Гибридная клеточная линия (варианты), препарат антител (варианты), способ диагностики рассеянного склероза у человека (варианты), способ лечения человека, полипептид

 

Изобретение относится к медицине, точнее к нейроиммунологии, а именно к тесту на антигены, ассоциированные с рассеянным склерозом. Также предметом настоящего изобретения является генерация гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела, специфичные в отношении антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом, а также к полипептиду. Возможности применения настоящего изобретения заключается в диагностике рассеянного склероза и в текущем диспансерном наблюдении за больными рассеянным склерозом с точки зрения развития болезни либо реакции на терапию. Техническим результатом изобретения является возможность диагностики и лечения рассеянного склероза и других демиелинизирующих заболеваний. 12 с. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл.

Настоящее изобретение относится к выявлению заболеваний, связанных с димиелинизацией, таких как рассеянный склероз. Конкретнее, предметом данного изобретения является тест для обнаружения антигена(ов), ассоциированного с рассеянным склерозом и родственными заболеваниями. Предметом настоящего изобретения также является генерация гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела, специфичные для антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом. Настоящее изобретение можно использовать при диагностике рассеянного склероза и в текущем диспансерном наблюдении за больными рассеянным склерозом с точки зрения развития болезни либо реакции на терапию.

Рассеянный склероз является медленно прогрессирующим заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), отличительным признаком которого с точки зрения патологии являются рассеянные бляшки демиелинизации в спинном и головном мозге, а клинически - множественные объективные и субъективные признаки с периодами ремиссий и обострений. Демиелинизация - это исчезновение миелина, защитного липидного материала, который окружает аксон нервных волокон. К заболеваниям, родственным рассеянному склерозу, относятся состояния, при которых происходит демиелинизация нервов.

Начало рассеянного склероза, как правило, протекает без выраженных симптомов. Обычно незначительные видимые нарушения, поверхностный глазной паралич, временная слабость, некоторая тугоподвижность либо необычная утомляемость конечностей, незначительные нарушения походки, трудности с контролем мочеиспускания, происходящие время от времени головокружения или легкие эмоциональные расстройства - симптомы рассеянного поражения ЦНС - наблюдают за месяцы или годы до того, как болезнь бывает диагностирована.

Среди различных симптомов рассеянного склероза отличают следующие: парастезии, охватывающие одну или более конечностей или одну сторону лица, слабость или тяжесть конечностей; зрительные расстройства, такие как частичная слепота одного глаза, диплопия, тусклость зрения или зрительные скотомы; расстройства мочеиспускания; депрессии. (Парастезия - это ненормальное ощущение, такое как жжение, покалывание и формикация).

Самопроизвольные ремиссии затрудняют оценку эффективности лечения. Несмотря на то, что средняя продолжительность жизни после начала заболевания составляет от 10 до 20 лет, многие пациенты живут дольше. У некоторых пациентов происходят частые приступы, и они быстро теряют трудоспособность, в то время как у других бывают ремиссии, продолжающиеся до 25 лет.

Диагностика заболевания затруднена из-за наложения вышеуказанных симптомов рассеянного склероза и сходных симптомов других заболеваний ЦНС. Диагностику рассеянного склероза чаще всего проводят с учетом истории ремиссий и обострений различных симптомов в течение ряда лет в сочетании с систематическим исключением других возможных заболеваний, имеющих сходные симптомы. Для того, чтобы исключить следующие заболевания, являющиеся источниками сходных симптомов: внутричерепные повреждения, поражения сосудов головного мозга, акустическую невриному, мозжечковые опухоли, глиомы ствола мозга, опухоли спинного мозга, сифилис, пернициозную анемию, артрит шейного отдела позвоночника, перфорацию межпозвонкового диска, пластибазию и наследственную атаксию проводят обширное дорогостоящее обследование, зачастую физически неприятное для пациента.

Существенные усилия были направлены на разработку методов диагностики и веществ, которые могут быть применены для ранней диагностики рассеянного склероза. Положительные результаты анализов спинно-мозговой жидкости с применением коллоидного золота считают подтверждающими, но не окончательно устанавливающими положительный диагноз. То же самое относится и к тестированию на повышенный уровень гамма-глобулина в спинно-мозговой жидкости - тест подтверждает диагноз на прогрессирующих стадиях, но он не дает результатов при диагностике на ранних стадиях. Аналогично, активная димиелинизация, ассоциированная с заболеванием, часто проявляется в повышении аналитических результатов при определении основного белка при тестировании спинно-мозговой жидкости, но тестируемые уровни быстро снижаются сразу после окончания обострения. Были выявлены косвенные корреляции между существованием болезненного состояния и повышенными уровнями коревых антител в сыворотке и спинно-мозговых жидкостях. И наконец, ряд исследователей высказал предположение о том, что электронно-микроскопическое исследование лимфоцитов на наличие некоторых четких морфологических изменений может служить серьезным основанием для диагностики рассеянного склероза.

Известен [1] возможный иммунологический маркер для рассеянного склероза. Этот маркер не был ни очищен, ни охарактеризован. Кроме того, нигде не указано, что все или большинство животных реагировали производством соответствующего изотипа и количества антител, и не было показано, что все или большинство животных различных видов должны реагировать типичным образом. Соответствие некоторым из этих требований необходимо для коммерческого использования, например при применении антисывороток в диагностическом тесте.

Разработка диагностических способов и материалов для быстрого, простого и точного определения наличия рассеянного склероза остается существенной необходимостью. Такие способы должны быть высокоспецифичными в отношении рассеянного склероза и близкородственных заболеваний, для того, чтобы избежать получения ложных положительных результатов из-за других заболеваний центральной нервной системы, других иммунных расстройств или принимаемых препаратов. Далее, такие способы должны обеспечивать возможность диагностики рассеянного склероза на его ранних стадиях, не должны включать болезненные или опасные изъятия препаратов тканей пациента и должны предпочтительно включать стандартизованные лабораторные методики, которые не требуют дорогой или сложной аппаратуры.

Настоящее изобретение относится к способу выявления рассеянного склероза у пациента. Настоящее изобретение относится также к либо поликлональным, либо моноклональным антителам, специфичным в отношении антигенов, связанных с наличием рассеянного склероза. Подобные антитела применяют в иммунологических анализах для обнаружения антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом, что делает, таким образом, возможным диагностику рассеянного склероза.

