Способ энантиомерного обогащения смеси двух энантиомерных хиральных аминов

 

Использование: энантиомерное обогащение и стереоселективный синтез хиральных аминов. Сущность изобретения: амины, у которых аминогруппа связана с вторичным углеродным атомом, который является хирально замещенным, могут быть энантиоморфно обогащены с помощью воздействия омега-аминокислота-трансаминазы, которая обладает свойством предпочтительно превращать одну из двух хиральных форм в кетон. Способ также можно использовать для стереоселективного синтеза одной хиральной формы из кетонов, существенно при этом исключая образование другой. 8 з. п. ф-лы, 9 табл.

Настоящее изобретение относится к способу энантиомерного обогащения смеси двух энантиомеров хирального амина.

Обнаружено, что биологическая активность химических продуктов, таких как фармацевтические и агрохимические препараты, обладающие хиральным центром, часто присуща, в основном, одной из возможных хиральных форм. Поскольку большинство химических синтезов, по существу, не являются стереоселективными, то возникает серьезная химическая технологическая проблема. Таким образом, на определенной стадии требуется обогащение или конических хиральных соединений, или химических соединений предшественников, обладающих таким же хиральным центром, в пользу одной хиральной формы. Для обогащения выбирают любую стадию, и в отсутствии метода рециркуляции ненужного энантиомера, процесс, по существу, ограничен максимальным теоретическим выходом в 50% по искомому энантиомеру.

Многие из хиральных соединений этого типа являются аминами. Кроме того, из-за своей синтетической универсальности, амины также являются хорошими объектами для разделения, после которого может быть эффективно осуществлено стереоселективное превращение в хиральное соединение. Химическое получение хирального амина, свободного от его энантиомера, до сих пор было, главным образом, основано на разделении смеси двух хиральных форм посредством образования диастереоизомерных производных, таких как соль, хиральной кислоты, на методах стереоселективного синтеза или на использовании хиральных хроматографических колонок (см. например, патент США N 3944608 и EP-A 36265).

Некоторые структурные типы аминов поддаются ферментативному разделению. Ферментативные реакции, включающие альфа-аминокислоты, хорошо известны, и их предполагалось использовать для получения стереорегулярных образцов. В патенте США N 3871958, например, описано ферментативное получение альфа-аминокислоты-серина-взаимодействием альдегида с глицином в присутствии треонинальдолазы, полученной из штаммов E. coli, а также родственный синтез серинола с использованием этаноламина.

Относительно мало сообщалось о ферментативных реакциях для аминокислот, в которых аминогруппа не соседствует с карбоксильной группой. Йонаха и др. Agric. Biol. chem. 42, (12), 2363 2367 (1978), описывает омега-аминокислота: пируват-трансаминазу, обнаруженную в образцах Pseudomonas, для которой пируват был единственным аминным акцептором. Этот фермент, который ранее был кристаллизован и охарактеризован (смотри: Йонаха и др. Agric. Biol. Сhem. 41(9), 1701 1706 (1977)) имел низкую специфичность по субстрату для омега-аминокислот, таких как гипотаурин, 3-аминопропансульфонат, бата-аланин, 4-аминобутират и 8-аминооктаноат, и катализировал переаминирование между первичными аминоалканами и пируватом.

Накано и др. J. biochem. 81 1375 1381 (1977), идентифицировал две омега-аминокислотных трансаминазы в B. cereus: бета-аланин-трансаминазу, которая соответствует омега-аминокислота: пируват-трансаминазе, описанной Йонахой и др. и аминобутират-трансаминазе. Они могут быть различны по своим резко отличным активностям по отношению к бета-аланину (100 против 3) и к аминобутирату (43 против 100), соответственно, а также по своим различным требованиям к аминному акцептору.

Бернетт и др. J. C. S. chem. Comm. 1979, 826 828, предложил, что омега-аминокислота: пируват-трансаминаза и -аминобутират-трансаминаза характеризуются различной предпочтительностью по отношению к двум концевым атомам в g-аминобутирате, меченом тритием.

Танизава и др. Biochem 21, 1104 1108 (1982), исследовал бактериальную a-лизин e-аминотрансферазу и a-орнитин-d-аминотрансферазу и отметил, что хотя они обе являются специфичными по отношению к a-аминокислотам, они действуют на расстоянии от центра и с такой же стереоспецифичностью, как g-аминобутират-трансаминаза, изученная ранее Бернеттом и др.

Ионаха и др. dgric. Biol. chem. 47(10) 2257 2265 (1983), в дальнейшем охарактеризовал омега-аминокислота: пируват-трансаминазу и g-аминобутират-трансаминазу (ЕС 2.6.1.18 и ЕС 2.6.1.19) и подтвердили докментально их распределение в целом ряде организмов.

Уотерс и др. F. EMS Micro. Lett. 34(1986), 279 282, сообщая о полном катаболизме бета-аламина и бета-аминоизобутирата с помощью P. acruginosa отметил, что первая стадия включала трансаминирование с бета-аланин: пируват-аминотрансферазой.

Рассматривались также и ферментативные методы, такие как метод разделения смесей хиральных аминов, не являющихся аминокислотами, например, 2-аминобутанола. Большинство этих методов включает получение производных, в частности, производных по аминогруппе, и использование этой защищенной группы или другой группы в молекуле для эффективного разделения. В патенте EP-A 222561, например, описан способ, где рацемический 2-аминобутанол превращают в N-карбамоильное производное, которое затем вводят в реакцию с алкилалканоатом в присутствии липазного фермента. Этерификация свободной гидроксильной группы, очевидно, ограничена S-энантиомером N-карбамоильного производного, которое затем гидролизуется. Этот способ, конечно, обязательно ограничен аминами, содержащими этерифицируемую гидроксильную группу и, кроме того, требует, в частности, предшествующей защиты аминогруппы посредством образования -NH-CO-карбамоильной группы, для того, чтобы достичь стереоспецифичности в ферментативной реакции.

