Способ получения модифицированного макропористого кремнезема для хроматографии биополимеров

 

Изобретение относится к получению микропористого кремнезема для хроматографии биополимеров. Кремнезем с диаметром пор 6 - 400 нм, обработанный винилметилхлорсиланом в среде органического растворителя, вакуумируют, активируют источником - облучения и обрабатывают парами трифторстирола. Полученный сорбент позволяет снизить неспецифическую сорбцию РНК из водных растворов. 2 табл.

Изобретение относится к твердым сорбентам для жидкостной хроматографии и может быть использовано в обращенно-фазовой хроматографии нуклеиновых кислот и пептидов.

Цель изобретения снижение неспецифической сорбции тРНК из водных растворов на модифицированном кремнеземе.

Пример 1. 10 г высушенного при 573 к макропористого стекла (МПС-2000ГХ) кипятят в 5% растворе метилвинилдихлорсилана в абсолютном толуоле в течение 10 часов. После этого МПС промывают абсолютным бензолом, ацетоном и сушат вначале в вакуумном шкафу, а затем на вакуумной установке при 10^-3 Торр до постоянного веса. Перед облучением МПС вакуумируют при 413 К до остаточного давления 10^-3 Торр и облучают с помощью источника облучения дозой 5 Мрад при 77 К. Ампулу размораживают до комнатной температуры, напускают пары трифторстирола и выдерживают в течение 8 часов. После этого образец откачивают до 10^-3 Торр, напускают воздух и отсоединяют от установки. Модифицированный кремнезем помещают в аппарат Сокслетта и в течение 3 часов проводят экстракцию образовавшегося гомополимера бензолом.

Полученный продукт общей формулы при гравиметрическом анализе дает значение X 95 масс. Y 5 мас. при анализе на углерод 3,2% на фтор 1,5% что соответствует значениям X 95 мас. Y 5 мас. Молекулярный вес политрифторстирола определяли методом эксклюзионной ВЭЖХ после растворения модифицированного кремнезема в 30% плавиковой кислоте и экстракции полимера тетрагидрофураном.

Значения N составили 550 600.

Пример 2. Синтез проводят аналогично примеру 1, только вместо МПС-2000 берут МПС-250, а облучают дозой 8 Мрад. Полученный продукт при гравиметрическом анализе дает значения X 85 мас. Y 15 мас. при анализе на углерод 9,7% на фтор 4,5% что соответствует значениям X 85 мас. Y 15 мас. Значения N составили 450 550.

Пример 3. Получение сорбента для высокоэффективной хроматографии. 10 г высушенного при 573 К силикагеля с диаметром пор 50 нм (фракция 10 мкм) кипятят в 5% растворе метилвинилдихлорсилана в абсолютном толуоле в течение 10 часов. После этого силикагель промывают абсолютным бензолом, ацетоном и сушат вначале в вакуумном шкафу, а затем на вакуумной установке при 10^-3 Торр до постоянного веса. Перед облучением силикагель вакуумируют при 413 К до остаточного давления 10^-3 Торр и облучают с помощью источника - облучения дозой 1 Мрад при 77 К. Ампулу размораживают до комнатной температуры, напускают пары трифторстирола и выдерживают в течение суток. После этого образец откачивают до 10^-3 Торр, напускают воздух и отсоединяют от установки. Модифицированный кремнезем помещают в аппарат Сокслетта и в течение 8 часов проводят экстракцию образовавшегося гомополимера бензолом.

Полученный продукт общей формулы при гравиметрическом анализе дает значения X 85 мас. Y 15 мас. при анализе на углерод 9,0% на фтор 4,3% что соответствует значениям X 86 мас, Y 14 мас. Значения N составили 300 450.

Пример 4. Синтез сорбента ведут как в примере 3, но в качестве исходного кремнезема берут силикагель Армсфер Сил30 (диаметр пор 30 нм), а облучают дозой 5 Мрад. Анализ продукта на углерод дает значение 12,9% на фтор 6,1% что соответствует значениям X 80 мас. Y 20 мас.

Пример 5. Синтез сорбента ведут как в примере 3, но в качестве исходного кремнезема берут силикагель Армсфер Сил=10 (диаметр пор 10 нм), а облучают дозой 8 Мрад. Анализ продукта на углерод дает значение 19,3% на фтор 9,2% что соответствует значениям X 70 мас. Y 30 мас.

