Способ получения питательной среды для культивирования лимфоцитов крови человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения питательной среды для культивирования лимфоцитов крови человека в диагностических исследованиях хромосомных аномалий. Питательная среда для культивирования лимфоцитов крови человека содержит питательную среду RPM1-1640 с Hepes-буфером, сыворотку крови крупного рогатого скота, раствор 3%-ной массовой доли L-глутамина с антибиотиками и фитогемаглютинин. Полученную растворенную смесь стерилизуют фильтрацией через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм, дозируют во флаконы, лиофильно высушивают.

Изобретение обеспечивает культивирование лимфоцитов крови человека с митотическим индексом не ниже 30, получение среды, стабильной в течение продолжительного срока, удобной для использования в медицинской практике в любых условиях, в т.ч. и полевых. 1 з.п. ф-лы.

Предлагаемое техническое решение относится к биотехнологии и касается способа получения питательной среды для культивирования лимфоцитов крови человека в диагностических исследованиях хромосомных аномалий.

Известны выпускаемые фирмами Difco(USA), Gibco (Great Britain) диагностические наборы для исследования человеческих хромосом, основным недостатком которых является необходимость перед использованием дозировать отдельные входящие в состав набора реагенты, что требует асептических условий и значительных затрат времени, а также дефицитность этих компонентов.

Чаще всего в медицинской практике при исследовании хромосомных аномалий у человека лимфоциты крови культивируют в питательных средах, которые перед введением пробы крови готовят каждый раз, смешивая исходные компоненты по прописям известных зарубежных фирм [1] Кроме характерных для диагностических наборов, основным недостатком такого способа получения сред является невоспроизводимость результатов хромосомного анализа. Известны также питательные среды стандартного изготовления для культивирования клеток крови человека [2] и животных [3] описанные в аналогах, однако без введения в их состав митогена, весьма лабильного в жидкой среде. Эти среды не пригодны для культивирования лимфоцитов крови с целью выделения препарата хромосом и последующих диагностических исследований.

Задачей предлагаемого изобретения является создание готовой формы стандартной по составу питательной среды, обеспечивающей культивирование лимфоцитов крови человека с митотическим индексом не ниже 30, стабильной в течение продолжительного срока, удобной для использования в медицинской практике в любых условиях, в т.ч. и полевых.

Для решения этой задачи питательную среду для культивирования лимфоцитов крови человека, в состав которой входит питательная среда RPM1-1640 с HEPES-буфером, сыворотка крови крупного рогатого скота (КРС), раствор 3%-ной массовой доли L-глутамина с антибиотиками, согласно изобретению, на стадии смешения исходных компонентов до полного их растворения дополнительно вводят фитогемагглютинин, полученную растворенную смесь стерилизуют фильтрацией через мембраны с диаметром пор 0,22 ммк, дозируют во флаконы и лиофильно высушивают при следующем соотношении исходных составляющих: Питательная среда RPM1-1640 с HEPES 3,0 3,5 мл (3,027 мл) Раствор 3% -ной массовой доли L-глутамина с антибиотиками 0,06 0,08 мл (0,072 мл) Фитогемагглютинин 0,04 0,15 мг Сыворотка крови КРС 0,3 0,9 мл (0,865 мл) При использовании 1 дозы сухой стерильной среды, полученной из 4 мл растворенной смеси, вносят во флакон со средой 4 мл стерильной деионизованной воды (удельное сопротивление 10 18 МОм) и 0,4 мл крови человека и, используя флакон как ферментатор, культивируют лимфоциты при (370,1)^oC в течение 72 ч. Характер роста лимфоцитов крови стандартная суспензия.

В 1 л раствора 3%-ный массовой доли L-глутамина с антибиотиками содержится 30,0 г L-глутамина, 2,5 г канамицина сульфата, 5,0 г стрептамицина сульфата, 510⁶ ед. активности безнзилпенциллина натриевой соли.

Поскольку культивирование лимфоцитов стимулируется входящим в состав среды лабильным митогеном ФГА, который в оптимальных концентрациях способствует делению лимфоцитов, а в повышенных подавляет рост и вызывает деструкцию лимфоцитов, перед составлением среды контролируют митотическую активность ФГА путем введения его в образцы среды в различной концентрации от 0,01 до 0,04 мкг/мл и определения митотического индекса для образцов крови одного и того же человека.