В патенте EA-A 239122 описан аналогичный способ, применимый к более широкому классу 2-амино-1-алканолов.

В патенте Японии P 55-138389, опубликованном в бюллетене "Кокай", описано получение спиртов с аминогруппой, расположенной рядом с гидроксильной, путем воздействия микроорганизмов родов Bacillus, Proteus, Erwinia или Klebsiella на алкил- или аралкилзамещенный этиленимин.

В патенте Японии P 58-198296, опубликованном в бюллетене "Кокай", описан способ, в котором d, l,-N-ацил-2-аминобутанол подвергают воздействию аминоацилазы, выделенной из различных образцов Aspergillus, Penicillium и которые гидролизуют только d-N-ацил-2-аминобутанол.

В патенте Японии YP 59-39294, опубликованном в бюллетене "Кокай", описан способ разделения рацемического 2-аминобутанола посредством образования N-ацетильного производного, которое подвергают воздействию Micrococcus ацилазы, получая l-2-аминобутанол и d-N-ацетил-2-аминобутанол, причем последний затем химически гидролизуют, что приводит к d-2-аминобутанолу.

В патенте Японии YP-63-237796, опубликованном в бюллетене "Кокай", описан способ, в котором R, S-1-метил-3-фенилпропиламин выращивают аэробно в целом ряде конкретных микроорганизмов, причем предпочтение отдается метаболизму S-формы. Наиболее высокие выходы и оптическая чистота сообщаются для дрожжей вида Candida humida и Trichosporon milibiosaceum.

Ферментативная природа метаболизма S-формы, происходящая в этих аэробных культурах, например, оксидазная, дегидрогеназная, аммиак-лизазная и т.д. не показана.

В аннотации к патенту Японии N 63-273486 из бюллетеня "Кокай" описан микробиологический синтез 1-/4-метоксифенил/-2-аминопропана с R-конфигурацией в одном из двух хиральных центров на 1-(4-метоксифенил)-2-пропанона с помощью Sacrina lutea.

В своем наиболее широком смысле настоящее изобретение включает использование омега-аминокислотной трансаминазы в присутствии аминного акцептора с целью энантиомерного обогащения смеси хиральных аминов, где аминогруппа связана с неконцевым хирально-замещенным атомом углерода.

Таким образом, данное изобретение основано на открытии того, что омега-аминокислотной трансаминазы стереоселективно воздействуют на аминогруппы, которые не находятся в омега-положении, и что это действие может быть использовано для энантиоморфного обогащения смеси хиральных аминов.

Омега-аминокислотной трансаминазой называют любой фермент, обладающий свойством превращать концевую -CH₂-NH₂-группу омега-аминокислоты в CH=O-группу.

Равновесная ферментативная реакция, рассматриваемая в настоящем изобретении, может быть изображена следующим образом: где каждый из R¹ и R² когда их выбирают независимо, представляет собой алкильную или арильную группу, которая является незамещенной или замещенной одной или более ферментативно неингибирующими группами, и R¹ отличается от R² по структуре или хиральности или R¹ и R² взятые вместе, представляют собой углеводородную цепь из 4 или более атомов углерода, содержащую центр хиральности.

Здесь под "акцептором аминогруппы" подразумевают различные карбонильные соединения, более полно обсуждаемые ниже, которые способны акцептировать аминогруппу от рассматриваемого амина под влиянием омега-аминокислотной трансаминазы. Под "донором аминогруппы" подразумевают различные аминосодержащие соединения, более полно обсуждаемые ниже, которые способны отдавать аминогруппы рассматриваемому кетону, тем самым превращаясь в карбонильные соединения, также под влиянием аналогичной омега-аминокислотной трансаминазы.

Описанная выше ферментативная реакция характеризуется, во-первых тем, что омега-аминокислотная трансминаза воздействует на первичный амин, в котором аминогруппа не находится в омега-(или концевом) положении. Во-вторых, трансаминаза воздействует на амин, который не должен быть аминокислотой. В-третьих, расходуемое в процессе ферментативного превращения аминное соединение не является необратимо метаболируемым, а может быть стереоселективно превращено в исходный амин одинаковой хиральности.

Настоящее изобретение обеспечивает способ энантиомерного обогащения смеси хиральных аминов формулы , где каждый из R¹ и R² является, как определено выше, продуктом воздействия омега-аминокислотной трансаминазы в присутствии акцептора аминогруппы. Как можно видеть, соединения формулы IA и IB являются энантиомерами (или R¹ диастереоизомерами, если или R¹ или R² содержат второй хиральный центр) и являются хиральными по причине того, что по структуре или хиральности отличен от R².

Изобретение основано на открытии того, что действие омега-аминокислотной трансаминазы не ограничено омега-аминогруппами и, кроме того, является весьма или исключительно стереоселективным по отношению к аминам определенного класса, превращая только одну хиральную форму амина в соответствующий кетон, который больше не является хиральным (по крайней мере, по отношению к карбонильному атому a углерода), и, в свою очередь, превращая этот кетон в одну хиральную форму амина.

Под термином "энантиомерное обогащение" здесь подразумевают увеличение количества одного энантиомера по сравнению с другим. Это может включать (i) снижение количества одной пиральной формы по сравнению с другой, (ii) увеличение количества одной хиральной формы по сравнению с другой или (iii) уменьшение количества одной хиральной формы и повышение количества другой хиральной формы. Обычный способ выражения достигаемого энантиомерного обогащения представляет собой избыток энантиомера, определяемый по формуле в которой E¹ является количеством первой хиральной формы амина, а E² представляет собой количество второй хиральной формы этого же амина. Таким образом, если исходное соотношение двух хиральных форм равно 50:50 и достигается энантиомерное обогащение, достаточное для получения в итоге соотношения 50: 30, то величина "ее" по отношению к первой хиральной форме равна 25% в то время как, если окончательное соотношение составляет 70:30 то величина "ее" по отношению к первой хиральной форме равна 40% Как правило, в способе по настоящему изобретению величины "ее" могут достигать 90% или выше.