Настоящее изобретение относится к характеристике клеточной линии, продуцирующей моноклональное антитело, обозначенной HB 11152 в Американской коллекции Типовых культур ("ATCC"), которая проявляет специфичность в отношении эпитопа на антигенах, ассоциированных с рассеянным склерозом, у пациентов, страдающих рассеянным склерозом. Настоящее изобретение также относится к характеристике клеточной линии, производящей моноклональное антитело, обозначенной HB 11153 в ATCC, которая проявляет специфичность в отношении эпитопа на антигенах, ассоциированных с рассеянным склерозом, у пациентов, страдающих рассеянным склерозом.

Данное изобретение включает также любой препарат антитела, включающий диагностически эффективное количество антитела, или его связывающего фрагмента, которое конкурентно ингибирует связывание моноклонального антитела, производимого гибридомной клеточной линией ATCC N HB 11152 или HB 11153, с антигенами, ассоциированными с рассеянным склерозом, что определяется посредством ферментного иммунологического анализа либо другого иммунологического анализа на конкурентное ингибирование. Оно включает любое антитело, либо его связывающий фрагмент, которое ингибирует связывание HB 11152 или HB 11153 антител с их соответствующими эпитопами на антигенах, ассоциированных с рассеянным склерозом. Эпитопы являются структурным компонентом молекулы антигена, ответственным за его специфическое взаимодействие с молекулами антител.

Настоящее изобретение предлагает также способ и состав для смягчения симптомов болезненных состояний, ассоциированных с демиелинизацией, что наблюдается при рассеянном склерозе. Настоящее изобретение включает в себя введение человеку или животному с рассеянным склерозом эффективной дозы антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом или их ассоциированных нуклеотидных последовательностей. Эффективная доза - это уровень, который не вызывает побочных эффектов, таких как анафилактическая реакция.

До настоящего изобретения были неизвестны специфические антигенные маркеры рассеянного склероза, антитела, специфичные в отношении маркеров, и ассоциированный тест для диагностики рассеянного склероза.

Соответственно задачей данного изобретения является разработка чувствительного иммунологического анализа для выявления рассеянного склероза у людей.

Другой задачей данного изобретения является разработка иммунологического анализа, который является высокоспецифичным в отношении обнаружения рассеянного склероза и не дающего ложных положительных результатов у пациентов с другими заболеваниями центральной нервной системы.

Другой задачей данного изобретения является разработка чувствительного иммунологического анализа для ранней диагностики рассеянного склероза у людей.

Другой задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного иммунологического анализа для текущего диспансерного наблюдения за пациентами с рассеянным склерозом для оценки развития болезни и реакции на терапию.

Также другой задачей настоящего изобретения является разработка эффективного по стоимости способа обнаружения рассеянного склероза: как альтернативу существующему способу, который состоит из серии тестов, предназначенных для элиминирования других сходных, родственных нервных расстройств.

Другой задачей настоящего изобретения является разработка быстрого способа обнаружения рассеянного склероза с помощью иммунологического анализа.

Другой задачей настоящего изобретения является разработка простого определяющего теста на рассеянный склероз.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение настолько быстрого, насколько это возможно, начала лечения пациентов с рассеянным склерозом, поскольку только один тест включен в диагностику рассеянного склероза.

Другой задачей настоящего изобретения является разработка способа и состава для смягчения симптомов болезненных состояний, ассоциированных с демиелинизирующими заболеваниями, такими как рассеянный склероз.

Другой задачей настоящего изобретения является получение очищенного белка, ассоциированного с наличием рассеянного склероза или другого родственного демиелинизирующего заболевания у человека или животного.

Эти и другие задачи, особенности и преимущества данного изобретения станут очевидными после обзора следующего подробного описания предлагаемых вариантов реализации и прилагаемой формулы изобретения.

Фиг. 1 иллюстрирует результаты иммунологического анализа антисывороток, полученных из нескольких кроликов, иммунизированных ЛПК экстрактом рассеянного склероза и тестировавшихся антигеном(ами) рассеянного склероза или экстрактом из нормальных клеток.

На фиг. 2 представлены результаты блоттингов по Вестерну ЛПК экстрактов из ЛПК от пациентов с рассеянным склерозом и нормальных пациентов.

На фиг. 3 представлены результаты анализов сывороток от мышей, иммунизированных антигенами, ассоциированными с рассеянным склерозом.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий результаты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) сывороток от нормальных пациентов и пациентов, у которых с помощью поликлональных антител против антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом, диагностирован рассеянный склероз.

Фиг. 5 представляет собой график, показывающий результаты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) сывороток от нормальных пациентов и пациентов, у которых с помощью 6D4.2 моноклонального антитела против антигена, ассоциированного с рассеянным склерозом, диагностирован рассеянный склероз.

Настоящее изобретение предлагает способ обнаружения рассеянного склероза у пациента. Настоящее изобретение предлагает также поликлональные или моноклональные антитела, специфичные в отношении антигенов, связанных с наличием рассеянного склероза. Такие антитела могут быть применены в иммунологических анализах для обнаружения антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом, обеспечивая, таким образом, возможность диагностирования рассеянного склероза.

Настоящее изобретение предлагает также моноклональное антитело, продуцируемое клеточной линией, обозначенной HB 11152 в ATCC, которое обладает специфичностью в отношении эпитопа на антигенах, ассоциированных с рассеянным склерозом, который наблюдается у пациентов, страдающих рассеянным склерозом. Настоящее изобретение предлагает также характеристику моноклонального антитела, продуцируемого клеточной линией, обозначенной HB 11153 в ATCC, которое обладает специфичностью в отношении эпитопа на антигенах, ассоциированных с рассеянным склерозом у пациентов, страдающих рассеянным склерозом.

Настоящее изобретение включает также любой препарат антитела, содержащий диагностически эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента, которое конкурентно ингибирует связывание моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией ATCC N HB 11152 или HB 11153, с антигенами, ассоциированными с рассеянным склерозом, что определяется посредством ферментного иммунологического анализа либо какого-либо другого иммунологического анализа на конкурентное ингибирование. Сюда относится любое антитело, либо его связывающий фрагмент, которое ингибирует связывание HB 11152 или HB 11153 антител с их соответствующими эпитопами на антигенах, ассоциированных с рассеянным склерозом. Эпитопы являются структурным компонентом молекулы антигена, ответственным за его специфическое взаимодействие с молекулами антитела.