Пример 6. Адсорбционную емкость сорбентов, синтезированных по примерам 3 6, определяют по толуолу. Полученные данные приведены в табл.1. Как видно из таблицы, емкость всех сорбентов высокая, что позволяет их использовать в обращенно-фазовой хроматографии.

Пример 7. Стальную колонку размером 4,6х250 мм заполняют сорбентом, приготовленным по примерам 3 5 и определяют ее эффективность по бифенилу, используя элюэнт метанол-вода (85-15). Результаты представлены в табл.1. Эффективность составляет 30 45 тыс. т.т. на метр длины.

Сорбент применяют либо для избирательной фиксации биологических макромолекул, которые желательно выделить или очистить, либо для избирательного задерживания примесей (обычно высокомолекулярных нуклеиновых кислот и белков), присутствие которых является нежелательным. Избирательная фиксация биополимеров легко может быть достигнута путем регулирования величины полярности и гидрофобности элюента в соответствии с хорошо известными методами, применяемыми в обращенно-фазовой и гидрофобной хроматографии. В том случае, когда сорбируются макромолекулы, которые необходимо очистить, их элюируют раствором, содержащим определенное количество органической добавки. В том случае, если материал задерживает примеси, биополимеры собирают непосредственно в растворе, после чего проводят регенерацию сорбента для последующего использования. Нижеследующий пример подтверждает эффективность применения сорбента для очистки нуклеиновых кислот.

Пример 8. Проводят высокоэффективную очистку нуклеиновых кислот от белков, используя 500 мг сорбента, приготовленного по примерам 1 2, по следующей схеме: сначала приводят колонку в состояние равновесия с 0,01М ТЕ-буфером (pH= 8,1). Затем в шприц объемом 5 мл набирают порцию плазмиды (или любой другой нуклеиновой кислоты) и медленно продавливают через колонку. Элюат повторно набирают в шприц и продавливают через колонку. Так повторяют 5 9 раз. За один цикл можно почистить от 20 до 30 мг нуклеиновой кислоты. Колонку регенерируют промывкой метанолом с этиленгликолем (5:1).

Сорбенты, полученные по примерам 3 5, используют для обращенно-фазовой ВЭЖК пептидов. Это применение поясняется следующим примером.

Пример 9. Проводят разделение пептидов на колонке (2 х 65 мм) заполненной сорбентом, полученным по примеру 3. Элюцию ведут градиентом концентрации (0 50%) ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте общим объемом 2400 мкл со скоростью 100 мкл/мин. Порядок выхода пептидов: А-цепь инсулина, брадикинин, Б-цепь инсулина, лизоцим. Эффективность колонки по лизоциму, определенная в изократическом режиме при постоянной концентрации ацетонитрила, равной 50% составила 30 тыс. т.т/м.

Пример 10. Для определения неспецифической сорбции тРНК 1 г сорбента, полученного по примерам 1 2, прибавляют в 5 мл пропилового спирта, дегазируют под вакуумом. Затем спирт декантируют, сорбент промывают 0,01 М трис-HC1 буфером (pH=7,5) и помещают в колонку размером 1 х 6 см. На колонку наносят 1 мг тРНК E.coli в 0,5 мл указанного буферного раствора и элюируют со скоростью 0,5 мл/мин общим объемом 10 мл. Собирают 10 мл элюата и спектрофотометрически определяют концентрацию тРНК. Умножая концентрацию на объем элюата (10 мл), получают содержание тРНК в элюате. Разность между исходным количеством тРНК и содержанием ее в элюате представляет собой величину неспецифической сорбции тРНК на сорбенте, синтезированном по предлагаемому способу. Полученные результаты представлены в табл.2.

Формула изобретения

Способ получения модифицированного макропористого кремнезема для хроматографии биополимеров, включающий обработку кремнеземного сорбента с диаметром пор 6 400 нм фторсодержащим мономером под действием гамма-облучения, отличающийся тем, что, с целью снижения неспецифической сорбции тRHK из водных растворов, в качестве кремнеземного сорбента используют кремнезем, обработанный винилметилдихлорсиланом в среде органического растворителя при нагревании, вакуумированный сорбент активируют источником J-облучения, а обработку ведут трифторстиролом из газовой фазы.

РИСУНКИ

Рисунок 1