Термин "существенно выше", используемый здесь при описании стереоселективного синтеза одной хиральной формы по сравнению с другой, относится к соотношению, составляющему по крайней мере около 3:1, когда величина "ее" равна по крайней мере около 50% Хиральные амины формулы IA и IB, используемые в настоящем способе, имеют несколько структурных ограничений. Во-первых, аминогруппа, будучи первичной, должна быть связана с вторичным углеродным атомом, т.е. атомом углерода, несущим один атом водорода и два заместителя, отличных от водорода (R¹ и R²). Во-вторых, хотя R¹ и R² выбирают из групп идентичной структуры, эти группы должны делать молекулу хиральной, т.е. R¹ обязательно будет отличаться от R² по структуре или хиральности или R¹ и R², когда их выбирают вместе, являются хиральной группой. Обычно, будучи взятыми независимо, R¹ и R² будут алкильной, аралкильной или арильной группами, предпочтительно линейной или разветвленной алкильной группой из 1 6 углеродных атомов, линейной или разветвленной фенилалкильной группой из 6 12 углеродных атомов или фенильной, или нафтильной группой. Примерами являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, второбутил, фенил, бензил, фенэтил, 1-фенэтил, 2-фенилпропил и т. д. Кроме того, поскольку ферментативная реакция по настоящему изобретению затрагивает описанную аминогруппу и связанный с нею атом углерода, то каждая R¹- и R²-группа необязательно может быть замещена одной или более группами, при условии, что они также не являются ферментативно ингибирующими группами, т. е. группами, которые несущественно воздействуют или конкурируют с действием трансаминазы, когда хиральный амин или кетон, несущий эту группу, присутствуют в практических концентрациях. Это может быть легко определено путем простого анализа на ингибирование. Часто, когда ингибирование обнаружено, его можно минимизировать проведением реакции при более низких концентрациях этого реагента. Обычными заместителями, на которые не накладывается ограничение, являются галоиды, такие как хлор, фтор, бром или иод, гидрокси-группа, низший алкил, низшая алкокси-группа, низшая алкилтиогруппа, циклоалкил, карбамоил, моно- и ди-(низший алкил)-замещенный карбамоил, трифторометил, фенил, нитрогруппа, аминогруппа, моно- и ди-низший алкил)-замещенная аминогруппа, алкилсульфонил, арилсульфонил, алкилкарбоксамидогруппа, арилкарбоксамидогруппа и т.д.

Типичными группами, когда R¹ и R² берут вместе, являются 2-метилбутан-1,4-диил, пентан-1,4-диил, гексан-1,4-диил, гексан-1,5-диил и 2-метилментан-1,5-диил.

Типичными аминами, для которых без ограничения подходит настоящий способ, являются 2-аминобутан-2-амино-1-бутанол, 1-амино-1-фенилэтан, 1-амино-1-/2-метокси-5-фторофенил/этан, 1-амино-1-фенилпропан, 1-амино-1-/4-гидроксифенил/пропан, 1-амино-2-1-/4-бромофенил/пропан, 1-амино-1-/4-нитрофенил/пропан, 1-фенил-2-аминопропан, 1-/3-фторометилфенил/-2-аминопропан, 2-аминопропанол, 1-амино-1-фенилбутан, 1-фенил-2-аминобутан, 1-/2,5-диметокси-4-метилфенил/-2-аминобутан, 1-фенил-3-амино-бутан, 1-/4-гидроксифенил/-3-аминобутан, 1-амино-2-метилциклопентан, 1-амино-3-метилциклопентан, 1-амино-метилциклогексан и 1-амино-1-/2-нафтил/этан.

В своем самом широком смысле способ по изобретению включает воздействие на смесь хиральных аминов омега-аминокислотной трансаминазой, которая является ферментативно активной (по отношению к рассмотренной аминогруппе, по крайней мере, одного из названных хиральных аминов) в присутствии акцептора аминогруппы.

где R¹ и R² являются, как определено выше, и в формуле III или R³ представляет собой R¹, в то время как R⁴ является R² или R³ представляет собой R², в то время как R⁴ является R¹.

Вообще, ферментативный процесс воздействует только на одну хиральную форму, или воздействует на одну хиральную форму в гораздо большей степени, чем на другую. Например, в случае R,S-1-амино-1-фенилэтана (R¹ фенил R² метил) только S-форма превращается в соответствующий нехиральный кетон, ацетофенон, оставляя R-1-амино-1-фенилэтан неизменным. Аналогично, в случае R,S-1-амино-1-/4-бромофенил/этана (R¹ 4-бромофенил, R² метил) S-форма превращается в нехиральный кетон, 4-бромоцетофенон, в то время как R-1-амино-1-/4-бромофенил/ этан не изменяется. Что касается R,S-1-фенил-3-аминобутана (R¹ фенэтил, R² метил), то S-форма легко превращается в нехиральный 1-фенил-бутан-3-он, в то время как S-форма 1-фенил-3-аминобутана превращается в 1-фенилбутен-3-он с эффективностью в 0,05 или менее по сравнению с превращением S-формы.