Согласно настоящему изобретению антитела, которые продуцируются клеточной линией HB 11152 и/или HB 11153, либо антитела, которые конкурентно ингибируют связывание антителами, продуцируемыми HB 11152 или HB 11153 клеточными линиями, могут быть применены в любом анализе, в котором для обнаружения антигенов используют антитела. Сюда включаются иммунологические анализы связывания ферментов, радиоиммунологические анализы, флуоресцентные иммунологические анализы, биолюминесцентные и хемилюминесцентные иммунологические анализы, конкурентные иммунологические анализы, дот-блоттинговые методы и анализы с использованием блоттинга по Вестерну.

Настоящее изобретение включает также очищенный белок либо белки или их ассоциированные РНК-овые или ДНК-овые нуклеотидные последовательности, которые, как было показано, ассоциированы с наличием рассеянного склероза и родственных заболеваний, связанных с димиелинизацией. Анализ ДНК-овых последовательностей хорошо известен специалистам и включает блоттинг по Саузерну и гибридизацию по Норзерну [2]. Антиген(ны), ассоциированный с рассеянным склерозом, является белком, который может быть выделен из белых кровяных телец. Белок имеет молекулярный вес между приблизительно 14000 и 16000 дальтон согласно результатам электрофореза в SDS полиакриламидном геле. Было показано, что белок присутствует у пациентов, страдающих рассеянным склерозом.

Настоящее изобретение включает также способ получения моноклональных антител, продуцируемых клонированной клеточной линией(ями) гибридомы В против антигена(ов), ассоциированного с рассеянным склерозом. Получение гибридомы и продуцирование моноклонального антитела может быть осуществлено различными способами, хорошо известными из уровня техники. Применяют стандартные методы иммунизации, тестирования, слияния, культивирования и клонирования [3], которые включены здесь по сноске. Цель данной работы - иметь специфические антитела, которые могут быть очищены и успешно использованы в различных методах, включая иммунологические анализы.

Согласно настоящему изобретению эти антитела продуцируются гибридными клеточными линиями, полученными путем слияния и клонирования продуцирующих антитела клеток, таких как, например, иммунные лимфоциты селезенки, и партнера для слияния, такого как, например, клеточная линия SP2/O. Иммунные лимфоциты селезенки получают из суспензии отдельных клеток, приготовленной из селезенок BALB/c мышей, о которых известно, что они продуцируют антитела к антигену(ам). Эту реактивность проверяют с помощью блоттинга по Вестерну и твердофазного иммуноферментного анализа ("ELISA") на образцах сывороток от иммунизированных мышей. Эти антитела могут реагировать против эпитопа(ов) на поверхности антигена(ов) и их получают из клонированной клеточной линии(ий).

Антитела, которые продуцируются, как описано здесь, являются специфическими в отношении антигена(ов), ассоциированного с рассеянным склерозом, и их характеризуют согласно изотипу: HB 11152 продуцирует 6D4, который является lgG подкласса 3; и HB 11153 продуцирует 3D3, который является lgM антителом. В случае, когда гибридомы растут непрерывно, они являются постоянным источником отдельного антитела. На депозит ATCC патентного хранилища в Rockville, MD., были занесены две гибридомы, обозначенные как HB 11152 и HB 11153.

В дополнение к использованию очищенных моноклональных антител для сенсибилизации в качестве захватывающего реагента, существуют другие области, где анализ может быть усилен в отношении специфичности, чувствительности и условий анализа, включающие в себя, но не ограниченные, применением: 1) прямо сконъюгированных с ферментом (включая пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, глюкозооксидазу, уреазу и др. ) антител либо анти-биотиновых антител, 2) биотин-сконъюгированных моноклональных антител, 3) био- либо хемолюминесцентно меченных антител, 4) флуоресцентно меченных антител и 5) антител, меченных радиоактивным изотопом.

Антитела, специфичные в отношении антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом, могут быть применены в целом ряде различных диагностических тестов. Такие анализы включают в себя твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), блоттинг по Вестерну, радиоиммунный анализ, биолюминесцентный анализ и хемилюминесцентный анализ, но не ограничиваются ими. Подобные иммунологические анализы хорошо известны специалистам; их описание можно легко найти [4].

Методика и результаты сэндвич-твердофазного иммуноферментного анализа (сэндвич-ELISA) с применением антител согласно данному изобретению описаны в примерах 11 и 12.

Одним из примеров анализа с применением антител, специфичных в отношении антигенов рассеянного склероза согласно настоящему изобретению, является метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Согласно настоящему изобретению у человека берут пробу крови. Предпочтительно, чтобы лимфоциты периферической крови ("ЛПК") выделяли из образца крови, а затем проводили экстракцию митогенов, ассоциированных с рассеянным склерозом, из общего пула ЛПК, если они там присутствуют. Настоящее изобретение включает в себя применение нуклеотидных последовательностей или их фрагментов, ассоциированных с белковой компонентой рассеянного склероза, для диагностики рассеянного склероза или родственных рассеянному склерозу заболеваний с применением таких методов, как гибридизация по Норзерну и гибридизация по Саузерну или нуклеотидных последовательностей.

Затем ЛПК экстракт вводят в специально сконструированный контейнер, который содержит антитела, специфичные в отношении антигена множественного склероза, которые уже пришиты к контейнеру. "Захватывающие" антитела реактивны в отношении антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом. Антигены, ассоциированные с рассеянным склерозом, присутствующие в ЛПК экстракте, связываются затем с антителами, пришитыми к контейнеру.

Затем к смеси добавляют вторую серию антител, "первичных" антител, которые специфичны в отношении антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом. Эти первичные антитела будут связываться только с теми антигенами, ассоциированными с рассеянным склерозом, которые уже связаны с захватывающими антителами, пришитыми к контейнеру. Первичные антитела отличаются также тем, что они были модифицированы путем добавления метки, такой как фермент. Затем контейнеры промывают для удаления всех несвязавшихся антител. Метка поэтому будет присутствовать только в той степени, в которой присутствуют антигены, ассоциированные с рассеянным склерозом.

В качестве альтернативы вышеописанному анализу может выполняться анализ с использованием трех различных антител. Вместо сконъюгированного первичного антитела может быть применено вторичное сконъюгированное антитело, которое является селективным в отношении первичного антитела. Применение вторичного сконъюгированного антитела усиливает результирующий сигнал. С другой стороны, могут быть использованы меченные биотином антитела с меченными либо авидином, либо стрептавидином ферментами, или антитела против биотина, сконъюгированные с ферментами.