Количественное содержание компонентов среды меньше указанной границы обеспечивает митотический индекс менее 30. Количественное содержание компонентов среды больше указанных в предлагаемом составе приводит к деструкции лимфоцитов.

Наименьшее количество ФГА, которое обеспечивает не менее 30 митотических пластинок на 1000 клеток культуры, является оптимальным для данной серии среды.

Предлагаемое техническое решение поясняется следующими примерами.

Пример 1.

В реактор загружают 1260 мл питательной среды RPM1-1640, содержащей 5,8 г HEPES-буфера, добавляют 125 мл жидкой стерильной сыворотки крови КРС, 30 мл 3% -ного раствора L-глутамина, содержащего бензилпенициллина натриевую соль в концентрации 90 ед/мл, канамицина сульфат 0,045 мг/мк, стрептомицина сульфат 0,09 мг/мл и 17 мг ФГА, растворенного в (151) мл стерильной деионизованной воды. Содержимое реактора перемешивают в течение 15 20 мин до полного растворения и подвергают стерилизующей фильтрации через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм с одновременным дозированием во флаконы по (4,00,1) мл, охлаждают в сублимационной камере до температуры минус 45^oC в течение 10 12 ч и лиофильно высушивают в течение 48 ч. Получают 410 -420 флаконов сухой питательной среды, пригодной для культивирования лимфоцитов крови человека.

Пример 2.

В реактор загружают 1260 мл питательной среды RPM1-1640, содержащей 7,5 г HEPES-буфера, добавляют 375 мл жидкой стерильной сыворотки крови КРС, 30 мл 3%-ного раствора L-глутамина, содержащего антибиотики в концентрации (см. пример 1) и 60 мг ФГА, растворенного в (151) мл стерильной деионизованной воды. Далее см. пример 1.

Пример 3.

Контроль пригодности среды для культивирования осуществляют путем внесения в асептических условиях во флаконы с сухой средой 4 мл стерильной деионизованной воды и 0,4 мл свежеотобранной от пациента периферической крови. Культивируют при (371)^oC в течение 72 ч, после чего останавливают клеточное деление на стадии метафазы добавлением к культуральной суспензии 0,22 мл раствора колхицина с концентрацией 0,00004 мг/мл. Клетки лимфоцитов выделяют центрифугированием. Число метафазных пластинок определяют нанесением пробы на предметное стекло. После высушивания и окрашивания красителем Гимза-Романовского определяют митотический индекс, который должен составлять 30 и более.

Анализ экспериментальных данных показывает, что предлагаемая среда в отличие от известных аналогов вместо фетальной сыворотки содержит более доступную и дешевую сыворотку крови КРС, выпускаемую согласно ФС 42 246 ВС - 87, изготовленную из отечественных компонентов среды RPM1-1640 (ФС42-365 ВС91), не содержит гепарина. Предлагаемая среда удобна для использования в медицинской практике в любых условиях, в т.ч. и полевых.

Литература The Catalogue for Cell Cultue and Cell Biology, p. 77-80, фирма Cibco BRL.

2. Авторское свидетельство СССР N1678830, кл.C 12 N 5/18, C 12 P 21/08, 1989.

3. Авторское свидетельство СССР N1576562, кл.C 12 N 5/00, 1988.0

Формула изобретения

1. Способ получения питательной среды для культивирования лимфоцитов крови человека путем смешивания стандартной питательной среды с сывороткой крови, антибиотиками и ФГА, отличающийся тем, что среда дополнительно содержит L-глутамин, из стандартных питательных сред RPMI-1640 на Hepes буфере, из сывороток крови сыворотку крупного рогатого скота, после чего полученную смесь стерилизуют, дозируют и лиофильно высушивают при следующем соотношении исходных компонентов: Питательная среда RPMI-1640 3,0 3,5 мл Hepes-буфер 14 18 мг
Раствор 3%-ной массовой доли L-глутамина с антибиотиками 0,06 0,08 мл
Фитогемагглютинин 0,04 0,15 мг
Сыворотка крови крупного рогатого скота 0,3 0,9 мл
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что среду стерилизуют фильтрацией через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм, а дозирование осуществляют по 4 мл.