В ряде случаев хиральным аминам можно приписать R¹ и R² конфигурации и идентифицировать, какой из них превращается, а какой не превращается в кетон. Присвоение R- и S-обозначений делают, однако, согласно методу Кахна-Ингольда-Прелога и в зависимости от ранее предписанных величин для R¹ и R² в правиле чередования. Следовательно, априорное приписание обозначения R- или S-хиральности хиральному амину, который подвергается воздействию фермента, не всегда возможно. Следовательно, хотя приписание R или S-конфигурация хиральному амину формулы III будет зависеть от положения R³ и R⁴ в соответствии с правилом чередования, конфигурация хирального амина формулы III будет идентичной с конфигурацией: но только одной, энантиомеров 1A и 1B. Например, и, как отмечено выше, S-форма 1-амино-1-фениоэтана превращается в незиральный кетон, ацетофенон, оставляя R-энантиомер неизменным. Что касается R,S-1-амино-1-фенил-2-гидроксиэтана (фенилглицинол), то превращается энантиомер, имеющий такую же абсолютную конфигурацию, что и 1-амино-1-фенилэтан, однако вследствие правила чередования его обозначают как R-изомер.

Поскольку реакция является равновесной, то прямой реакции можно благоприятствовать добавлением дополнительных исходных соединений или удалением продуктов реакции. Когда хотят повысить соотношение энантиомеров двух хиральных форм амина, то можно добавить дополнительные количества акцептора аминогруппы (вплоть до насыщения) и/или можно постоянно удалять из реакционной смеси образующийся кетон.

Когда ненужная хиральная форма амина превращается в кетон, а нужная хиральная форма не превращается, то последняя может быть легко выделена с помощью обычных методов. Таким образом, частичное разделение может быть выполнено подкислением, экстракцией углеводородом, таким как гептан, для удаления кетона, подщелачиванием водной фазы и повторной экстракцией углеводородом, таким как гептан.

Выделяемые таким образом, побочные продукты сами часто являются предметами потребления. Например, если процесс проводят так, чтобы осуществить энантиомерфное обогащение смеси R-2-аминобутана, и S-2-аминобутана (R¹ этил, R² метил) R-хиральной формой, то R-хиральная форма будет превращаться в метилэтилкетон, сам являющийся полезным органическим растворителем.

Когда, с другой стороны, нужны обе хиральные формы амина, то форма, которая превращается в кетон, может быть удалена из реакционной смеси (или из водной фазы в двухфазной смеси) и независимо подвергнута воздействию омега-аминокислота-трансаминазы в присутствии донора аминогруппы, чтобы получить такую же хиральную форму, какая была первоначально превращена в кетон. Например, располагая изначально смесью R,S-1-амино-1-фенилэтана (R¹ фенил, R² метил), S-форму с помощью омега-аминокислотной трансаминазы превращают в соответствующий нехиральный кетон, ацетофенон, оставляя R-1-амино-1-фенилэтан неизменным. R-1-амино-1-фенилэтан легко выделяют из реакционной смеси, как описано выше, а ацетофеноновый побочный продукт, в свою очередь, подвергают воздействию трансаминазы в присутствии донора аминогруппы, чтобы получить S-1-амино-1-фенилэтил с существенно более высоким выходом, чем R форму.

Акцепторы аминогруппы представляют собой кетокарбоновые кислоты, алканоны или соединения, превращающиеся в акцепторы аминогруппы in situ. Типичными кетокарбоновыми кислотами являются альфа-кетокарбоновые кислоты, такие как глиоксалевая кислота, пировиноградная кислота, щавелевоуксусная кислота и им подобные, а также их соли. Типичным алканом является бутан-2-он.

В дополнение к этому можно использовать другие соединения, которые превращаются в акцептор аминогруппы под действием других ферментов или целых клеточных процессов. Представителями соединений, превращающихся в такие акцепторы аминогруппы, являются фумаровая кислота (которая быстро превращается в щавелево-уксусную кислоту in situ глюкоза (которая превращается в пируват), лактат, малеиновая кислота и т.д.

Омега-аминокислотные трансаминазы, пригодные для использования в настоящем способе, представляют собой известные пиридоксальфосфат-зависимые ферменты, обнаруженные в различных микроорганизмах, включающих Pseudomonas, Escherichia, Bacillus, Saccharomyces, Hansenula, Candida, Streptomyces, Aspergillus Newrospora.

Две омега-аминокислотные трансаминазы, которые особенно подходят для использования в настоящем изобретении, EC 2.6.1.18 и EC 2.6.1.19, были кристаллизованы и охарактеризованы Йонахой и др. Agric. Biol. Chem. 47 (10), 2257 2265, (1983).

Микроорганизмы, имеющие нужную активность, легко могут быть выделены с помощью хемостатной культуры, т.е. выращиванием в постоянной, но ограниченной химической среде с акцептором аминогруппы и амином в качестве одного единственного источника азота. Амин может быть, но не должен быть, хиральным, поскольку в нормальной среде омега-аминокислотные трансаминазы метаболизируют первичные амины. Нехиральные амины, которые успешно использовали для получения омега-аминокислотной трансаминазы, включают н-октиламин, циклогексиламин, 1,4-бутандиамин, 1,6-гександиамин, 6-аминогексановая кислота, 4-аминомасляная кислота, тирамин и бензиламин. Хиральные амины, такие как 2-аминобутан, альфа-фенэтиламин и 2-амино-4-фенилбутан, также можно успешно использовать, когда имеется аминокислота, такая как -лизин, a -орнитин, бета-аланин и таурин.

С помощью таких процедур культура будет обогащена этими микроорганизмами, продуцирующими требуемые омега-аминокислотные трансаминазы. Например, в одном таком хемостате, проведенном со случайными образцами почвы, необработанными конкретным амином, выдержку проводили приблизительно в течение одного месяца. Согласно этому доминирующие микроорганизмы независимо идентифицировали с помощью американской коллекции типов культур как Bacillus megaterium, которая несущественно отличается от и фенотипически подобна известным штаммам.