Независимо от того, применяют ли первичное сконъюгированное антитело или двухступенчатое, первичное плюс вторичное, сконъюгированное антитело, сконъюгированное антитело может быть мечено соединением, принадлежащим к следующей группе: радиоактивный изотоп, фермент, флуорогенный материал или люминесцентный маркер. Определение того, присутствуют ли антигены, ассоциированные с рассеянным склерозом, может быть выполнено следующими соответствующими способами: радиометрически, ферментативно, флуорометрически и посредством люминесценции.

Для целей диагностики могут быть скомпанованы антитела и другие необходимые реагенты и соответствующие приборы в виде набора для выполнения удобных, доступных анализов.

Настоящее изобретение предлагает также способ и состав для облегчения симптомов рассеянного склероза и ему подобных заболеваний. Настоящее изобретение предусматривает введение человеку или животному, страдающему связанным с демиелинизацией заболеванием, таким как рассеянный склероз, эффективной дозы антигенов, ассоциированных с рассеянным склерозом, или их фракции, либо их ассоциированных нуклеотидных последовательностей или их фракции. Эффективная доза - это уровень, который не вызывает анафилактической реакции.

В настоящем изобретении под факторами, ассоциированными с рассеянным склерозом, понимают один или несколько белков, ассоциированных с рассеянным склерозом, фракции или производные белков, ассоциированных с рассеянным склерозом, либо РНК-овые или ДНК-овые последовательности или их фракции, которые ассоциированы с белковой компонентой, ассоциированной с рассеянным склерозом. Практически настоящее изобретение предусматривает введение менее чем приблизительно 10^-2 мг на единичную дозу человеку или животному с рассеянным склерозом. Предпочтительная доза факторов, ассоциированных с рассеянным склерозом, или их ассоциированных нуклеотидных последовательностей или их фракций, либо их активных производных, лежит между приблизительно от 10^-2 мг до 10^-10 мг. Более предпочтительная доза факторов, ассоциированных с рассеянным склерозом, составляет между приблизительно 10^-4 мг и 10^-8 мг. Наиболее предпочтительная доза факторов, ассоциированных с рассеянным склерозом, составляет приблизительно 10^-7 мг. Предпочтительно, чтобы общая периодическая дневная дозировка не превышала приблизительно 10^-2 мг на пациента, и еще более предпочтительно, чтобы она не превышала значений приблизительно от 5 10^-3 до 10^-4 мг.

Настоящее изобретение предусматривает введение количества, не превышающего приблизительно 10^-2 мг, хотя в определенных случаях общее количество факторов, ассоциированных с рассеянным склерозом, вводимых в течение одного дня, может превышать предпочтительный предел. Факторы, ассоциированные с рассеянным склерозом, могут вводиться в виде жидкости, либо они могут вводиться в твердом виде в случае, когда факторы, ассоциированные с рассеянным склерозом, введены или смешаны с основой, подверженной биологической деградации или утилизации. Такая основа может высвобождать факторы постепенно. Такие основы хорошо известны специалистам и не являются принципиальными для настоящего изобретения. Факторы, ассоциированные с рассеянным склерозом, могут быть введены посредством предпочтительно подкожной инъекции либо под язык. Могут быть применены другие варианты введения, такие как внутримышечное, парентеральное, внутривенное или внутрикожное.

В одной реализации используемым наполнителем является водный раствор, который содержится внутри инертного контейнера. В другом варианте состав находится в виде суппозитория. Жидкую форму состава предпочтительно вводят подкожно, хотя допустимы другие варианты инъекций как часть настоящего изобретения. Кроме того, состав может быть введен через мембраны слизистых оболочек, таких как носовые мембраны. Жидкий носитель включает 0,1%-ный фенол в солевом растворе (0,9%-ный NaCl), но не ограничивается им. Для введения факторов, ассоциированных с рассеянным склерозом, могут быть применены другие фармацевтически допустимые носители.

Факторы, ассоциированные с рассеянным склерозом, могут быть введены стандартными способами, которые включают внутримышечный и подкожный пути введения, но не ограничиваются ими. Факторы, ассоциированные с рассеянным склерозом, также могут быть введены подъязычным и внутриносовым путями. Поскольку эффективное количество факторов, ассоциированных с рассеянным склерозом, в дозе очень мало, то состав согласно настоящему изобретению также может быть введен внутрикожно, анально или перорально. Единичные дозы могут быть либо жидкими, либо твердыми. Как правило, единичная доза может быть введена максимум около 4 раз в день, хотя в определенных случаях может быть введено большее количество доз.

Далее настоящее изобретение иллюстрируют следующие примеры, которые не должны быть истолкованы никоим образом как ограничения его возможностей. Напротив, должно быть совершенно понятно, что может быть осуществлено обращение к различным другим реализациям, модификациям и их эквивалентам, которые после чтения приведенного здесь описания могут возникнуть у специалистов, не приводя к отклонению от духа настоящего изобретения и/или границ прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1.

Сбор, выделение и гомогенизацию антигенных ЛПК производят следующим образом.

Образцы крови от пациентов, у которых диагностирован рассеянный склероз, либо другие неврологические состояния, были предоставлены Д-ром Gary Duncan из Неврологической Ассоциации, Nashville, Tennessee. Кроме того, также предоставили образцы крови члены группы содействия борьбе с рассеянным склерозом, Greenville, South Carolina.

Антигенные лимфоциты периферической крови ("ЛПК") получают от людей, страдающих рассеянным склерозом либо другими расстройствами, следующим образом: кровь собирают посредством венопункции из вены руки, за исключением случаев, показанных особо. От каждого пациента забирают приблизительно 17 мл в две желтые чашки для сбора крови Vacutainer Brand Evacuated Blood Collection Tubes (Becton-Dickinson, Baltimore,MD). В каждой такой пробирке находится 8,5 мл взятой крови и каждая содержит 1,5 мл раствора лимоннокислой декстрозы (Acid Citrate Dextrose Solution), которая действует как антикоагулянт. Заполненные герметически закупоренные пробирки, хранящиеся при комнатной температуре (15-30^oC), быстро перевозят из различных мест сбора в лабораторию Cell Med, Inc., Columbia, MD.

