добавляют 167 г гидроксиаммонийхлорида и pH раствора доводят 2Н NaOH до 9,6. Расщепляющий раствор затем оставляют стоять на 3-4 дня при комнатной температуре при перемешивании. По завершении реакции добавлением 6,4 л трис-буфера (pH 8,0) осаждают SP-C(FF/I) и его отделяют с помощью центрифугирования (центрифуга Sorvall RC2-B, 20000g). Надосадочную жидкость декантируют, осажденные центрифугированием SP-C повторно суспендируют в 400-500 мл трис-буфера и снова центрифугируют при тех же условиях в течение 30 мин. Осажденный центрифугированием SP-C растворяют в 3,5 л смеси хлороформа, метанола и соляной кислоты (1,75 л CHCl3 + 1,75 л CH3OH + приблизительно 30 мл 2Н HCl). Этот сырой раствор SP-C далее очищают с помощью препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) на C8 в качестве материала обращенной фазы. Хлороформ/метанольный экстракт перед загрузкой на колонку для препаративной ЖХВД разбавляют 90%-ным метанолом в соотношении приблизительно 1: 2. Из этого раствора в колонку (диаметр 5 см) можно загружать, например, приблизительно 400 мг SP-C(FF/I) (например, разбавленного
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/8776.gif)
Липофильный пептид SP-C(FF/I) смешивают в изопропанольном растворе с компонентами фосфолипидной матрицы и осаждают путем впрыскивания в разбавленный раствор поваренной соли (0,065% вес/вес NaCl) при комнатной температуре в гомогенной смеси с компонентами фосфолипидной матрицы. Из суспензии легочного поверхностно-активного вещества на стаканчиковой центрифуге отделяют легочное поверхностно-активное вещество (ЛПАВ), ресуспендируют в растворе электролита (NaCl, CaCl2) и с помощью 0,1Н NaOH pH доводят до 6,5. Эту водную суспензию разливают по 20-миллилитровым ампулам и лиофилизуют. Приведенные в нижеследующем примере получения весовые и объемные данные относятся к получению 10-граммового препарата легочного поверхностно-активного вещества. 7,00 г Дипальмитоилфосфатидилхолина (ДРФХ), 3,08 г аммониевой соли пальмитоилолеилфосфатидилглицерина (ПОФГ х NH4) и 0,25 г пальмитиновой кислоты растворяют при 40oC в 200 мл 90%-ного изопропанола и затем охлаждают до комнатной температуры. Полученный раствор фосфолипида объединяют с 1 л раствора, полученного после ЖХВД-очистки и содержащего 200 мг очищенного SP-C(FF/I). Значение pH полученного "распыляемого раствора" доводят при перемешивании раствором бикарбоната (приблизительно 5 мл 5%-ного раствора NaHCO3) до 4,5. "Распыляемый раствор" при интенсивном перемешивании вводят при комнатной температуре со скоростью впрыскивания 25 мл/мин через однокомпонентное сопло в 9,6 л разбавленного раствора NaCl (0,065% вес/вес). Образуется опалесцирующий раствор, из которого после двухчасовой выдержки при 4-8oC при впрыскивании раствора электролита (3,0 г CaCl2
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/183.gif)
Формула изобретения
![](https://img.poleznayamodel.ru/img_pat/25/256541.gif)
где A - H или Phe;
B - Phe или Trp;
C - IIe, Leu или Ser. 2. Полипептиды по п.1, отличающиеся тем, что A - H или Phe, B - Phe и C - Ile. 3. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что A - Phe, B - Phe и C - Ile. 4. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что A - H, B - Phe и C - Ile. 5. Фармацевтическая композиция для лечения респираторного дистресс-синдрома (РДС) у млекопитающих, содержащая легочный поверхностно-активный полипептид по одному из пп.1 - 4, фосфолипиды, жирные кислоты и электролиты при следующем соотношении (мас.%):
Фосфолипиды - 80 - 95
Полипептиды - 0,5 - 3,0
Жирные кислоты - 4 - 7
Электролиты - 1 - 3
6. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что в качестве легочного поверхностно-активного вещества она содержит по меньшей мере один легочный поверхностно-активный полипептид из группы SP-A и SP-B. 7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что в качестве легочного поверхностно-активного вещества она содержит SP-B. 8. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что в качестве фосфолипидов она содержит дипальмитоилфосфатидилхолин, пальмитоилолеилфосфатидилглицерин и/или фосфатидилглицерин. 9. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что в качестве электролитов она содержит соли кальция и/или натрия.
РИСУНКИ
Рисунок 1PD4A - Изменение наименования обладателя патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение
(73) Новое наименование патентообладателя:
Никомед ГмбХ (DE)
Адрес для переписки:
101000, Москва, М.Златоустинский пер., д. 10, кв. 15, «ЕВРОМАРКПАТ»
Извещение опубликовано: 20.08.2008 БИ: 23/2008