Организмы, выделенные таким образом, могут быть выращены с помощью целого ряда способов. Во-первых, можно использовать стандартную солевую среду, дополненную фосфатным буфером, ацетатом натрия как источником углерода, 2-кетоуглутаратом как акцептором аминогруппы и азотсодержащим соединением, таким как н-пропиламин, н-октиламин, 2-аминобутан, 2-аминогептан, циклогексиламин, 1,6-гександиамин, путресцин, 6-аминогексановая кислота, 4-аминомасляная кислота, a -лизин, a -оринитин, бета-аланин, альфа-фенэтиламин, 1-фенил-3-аминобутан, бензиламин-тирамин, таурин и т.д.

Иначе, микроорганизм может быть выращен с использованием амина в качестве одного -единственного источника углерода, тем самым ограничивая рост тех организмов, которые могут катаболизировать этот амин для получения углерода.

В-третьих, микроорганизм может быть выращен с использованием сукцината натрия, ацетата натрия или любого другого источника углерода и аммониевой соли или белкового гидролизата как основного источника азота и с последующим добавлением или в начале, или в процессе роста, амина, такого как 2-аминобутан, 1-фенил-3-аминобутан, альфа-фенэтиламин и т.д. для индуцирования получения необходимой трансаминазой активности.

Фактическое ферментативное превращение может быть осуществлено с помощью стандартных методик выращивания в присутствии хирального амина с изолированными, но не растущими, клетками или путем взаимодействия хиральных аминов с препаратом растворимой омега-аминокислотной трансаминазы.

Омега-аминокислотная трансаминаза может быть в свободной форме или в виде экстракта, свободного от клеток, или в виде цельного клеточного препарата, как отмечено выше, или иммобилизована на подходящей подложке или в матрице, такой как сшитый декстран или агароза, кремнезем, полиамид или целлюлоза. Ее можно также инкапсулировать в полиакриламиде, альгинатах, волокнах и тому подобное. Методы такой иммобилизации описаны в литературе (смотри, например, Methods of Enzymology, 44, 1976). Последний вариант особенно полезен, поскольку к однажды иммобилизованному ферменту необходимо только подавать акцептор аминогруппы и смесь хиральных аминов, для того, чтобы проводить нужное обогащение, и затем удалять образовавшийся кетон способом, описанным выше.

Хотя это и не является необходимым, как правило, если в реакционной композиции присутствует источник пиридоксамина, такой как пиридоксальфосфат, целесообразно преращение проводить с максимальными скоростями.

Ниже здесь описаны используемые материалы и методы, за которыми следуют типичные примеры.

Материалы и методы.

Ферментативная активность. Ферментативная активность выражена здесь в ед. /мг. Единица активности фермента определяется как активность, которая продуцирует 1 микромоль кетона в минуту. Для однозначности ее измеряют в виде R,S-микромолей 1-фенилбутан-3-она, образующегося из 1-фенил-3-аминобутана. Для измерения активности омега-аминокислотной трансаминазы применяли следующие стандартные тесты, изложенные в примерах, данных ниже.

Известный объем испытываемого препарата фермента инкубируют при 37^oC и pH 7 в растворе, имеющем следующий состав: Пируват натрия 100 ммоль/л
R, S-1-фенил-3-аминобутан 30 ммоль/л
Пиридоксальфосфат 0,5 ммоль/л
Образец удаляют и добавляют 20 об. водного раствора трихлоруксусной кислоты с концентрацией 12% Выпавший в осадок белок удаляют центрифугированием и определяют концентрацию 1-фенил-бутан-3-она в насадочной жидкости с помощью жидкостной хроматографии на 4 микронной колонке типа "Novopak phenye" 100x8 мм, элюируя 40% изопропанола и 0,09% фосфорной кислоты в воде. При этих условиях 1-фенилбутан-3- он элюируется за 5,3 мин.

Чистота аминов. Чистоту продуцируемых аминов определяли с помощью газовой хроматографии на колонке типа "chrom Q" размером 6 футов х 2 мм с 10% жидкой фазы марки E-30 на носителе с размером частиц 100/120 меш при 210^oC и скорости несущего газового потока 10 мл/мин.

Определение энантиомерного обогащения. Величину "ее" данного продукта определяли по реакции с (-) -альфа-/-трифторметилфенил/ метоксиацетилхлоридом ( смотри ГЭЛ, J. Pharm. Sci. 66, 169 (1977) и Мошер и др. J. Org. Chem. 34, 25430, (1969)) с последующей капиллярной газовой хроматографией получаемого в результате соединения на колонке типа "Chrompack" из плавленной двуокиси кремния.

Стандартная солевая среда. Подходящая солевая среда для микробиологических превращений, описанная в следующих примерах, имеет следующий состав:
MgSO₄ 1,00 г/л
CaCl₂ 0,021 г/л
ZnSO₄7 H₂O 0,20 мг/л
MnSO₄4 H₂O 0,10 мг/л
H₃BO₃ 0,02 мг/л
CuSO₄5 H₂O 0,10 мг/л
CoCl₂6 H₂O 0,5 мг/л
NiCl₂6 H₂O 0,01 мг/л
FeSO₄ 1,50 мг/л
NaMoO₄ 2,0 мг/л
FeEDTA 5,0 мг/л
KH₂PO₄ 20,00 ммоль/л
NaOH до pH 7
Данный состав не является критическим, но был стандартизован для всех методик, чтобы исключить их непостоянство.

Микроорганизмы. Культуры или получали из указанного источника, или выделяли, как описано, и затем независимо идентифицировали.

Обогащение микроорганизмов, продуцирующих амега-аминокислота-трансаминазу.