По получении образцы ресуспендируют путем опрокидывания пробирок несколько раз сразу перед центрифугированием. Пробирки центрифугируют в течение 10 минут при 2000 об/мин в центрифуге IC. С помощью одноразовых пластиковых Пастеровских пипеток собирают лейкоцитарную пленку, находящуюся на границе раздела плазма/клетки, и доводят общий объем до 6,5 мл с помощью забуференного фосфатом физиологического раствора ("ЗФР"). ЗФР содержит 9,0 г/л NaCl, 0,8 г/л Na₂HPO₄ и 0,15 г/л KH₂PO₄ с pH, доведенным до 7,4. Равные количества материала лекоцитарной пленки наслаивают на поверхность 3 мл промышленной среды для разделения (Histopaque Н-1077, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) в двух центрифужных пробирках емкостью 15 мл. Затем материал центрифугируют в течение 40 минут при 2000 об/мин. ЛПК также могут быть отделены от сырой крови, наслоенной на поверхность фиколла.

После стадии центрифугирования Пастеровской пипеткой собирают ЛПК-обогащенную границу раздела и доводят ее объем до 15 мл добавлением ЗФР, осаждают центрифугированием в течение 10 минут и ресуспендируют в 3 мл ЗФР. Материал продавливают туда-сюда через пипетку емкостью 5 мл по меньшей мере 5 раз и переносят в Dounce стеклянный гомогенизатор. Клетки гомогенизируют 20- ю пассажами пестика вверх-вниз. В альтернативном случае клетки разрушают и затем гомогенизируют путем пропускания через иглу 27-ого калибра 20 раз. Эти экстрагированные материалы хранят затем замороженными при -70^oC.

Когда для быстрой обработки собрано слишком много образцов, ЛПК могут быть собраны в ЗФР после стадии Histopaque и вместо ресуспендирования в ЗФР для гомогенизации клетки могут быть ресуспендированы в 1 мл Cryomedia (RMPI 1640, 10% фетальной бычьей сыворотки и 7,5% диметилсульфоксида) и заморожены при -70^oC. Затем клетки оттаивают при 37^oC, разводят 13 мл ЗФР, собирают посредством центрифугирования в течение 10 минут при 2000 об/мин, ресуспендируют в ЗФР и гомогенизируют, как описано выше.

Пример 2.

Приготовление ЛПК экстрактов для иммунизации кроликов и мышей производят следующим образом ЛПК экстракты, полученные от пациентов, страдающих рассеянным склерозом, объединяют для того, чтобы иметь достаточно материала для иммунизации нескольких животных от показательного количества больных рассеянным склерозом. Когда иммуногенный пул подготовлен, весь материал смешивают несколько раз путем перевертывания, собирают в чистый контейнер и затем перемешивают перед переносом аликвотами по 2 мл в криопузырьки емкостью 2 мл. Содержание белка, определенное методом Pierce ВСА (Pierce Rockford, IL.) колеблется в пределах 0,8-1,1 мг/мл для нескольких различных представительных групп. Этот материал затем хранят замороженным приблизительно при -70^oC до момента использования Для целей иммунизации антиген(ы), описанный выше, размораживают и смешивают с равным количеством адъюванта Фройнда (Sigma Chemical Company, St. Louis, МО). Адъювант является полным для первичной прививки, либо неполным для последующих иммунизаций. Смесь эмульгируют путем перемешивания в плотно закрытом сосуде, содержащем стеклянные шарики (4-6 мм диаметром). Эмульгированный состав оставляют для осаждения в покое в течение 10 минут для того, чтобы убедиться, что эмульсия стабильна и не разделяется до переноса в шприц и введения животным.

Пример 3.

Иммунизация кроликов и мышей для получения антисывороток против факторов, ассоциированных с рассеянным склерозом.

Каждому кролику (Новозеландские белые, 4-6 фунтов каждый) делают прививку по меньшей мере в двух местах, по одному с каждой стороны. Каждая прививка состоит из 0,5 мл эмульгированного состава, описанного выше. Для мышей (Balb/C, Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN.) общая иммунизационная доза составляет 0,1 мл, внутрибрюшинно. Обычно кроликов иммунизируют и анализируют кровь на 0, 14, 28 и 42-ые сутки. Кроличью кровь собирают из ушной вены посредством венепункции, оставляют для свертывания, а затем сыворотку отделяют от клеточных элементов в этот же или на следующий день. У мышей кровь анализируют только один раз или дважды путем забора из глазничной или хвостовой вен. Если осуществляют другие процедуры, такие как прививки антигеном, то все анализируемые образцы крови забираются перед тем, как производят операцию иммунизации.

Пример 4.

Анализ иммунного ответа производят следующим образом.

Сыворотки от иммунизированных мышей или кроликов тестируют затем на специфическую реактивность в отношении ассоциированного с рассеянным склерозом антигена(ов) с помощью различных методик, чаще всего твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и лейкоцитарного (WB) анализа.

Во-первых, микроаналитический планшет (Высокого связывания, Nunc, Helsinki, Finland) сенсибилизируют за счет физической абсорбции иммунизирующего антигена(ов) в оптимальном разведении, которое составляло по предварительной оценке приблизительно от 1/100 до приблизительно 1/1000, в бикарбонатном буфере (1,602 г/л Na₂CO₃, 2,93 г/л NaHCO₃ и 0,2 г/л NaN₃) в течение от одного до семи дней приблизительно при 4^oC. Перед употреблением, сенсибилизированные микроаналитические лунки блокируют 0,2%-ным бычьим сывороточным альбумином ("БСА") в ЗФР (0,2% БСА/ЗФР). Могут быть применены другие блокирующие агенты, такие как желатин и гидролизированное снятое молоко. После блокировки в течение 15 минут планшеты промывают ЗФР с 0,05% Твин-20 (как БСА, так и Твин производства Sigma Chemical Company). Все инкубации проводят приблизительно при 37^oC в течение 1-2 часов.