Хемостат поддерживают с помощью 0,5% (вес/объем) R, S-2-аминобутана и 10 ммоль/л 2-кетоглутарата при скорости разбавления 0,03 / час в стандартной солевой среде. Хемостат инокулируют и проводят опыт приблизительно в течение одного месяца при pH 6,8 7,0. Штаммы, которые развиваются, выделяют и выращивают на минимальном агаре, содержащем стандартную солевую среду, дополненную 10 мМ 2-кетоглутарата и 5 мМ R, S-1-фенил-3-аминобутана.

Восстановление фермента. Если не указано особо, клетки из культуры центрифугируют в течение 10 мин при 10000g, повторно суспендируют в 10 мМ фосфатном буфере при pH 7 и 0,5 мМ пиридоксальфосфате и разрывают путем двух проходов через охлаждаемый французский пресс, работающий при давлении 150000 фунтов/кв. дюйм. Остатки клеток удаляют центрифугированием в течение 1 час при 10000 g и собирают фермент-содержащую надосадочную жидкость.

Следующие примеры будут служить дальнейшим олицетворением природы настоящего изобретения, но они не должны истолковываться как ограничение его объема, который определяется только приведенной формулой изобретения.

Пример 1.

Следующая методика дает пример выращивания микроорганизмов, продуцирующих омега-аминокислотную трансаминазу, при использовании в качестве единственного источника азота донора аминогруппы.

Bacillus megaterium выращивали в трехлитровой вибрирующей колбе (200 об/мин) в течение 17 час при 30^oC, куда было добавлено: 1 л вышеназванного солевого раствора, 60 мМ ацетата натрия, 30 мМ фосфатного буфера, 30 мМ динатрий 2-кетоглутарата и 100 мМ н-пропиламина как источника азота. Когда культура достигала плотности 0,6 г (сухого веса) на литр, клетки собирали и выделяли фермент, как описано выше. Удельная активность омега-аминокислотной трансаминазы, полученной таким образом, при испытании согласно представленной выше методике составляла 0,49 единиц/мг.

Используемый в вышеуказанной методике штамм Bacillus megaterium получали из образцов почвы без особой обработки аминами путем инокуляции ранее описанного хемостата и выделением доминантных организмов (тех, которые способны расти на R,S-1-фенил-3-аминобутане). Этот штамм независимо идентифицировали с помощью американской коллекции типов культур как Bacillus megaterium, который существенно не отличался от известного штамма АТСС N 14581 и который фенотипически был подобен штамму АТСС 49097B.

Пример 2.

Следующая методика дает пример выращивания микроорганизмов, продуцирующих омега-аминокислотную трансаминазу, с использованием донора аминогруппы в качестве единственного источника углерода. Pseudomonas acruginosa АТСС 15692 выращивали на базе-аланине как единственном источнике углерода, как описал Уэй и др. FEMS Mioro. Zett. 34,279 (1986) и затем получали клеточные экстракты, содержащие омега-аминокислотную трансаминазу, как здесь описано. При анализе по методике, описанной выше, удельная активность омега-аминокислотной трансаминазы оказалась равной 0,040 единиц/мг.

Пример 3
Pseudomonas putida АТСС 39213 выращивали, как описано в примере 1, и затем получали ферментный экстракт, как здесь указано. Удельная активность омега-аминокислотной трансаминазы составила 0,045 единиц/мг.

Пример 4
Следующая методика показывает необходимость в акцепторе аминогруппы.

Ферментные экстракты из P. putida, B. megaterium и P. acruginosa, полученные, как указано выше, анализировали по вышеуказанной методике при pH 9 и 50 мМ Fris (HCI-буфере, используя 30 мМ
R, S-1-фенил-3-аминобутан, в присутствии или без 100 мМ пирувата натрия. Наблюдали следующие относительные скорости превращения (табл. 1).

Трансаминазная природа ферментативного воздействия очевидна из эффекта "самоуничтожения инактиваторов", который, как известно, характерен для трансаминаз (смотри, например, Бернетт и др. J. Bio Chem. 225, 428 432 (1980), причем инактиватор (0,5 мМ) предварительно инкубировали в анализируемой среде до добавления R,S -1-фенил-3-аминобутана (табл. 2).

Стереоселективность омега-аминокислотной трансаминазы можно видеть из соответствующего теста, где использовали 15 мМ раствор R-1-фенил-3-аминобутана (без пирувата) (табл. 3).

Пример 5
Следующая методика дает пример выращивания микроорганизмов с использованием аммония в качестве единственного источника азота и последующим индуцированием выделения омега-аминокислота-трансаминазы путем добавления амина.

Bacillus megaterium выращивали в культурах объемом 1 л в стандартной солевой среде, дополненной 40 мМ указанного источника углерода (табл. 4), 5 мМ хлорида аммония, 80 мМ фосфатного буфера и 2 мМ аминного индуктора, указанного ниже. Спустя 30 40 ч фермент собирали и анализировали, как описано выше.

Пример 6
Следующая методика дает пример выращивания микроорганизмов с использованием обогащенного белком источника и последующим индуцированием выделения омега-аминокислотной трансаминазы путем добавления амина.

Bacillus megaterium выращивали в 121 литровом ферментере при pH 7 и 30^oC с аэрацией и при перемешивании в выше указанной солевой среде, дополненной касаминовыми кислотами до концентрации 10 г/л. Постепенно добавляли ацетат натрия вплоть до достижения концентрации 120 мМ, когда образуются агрегаты. В этой точке плотность клеток составляла 3 г (сухого веса) на литр. 1-фенил-3-аминобутан добавляли вплоть до концентрации 10 мМ, когда образуются агрегаты. Спустя 12 ч фермент собирали и анализировали, как описано выше. Удельная активность составляла 0,49 единиц/мг.

Пример 7
Следующая методика дает пример использования растворимого ферментного препарата для осуществления энантиомерного обогащения рацемата хирального амина.

Препарат омега-аминокислотной трансминазы получали из Bacillus megaterium способом, описанным в примере 1. Анализ, выполненный по описанной выше методике, показал, что удельная активность составляла 0,375 единиц/мг. К 25 мл раствора, содержащего 26,4 мг этого ферментного препарата, дополнительно включающего 0,4 мМ пиридоксальфосфата и 40 мМ фосфата натрия, было добавлено 20 мМ R, S-1-амино-1-фенилэтана и 100 мМ пирувата натрия как акцептора аминогруппы. Этот раствор инкубировали в течение 150 мин при pH 7 и 30^oC и затем подщелачивали (pH>12) добавлением 2,5 мл 2 н. раствора гидроксида натрия. Раствор экстрагировали н-гептаном, и экстракты упаривали, получая 30,8 мл (49% конверсия) R-1-амино-1-фенилэтана, имеющего величину "ее", равную 96,4%
Пример 8
Следующая методика дает примеры использования растворимого ферментного препарата для осуществления энантиоморфного обогащения рацемата хирального амина, причем в каждом случае применяемый в методике в примере 7 рацемат R, S-1-амино-1-фениоэтан заменяли на
исходные материалы:
(a) R, S-1-фенил-3-аминобутан,
(b) R, S -1-амино-1-/4-бромофенил/этан,
(c) R, S -1-фенил-2-аминопропан,
(d) R, S -1-амино-1-фенилэтан,
(e) R, S -4-/4-метоксифенил/-2-аминобутан,
(f) R, S -5-/3-пиридил/-2-аминопентан (табл. 5).

Пример 9
Следующая методика дает пример использования нерастущих клеток для осуществления энантиомерного обогащения рацемата хирального амина.

Клетки из трех 1 л культур Bacillus megaterium, выращенные в течение 33 ч способом, описанным в примере 1, на 6 мМ R, S-1-фенил-3- аминобутане как единственном источнике азота, собирали центрифугированием и промывали путем повторного суспендирования в 250 мл 10 мМ фосфатного буфера (pH 6,8) и центрифугирования.

Осадок из клеток после центрифугирования вновь суспендировали в 0,6 л 10 мМ фосфатного буфера (pH 6,8), содержащего 10 мМ R, S-1-фенил-3-аминобутана и 50 мМ щавелевоуксусной кислоты в качестве акцептора аминогруппы. После инкубации в орбитальном инкубаторе в течение 4 час при 30^oC раствор подщелачивали и экстрагировали гептаном, как описано в примере 7. Таким образом был получен R-1-фенил-3-аминобутан с 97,9% оптической чистотой, что соответствовало величине "ее" равной 95,8.

Пример 10.

Следующая методика дает пример использования растущих клеток для осуществления энантиомерного обогащения рацемата хирального амина и использования предшественника акцептора аминогруппы.

6 л инокулята Bacillus megaterium, приготовленного в основном, как описано в примере 1, но с использованием 10 мМ R,S-1-фенил-3-аминобутана в качестве единственного источника азота, выращивали в 120 л объеме вышеуказанной солевой среды, дополнительной 30 мМ фумарата, как предшественника акцептора аминогруппы. После 22-часовой инокуляции добавляли дополнительно 30 мМ фумарата и спустя 6 час культуру собирали, удаляя клетки посредством ультрафильтрации с использованием мембраны типа "Romicon" PM 100". Раствор подщелачивали и экстрагировали гептаном, как описано в примере 7. Таким образом, был получен R-1-фенил-3-аминобутан с 99,5% чистотой с величиной "ее", равной 96,4%
Пример 11.

В следующей методике представлены примеры относительных скоростей превращения, определенных непосредственно или рассчитанных из кинетических данных, различных хиральных аминов под действием растворимых ферментных препаратов с использованием описанного выше анализа, но с заменой указанного хирального амина (табл.6).

Пример 12
В следующей методике представлены примеры относительных скоростей превращения 1-фенил-3-аминобутана с использованием различных акцепторов аминогруппы вместо пирувата в анализе, описанном выше (табл.7).

Также обнаружено, что акцептором аминогруппы, хотя и существенно более слабым (относительные скорости < 10), является ацетофенон.

Пример 13
Следующая методика дает пример энантиомерного обогащения с использованием растворимого ферментного препарата при непрерывной экстракции обогащенного продукта.

Растворимый ферментный препарат получали из Bacillus megaterium способом, описанным в примере 1. Анализ, выполненный по описанной выше методике, показал, что удельная активность составляла 0,70 единиц/мг. Готовили водную фазу, содержащую 450 мг этого экстракта, 0,12 М пирувата натрия, 0,2 М R, S-1-фенил-3-аминобутана, 1 мМ пиридоксальфосфата и 0,5 М фосфата (pH 7,5). Добавляли 500 мл н-гептана и двухфазную смесь перемешивали при 22^oC в течение 7 час. Затем pH доводили до 4,5 добавлением хлористоводородной кислоты и отделяли водный слой от органического. Водный слой подщелачивали добавлением гидроксида натрия и экстрагировали гептаном. После удаления гептана анализ показал, что остаток содержал 96% R-1-фенил-3-аминобутана.

Пример 14.

Эта методика дает пример ферментативного разделения и выделения каждого из R- и S-энантиомеров.

Методике получения R-энантиомера из R, S-1-амино-1-фенил/-этана, описанной в примере 7, следуют через инкубацию. До подщелачивания инкубированного раствора его, однако, экстрагируют н-гептаном и экстракты сохраняют. Водную фазу затем обрабатывают в соответствии с примером 7, выделяя R-1-амино-1-фенилэтан, как там описано.

Ацетофенон выделяют из сохраненных гептановых экстрактов упариванием. Следуя, в основном, той же методике, что представлена в примере 14, но используя 2,3 мМ ацетофенона вместо 1-фенил-бутан-3-она, было получено 56 мг S 1-амино-1-фенилэтана (100%).