Используют объемы образца, конъюганта и субстрата, равные 100 мкл/лунку, и пять объемов, равных 200 мкл, для промывки, в качестве буфера для промывки применяют ЗФР-Твин. Образцы сывороток, содержащие антитело(а), разводят приблизительно 1/100 или сильнее в ЗФР. Конъюгаты (пероксидаза хрена - антимышиный или пероксидаза хрена - антикроличий, полученные из Kirkegaard and Perry Laboratories ("KPL"), Gaithersburg, MD.) разводят 1/1000 в 5%-ном БСА в ЗФР. Цвет изменяется за счет превращения субстрата, О-фенилендиамина ("ОФД")(Sigma Chemical Company), в желтый продукт и превращения, осуществляемого при окончании реакции путем добавления 100 мкл на лунку 4N серной кислоты, которое дает оранжевый продукт. Оранжевый продукт регистрируют при 490 нанометрах на Bio Tech ELISA анализаторе планшетов (ридере).

В итоге, последовательность реакций в методике следующая: сенсибилизация, блокировка, промывка, раствор антитела, промывка, раствор конъюгата, промывка, субстрат, останавливающий раствор и регистрация.

Фиг. 1 иллюстрирует результаты иммунологического анализа на антисыворотке, полученной от нескольких кроликов, иммунизированных ЛПК экстрактом рассеянного склероза и тестированной с помощью антигена(ами) рассеянного склероза, или экстрактом из нормальных клеток. Образцы собирали в дни, указанные на оси X. Стрелки указывают точки, в которых животным проводили иммунизацию. Фиг. 1 показывает, что в экстракте рассеянного склероза присутствовали определенные антигены, которые не были обнаружены в нормальном экстракте.

Пример 5.

Ответ в муриновой системе.

На фиг. 3 представлены результаты анализов, описанных в примере 4, для муринового иммунного ответа, но только для одной точки (времени), так как многократные сборы нецелесообразны. Как и в случае кроликов очевидно, что в экстракте рассеянного склероза присутствовали определенные антигены, которые не были обнаружены в нормальном экстракте. Блоттинг по Вестерну подтвердил этот факт. Кроме того, определенные антигены, на которые реагировали мыши и кролики, показали ту же самую подвижность.

Пример 6.

Блоттинг по Вестерну антисывороток против иммунизирующего антигена(ов).

Экстракты ЛПК от здоровых и больных рассеянным склерозом пациентов обрабатывают и исследуют электрофоретически, как рекомендовано изготовителем реактивов и оборудования (Mini-Gel Apparatus, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA. ). После электрофореза образцы подвергают трансблоттингу согласно рекомендациям, затем блокируют с тем же 0,2%-ным БСА, как описано выше.

Электрофоретическое разделение различных образцов проводят с использованием ДДС и обработкой меркаптоэтанолом. Этот способ позволяет разделить полипептидные цепи основных субъединиц по молекулярным весам. Эти электрофоретические материалы переносят затем с полиакриламидных гелей ("ПААГ") на подложку, такую как нитроцеллюлоэная бумага, которая связывает белки.

Инкубации нитроцеллюлозной бумаги, подвергнутой трансблоттингу с кроличьими или муриновыми антителами ("анти-рассеянный склероз") проводят при комнатной температуре приблизительно в течение 2 часов, а для всех промывок применяют тот же промывочный буфер (ЗФР-Твин), что и в примере 4. Образцы, содержащие антитела, разводят 1/100 в ЗФР. Конъюгат, щелочная фосфатаза анти-кроличий или анти-муриновый lgG (KPL), разводят в 5%-ном БСА в ЗФР. Положительная цветная реакция получается за счет превращения субстрата BCIP/нитросиний тетразолий (KPL) в нерастворимое синее соединение.

Обобщаем последовательность реакций: антитела, промывка, щелочная фосфатаза - анти-кроличий lgG (или щелочная фосфатаза - анти-мышиный, если применяют муриновые антитела) конъюгат, промывка, субстрат BCIP/нитросиний тетразолий, и наконец, вода для остановки реакции.

Выбранный образец сыворотки анализируют, сравнивают с образцом нормального и рассеянного склероза ЛПК экстракта согласно рекомендациям Bio-Rad. Этот образец дает вариант с двумя основными полосами и несколькими второстепенными полосами на твердой подложке, который, по-видимому, является уникальным для экстракта рассеянного склероза (фиг. 2). Применение стандартов молекулярного веса позволяет определить молекулярный вес для минорной полосы, составляющий от 14000 до 16000 дальтон, которая легко различима при реакции с моноклональными антителами. Другие большие полосы могут отражать форму предшественника, как это часто имеет место, либо измененную форму, такую как глубоко гликозилированная форма, либо нередуцированная форма. Муриновые моноклональные антитела взаимодействуют первоначально с полосой с самым низким молекулярным весом.

Пример 7.

Обработка и конъюгирование кроличьего lgG против антигенов рассеянного склероза.

Антисыворотки от кролика 5866, взятые на 42-ой день, обрабатывали стандартным методом осаждения 40%-ным сульфатом аммония с последующим диализом перерастворенного осажденного белка против 0,01 М фосфата натрия, pH 7,2, и ДЭАЭ-хроматографией ДЕ-52, следуя рекомендациям изготовителя (Whatman, Freehold, NJ). Пять мл раствора, содержащего эти антитела, затем экстенсивно абсорбируют нормальным ЛПК экстрактом, пришитым к Af-fi-Gel 10 (Bio-Rad Laboratories). И наконец, проводят конъюгацию кроличьего lgG против антигенов рассеянного склероза с биотином, с NHS-биотином, следуя рекомендациям изготовителя (Pierce Chemical, Rockford, IL.). Конъюгат биотин - кроличий lgG против антигенов рассеянного склероза в этом случае определяют с помощью стрептавидин-пероксидаза хрена фермента (KPL).

Пример 8.

Применение муринового иммуноглобуллина в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA).

Антигены рассеянного склероза могут быть обнаружены посредством применения твердофазного иммуноферментного анализа, при котором для сенсибилизации микроаналитических лунок применяют очищенное моноклональное антитело, которое служит для захвата антигена(ов), полученного из ЛПК экстракта рассеянного склероза. Иммобилизованный антиген(ы) затем выявляют, а сигнал получают при помощи второго антитела.

В этом примере использовали поликлональный иммуноглобулин, полученный от кроликов. Для начальной стадии используют муриновые антитела от мыши 2. Муриновые иммуноглобулины получают путем осаждения 40%-ной солью аммония, аналогично исходной стадии очистки кроличьего IgG, описанной в примере 7. Мышиный иммуноглобулин применяют для сенсибилизации микроаналитических планшетов в сенсибилизирующем буфере, но при концентрации белка 5 мкг/мл. Планшеты блокируют и промывают тем же способом, который описан в примере 4.