Пример 15
Эта методика дает пример использования иммобилизованного фермента.

Иммобилизация. Несущую матрицу (0,4 г) типа "actidick" (производства фирмы "FMC Corp") диаметром 47 мм погружали в камеру аппарата типа "Millipore Sweenix", снабженного подводящей и выводящей трубками, перистальтическим насосом и резервуаром. Матрицу последовательно промывали при окружающей температуре и скорости 3 мл/мин: (1) 200 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 7), содержащего 0,5 мМ пиридоксальфосфата, в течение 20 мин, (2) 11 мл раствора фермента с концентрацией 4, 6 мг/мл, полученного способом, описанным в примере 1, в течение 120 мин, (3) 150 мл 0,3 М раствора хлористого натрия в 50 мМ фосфатном буфере (pH 7), содержащем 0,5 мМ пиридоксальфосфата, в течение 30 мин и (4) 200 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 7), содержащего 0,5 мМ пиридоксальфосфата, в течение 20 мин.

Обогащение. 140 мл раствора 10 мМ R, S-1-фенил/3-амино-бутана, 100 М пирувата натрия, 0,1 мМ пиридоксальфосфата и 25 мМ фосфата калия (pH 7) циркулировали через вышеуказанную матрицу при температуре окружающей среды со скоростью 5 мл/мин. Спустя 2 часа циркулирующую жидкость удаляли из аппарата. Концентрация образовавшегося 1-фенилбутан-3-она составляла 4,8 мМ, в то время как концентрация R-1-фенил-3-аминобутана равнялась 4,8 мМ, pH доводили до 12,5 и R-1-фенил-3-аминобутан выделяли количественно экстракцией гептаном. После удаления гептана упариванием анализ показал, что продукт на 92,8% состоял из 1-фенил-3-аминобутана.

Пример 16
Каждый из следующих рацематов замещают R, S-1-амино-1-фенилэтаном в методике примера 7:
(a) R,S 1-фенокси-2-аминопропан
(b) R,S 1-амино-1-(2-метоксифенил)этан
(c) R,S 1-амино-1-(3-метоксифенил)этан
(d) R,S 1-амино-1-(4-метоксифенил)этан
(e) R,S 1-(4-метоксифенил)-3-аминобутан
(f) R,S 1-амино-1,2-дифенилэтан
(g) R,S 1-амино-1,2,3,4-тетрагидронафталин
(h) R,S 2-амино-1,2,3,4-тетрагидронафталин
(i) R,S 2-амино-5-метокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин
(j) R,S 1-амино-1-(4-хлорфенил) этан
(k) R,S 1-амино-1-(4-метилфенил)этан
(l) R,S 1-аминоиндан
Следующие R-энантиомеры с приведенным конверсии наблюдают в качестве продуктов (табл. 8).

Пример 17
В соответствии с методикой примера 7, однако при уменьшении количества R,S-1-амино-1-фенилэтана до 5 мМ используют 20 мМ каждого из указанных акцепторов аминогрупп вместо пирувата натрия. Выход и конверсии относительно R-1-амино-1-фенилэтана в каждом случае приведены ниже (табл. 9).

Формула изобретения

1. Способ энантиомерного обогащения смеси двух энантиомерных хиральных аминов формулы

где R¹ и R² независимо представляют собой алкильную или арильную группу, незамещенную или замещенную ферментативно неингибирующей группой, причем R¹ отличается от R² по структуре или хиральности, или R¹ и R², взятые вместе, углеводородную цепь из четырех или более атомов углерода, по меньшей мере один из атомов водорода которой замещен ферментативно неингибирующей группой, придающей хиральность указанному амину, отличающийся тем, что обогащают смесь хиральными аминами путем введения ее в водной среде и в присутствии аминоакцептора в контакт с омега-аминокислотной трансаминазой, которая ферментативно активна по отношению к аминогруппе одного из хиральных аминов при ферментативно неингибирующих температурах и pH, при этом реакцию ведут до тех пор, пока существенное количество одного из хиральных аминов не превратится в кетон формулы

где R¹ и R² имеют определенные для указанного амина значения, при этом энантиомерный избыток второго хирального амина составляет по крайней мере около 90% относительно превращенного в кетон энантиомера.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что непревращенный в кетон хиральный амин извлекают из реакционной смеси.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что значительное количество образованного кетона извлекают из водной среды.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что кетон, извлеченный из водной среды, независимо вводят в реакцию с омега-аминокислотной трансаминазой в присутствии аминодонора до образования энантиомера хирального амина, первоначально превращенного в кетон, в значительно более высоком количестве, чем количество другого энантиомера.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве аминоакцептора используют --кетокарбоновую кислоту, алифатический или циклоалифатический кетон, алифатический или циклоалифатический альдегид, или вещество, биохимически превращенное в -кетокарбоновую кислоту in situ в реакционной среде.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве аминоакцептора используют глиоксалевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевоуксусную кислоту, их соль, или гептальдегид.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что R¹ и R² независимо обозначают неразветвленную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, неразветвленную или разветвленную фенилалкильную группу, содержащую 7 12 атомов углерода, фенильную или нафтильную группу, при этом каждая из указанных групп не замещена или замещена ферментативно неингибирующей группой.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что R¹ и R² независимо обозначают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, н-бутил, S-бутил, фенил, бензил, фенокси, нафтил, тетрагидронафтил, индил или фенэтил, незамещенные или замещенные метилом, метоксигруппой или галогеном.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что смесь хиральных аминов в присутствии аминоакцептора вводят в контакт с -аминокислотной трансаминазой в виде клеток микроорганизма продуцента фермента, или в виде свободного от клеток водного раствора фермента, или в имобилизованной на подложке форме.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3