Этот анализ сходен с анализом по обнаружению антитела, описанным в примере 4, за исключением того, что планшеты сенсибилизируют антителами, блокируют, промывают, инкубируют с ЛПК антигенным экстрактом, промывают как и ранее, инкубируют с конъюгатом антитела, промывают, инкубируют со вторым сконъюгированным видом (если это необходимо) и инкубируют с ферментным субстратом. Фермент связывается только тогда, когда одно или оба антитела, если применяют двойную систему антител, выявило антиген(ы). Объемы при этом уменьшают наполовину, до 50 мкл. Инкубации продолжаются приблизительно 1-2 часа, приблизительно при 37^oC. Антитела могут быть прямо сконъюгированы с пероксидазой хрена ("ПХ") либо щелочной пероксидазой ("ЩП").

И наконец, связанный фермент способен превращать субстратный раствор в раствор с новым продуктом. Этот новый продукт поглощает или в случае флуоресцирующих продуктов излучает при длине волны, отличающейся от длины волны непрореагировавшего субстрата.

Фиг. 4 представляет собой анализы нормальных пациентов и пациентов, у которых был диагностирован рассеянный склероз. Как видно из графика, образцы с рассеянным склерозом распределяются вокруг более высокого конца шкалы, а известные отрицательные - вокруг более низкого конца.

Пример 9.

Создание HB 11152 и HB 11153 гибридом, дипонированных в ATCC.

Для генерации моноклональных антител иммунизируют Balb/C мышей, как описано в примере 3, двумя пулами рассеянный склероз-ЛПК антигенов: один от пациентов из Южной Каролины, а более ранний - от группы пациентов из Теннесси.

Для гибридом, описанных в настоящем изобретении, животных убивают путем шейного вывиха и готовят стандартный препарат отдельных лимфоидных клеток путем разрушения оболочки селезенки и высвобождения лимфоцитов из других компонентов соединительной ткани с помощью механического перетирания туда-сюда между двумя замороженными стеклянными пластинами. Клетки селезенки дважды промывают бессывороточной средой и проводят слияние в полиэтиленгликоле. Клетки инкубируют в среде с гипоксантино-аминоптерин-тимидином (ГАТ) приблизительно при 37^oC, в условиях 100%-ной относительной влажности, в атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% CO₂. За клетками наблюдают по спланированному графику на предмет начала роста на 10-е сутки.

Микролуночные культуры, подвергшиеся слиянию, промывают, а клетки подпитывают средой ГАТ, RPMI 1640, обогащенной "Hybrimax" производства Sigma Chemical, содержащего 10% фетальной кровяной сыворотки ("ФКС"), ЩПИ (щавелевоуксусная кислота, пировиноградная кислота и инсулин), фунгизон, пенициллин и стрептомицин. Начиная с 10-ых суток, наблюдают за лунками на предмет роста потенциальных гибридом, избыточного роста фибробластов и грибного и бактериального заражения.

Пример 10.

Анализ моноклональных антител, продуцируемых гибридомами, полученными в примере 9.

Таблица 1 представляет собой обобщение результатов характеристики двух моноклональных антител, полученных против антигенного ЛПК экстракта рассеянного склероза.

Таблица 1 дает сводку этих клеточных линий и их продуктов, соответствующих моноклональных антител. В таблице 2 представлено сравнение распределения сигналов поглощения между этими двумя моноклональными антителами и третьим моноклональным антителом, 2А2.

Антитело 6D4 является IgG3 моноклональным антителом, реактивным при блоттинге по Вестерну.

Таблица 2 представляет собой анализ распределения сигналов, генерированных в 1:4 разведении сывороток (или плазмы) от нормальных пациентов и пациентов, у которых диагностирован рассеянный склероз. В анализе используют сенсибилизацию аффиноочищенных анти-муриновых иммуноглобулинов, а затем материал тканевой культуры с моноклональными антителами. Затем проводят анализ с образцом пациента и последовательно с кроличьим антителом против рассеянного склероза, меченного биотином, а затем - стрептоавидин-ПХ.

Пример 11.

Получение сенсибилизирующего антитела для применения в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA) проводят следующим образом.

Антитело, 3D3.2, клон моноклонального антитела 3D3, частично очищают от асцитных материалов. Во-первых, каждый мл асцитной жидкости разводят равным объемом холодной дистиллированной воды. Затем добавляют равное количество 100%-ного насыщенного сульфата аммония, образец тщательно перемешивают и оставляют для осаждения на несколько часов приблизительно при 4^oC. Затем осажденные иммуноглобулины, включая 3D3.2 IgM, собирают путем центрифугирования (10000 x G в течение 15 минут). Супернатант удаляют, а осадок иммуноглобулинов ресуспендируют в минимальном количестве воды. Затем полученный материал диализируют против 2X ЗФР в течение 3 дней, с тремя сменами буферного раствора. После диализа образец становится прозрачным и полученный материал хранят приблизительно при -20^oC.

Для целей сенсибилизации образец замороженного антитела оттаивают и разводят приблизительно 1:1000 в том же буфере для сенсибилизации, который использовали в примере 4. Сенсибилизированные микролунки хранят приблизительно при 4^oC во влажной камере. Перед использованием планшеты блокируют 0,2%-ным бычьим сывороточным альбумином и обрабатывают, как описано в примере 4.

Пример 12.

Получение конъюгата моноклонального антитела для применения в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA) проводят следующим образом.

Другое моноклональное антитело (6D4), из клона 6D4,2, конъюгирует с пероксидазой хрена согласно описанному способу [5]. Сначала антитело очищают от асцитного материала с помощью набора с проникающим белком A для очистки антител следующим образом: 1,5 мл образца асцита разводят объемом, равным 1,5 мл препарата связывающего буфера, центрифугируют 15 минут при 10000 x G и наносят на колонку со staph-A емкостью 5 мл, тщательно промывают связывающим буфером, а затем элюируют антитело буфером для элюции. Поскольку данное антитело ведет себя как криоглобулин, особенно при значении ионной силы, равном физиологическому или ниже, то все стадии проводят при комнатной температуре, за исключением стадии диализа и центрифугирования, которые проводят приблизительно при +4^oC. Подобным же образом, если возможно, применяют 2X ЗФР, особенно в случаях, когда предпочтительны высокие концентрации 6D4. Антитело конъюгируют с ферментом (1:4) после стандартного периода активации ПХ. Разделения несконъюгированной и сконъюгированной ПХ достигают путем осаждения конъюгата солью сульфата аммония. Конъюгат растворяют и активно диализируют против 2X ЗФР и хранят приблизительно при -20^oC.

Анализ выполняют, как описано в примере 8, за исключением того, что поскольку конъюгат является ПХ-6D4, то необходима единственная стадия, а не две, необходимые в случае, когда применяют биотин-антитело и стрептоавидин-ПХ последовательности.

Результаты представлены на фиг. 5, где первые семь использовавшихся образцов являлись контролями с известным диагнозом; последние две группы образцов, CU 21-CU 28 и CU 29-CU 37 представляли собой неизвестные тестировавшиеся образцы. Первая группа образцов, полученная под кодом, была отмечена как CU 21-28; все эти образцы дали отрицательные результаты при тестировании. Вторая группа образцов, обозначенная как CU 29-37, все дали положительные результаты. Затем код был снят и пациенты, от которых была получена кровь, были идентифицированы, первая группа состояла полностью из пациентов, не страдающих рассеянным склерозом, хотя один пациент был сыном пациента, у которого был диагностирован рассеянный склероз, а другой страдал эпилепсией и перинеальным нервным параличом. Вторая группа образцов была получена от пациентов с рассеянным склерозом либо расстройствами, предположительно являющимися предшествующими рассеянному склерозу.

Пример 13.

Некоторых пациентов, у которых был диагностирован рассеянный склероз, тестировали согласно примеру 8 с применением ПХ-6D4.2 конъюгата. Кроме того, согласно методике, описанной в примере 8, были тестированы 6 пациентов, не страдающих рассеянным склерозом. Результаты этого тестирования представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, анализ с применением способа согласно настоящему изобретению дает возможность разделить нормальных пациентов и пациентов, у которых был диагностирован рассеянный склероз. Следует понимать, конечно, что все упомянутое выше касается только предпочтительных вариантов реализации настоящего изобретения и что могут быть произведены многочисленные модификации или изменения, не выходящие за рамки духа и границ изобретения, что установлено далее в прилагаемой формуле изобретения.

Литература 1. Патент США N 4,294,818.

2. Current Protocols in Immunology, Vol. 2, edited by John E. Coligan et al., pgs 10.6.1 through 10.6.14 and 10.12.1 through 10.12.8, (1991).

3. Zimmerman et al., "Commercial Applications of Monoclonal Antibodies to Bacteria" (1985), Vol. II, pp. 283-320.

4. Current Protocols in Immunology, Coligan et a1., editor, Green Publishing Associates & Wiley Interscience, 1991, Chapter 2.

5. Nakane et al., "A Peroxidase Antibody: A New Method of Conjugation", Histochem Cytochem, 22: 1084, (1974).

Формула изобретения

1. Гибридная клеточная линия, продуцирующая моноклональные антитела, проявляющие специфичность в отношении эпитопа на антигенах, ассоциированных с рассеянным склерозом, депонированная в Американской коллекции типовых культур (АТСС) НВ 11152.

2. Гибридная клеточная линия, продуцирующая моноклональные антитела, проявляющие специфичность в отношении эпитопа на антигенах, ассоциированных с рассеянным склерозом, депонированная в Американской коллекции Типовых культур (АTСС) НВ 11153.

3. Препарат антител для диагностики рассеянного склероза, отличающийся тем, что он содержит антитела или их связывающий фрагмент, обозначенные 6Д4, секретируемые гибридной клеточной линией по п.1.

4. Препарат антител для диагностики рассеянного склероза, отличающийся тем, что он содержит антитела или их связывающий фрагмент, обозначенные 3Д3, секретируемые гибридной клеточной линией по п.2.

5. Препарат антител для диагностики рассеянного склероза, отличающийся тем, что он содержит диагностически эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента, которое конкурентно ингибирует связывание моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией АТСС НВ 11152, с антигеном, ассоциированным с рассеянным склерозом, что измеряется посредством ферментного иммунологического анализа либо другого иммунного анализа на конкурентное ингибирование.

6. Препарат антител для диагностики рассеянного склероза, отличающийся тем, что он содержит диагностически эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента, которое конкурентно ингибирует связывание моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией АТСС НВ 11153, с антигеном, ассоциированным с рассеянным склерозом, что измеряется посредством ферментного иммунологического анализа либо другого иммунологического анализа на конкурентное ингибирование.

7. Способ диагностики рассеянного склероза у человека, отличающийся тем, что в образце от человека обнаруживают антиген, ассоциированный с рассеянным склерозом, применяя антитела или их связывающий фрагмент препарата по п.3.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что в качестве образца используют образец крови.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что в качестве образца используют образец сыворотки.

10. Способ диагностики рассеянного склероза у человека, отличающийся тем, что в образце от человека обнаруживают антиген, ассоциированный с рассеянным склерозом, применяя антитела или их связывающий фрагмент препарата по п.4.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве образца используют образец крови.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве образца используют образец сыворотки.

13. Способ диагностики рассеянного склероза у человека, отличающийся тем, что в образце от человека обнаруживают антиген, ассоциированный с рассеянным склерозом, применяя антитела или их связывающий фрагмент препарата по п.5.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что в качестве образца используют образец крови.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что в качестве образца используют образец сыворотки.

16. Способ диагностики рассеянного склероза у человека, отличающийся тем, что в образце от человека обнаруживают антиген, ассоциированный с рассеянным склерозом, применяя антитела или их связывающий фрагмент препарата по п.6.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что в качестве образца используют образец крови.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что в качестве образца используют образец сыворотки.

19. Полипептид, ассоциированный с рассеянным склерозом, присутствующий во фракции лейкоцитов пациента, страдающего рассеянным склерозом или иным демиелинизирующим заболеванием, который имеет мол.м. около 14000 - 16000, измеренную в ДДС-полиакриламидном геле.

20. Способ лечения рассеянного склероза или другого демиелинизирующего заболевания путем введения пациенту препарата полипептида, отличающийся тем, что вводят полипептид по п.19 в дозе 10^-2 - 10^-10 мг на единичную дозу.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что полипептид вводят подкожно.

22. Способ по п.20, отличающийся тем, что полипептид вводят подъязычно.

Приоритет по пунктам: 18.12.92 - по пп.1 - 18; 16.12.93 - по пп. 19 - 22.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8