Способ получения поливалентной вакцины против кишечных инфекций

 

Использование: биотехнология, медицина, антигены сальмонелл и шигелл, вакцина против брюшного тифа и дизентерии. Сущность изобретения: высокая иммуногенная активность и низкая токсичность при сохранении структуры клеточных компонентов и всех видов антигенов, локализующихся в них, достигается тем, что вакцина включает в равных долях инактивированные шигеллы дизентерии Флекснера и Зонне, сальмонеллы брюшного тифа и паратифа Б. Вакцина содержит в составе клеточных структур О-соматический и Н-жгутиковый антиген, а в растворе вакцины О-соматический, Н-жгутиковый и Vi-поверхностный антигены. Биохимический состав вакцины: белок 19,6 - 20,5%, полисахарид 15,00,1%, липиды - следы. При изготовлении вакцины раздельно обрабатывают компоненты бактерий водно-солевым раствором с одновременной дезинтеграцией при помощи шуттелирования в присутствии антибиотика гентамицина и мелкораздробленного стекла в течение 1-1,5 ч и центрифугирования. После диализа и раздельной лиофилизации все компоненты смешиваются в равных пропорциях 1:1:1:1. 3 табл., 4 ил.

Изобретение относится к медицине, к препаратам, содержащим антигены сальмонелл и шигелл, и может быть использовано для создания низкотоксичных и эффективных вакцин против брюшного тифа и дизентерии, при разных способах их введения подкожном, внутримышечном и пероральном.

Известны ранее используемые ассоциированные вакцины против кишечных и анаэробных инфекций вакцина НИИСИ и ТАБТе. Первая из них включала антигенные компоненты брюшного тифа, паратифов А и Б, дизентерии Флекснера и Зонне, холеры и столбняка и была заменена на вторую, после изъятия высокотоксичных и малоэффективных холерного и дизентерийного компонентов.

Однако и вакцина ТАБТе также была снята с производства из-за высокой реактогенности. В настоящее время выпускается моновакцина против брюшного тифа Т-вакцина.

Следует отметить, что еще в середине 60-х годов в строго контролируемых эпидемологических опытах была показана низкая эффективность кишечных компонентов в вышеупомянутых ассоциированных вакцинах, для получения которых использовали метод ферментативного гидролиза. Метод разработан Райстриком и Топли и модифицирован отечественными учеными в 1940 году. В модифицированном методе ферментативное расщепление бактерий проводят панкреатином, при повышенной температуре длительное время (12 ч, +45^oC). Препарат довольно токсичен и его ЛД₅₀ составляет 0,2 0,25 мг/мышь, а иммуногенность по критерию ЕД₅₀ составляет 1,39-2,9 мкг/мышь.

Несмотря на установленную в эпидемиологических опытах низкую эффективность, выраженную реактогенность и токсичность препаратов, полученных вышеупомянутым методом, его используют и по сей день для производства кишечных вакцин, в частности моновакцины против брюшного тифа Т-вакцины. Данный препарат принят нами за прототип.

Поставленная задача заключается в том, чтобы расширить спектр антигенных веществ в брюшнотифозной вакцине, при этом повысить их эффективность путем поликлональной активации, а также снизить токсичность препаратов.

Для решения данной задачи в вакцину, содержащую антигены брюшного тифа, дополнительно включены антигены сальмонелл паратифа Б и антигены дизентерийных бактерий Флекснера и Зонне, упакованные в структурные компоненты клеток -клеточные стенки со жгутиками, содержащие высокоиммуногенные О-соматический и Н-жгутиковый антигены, которые находятся в смеси с растворимыми Vi-антигеном, экстрагируемым с поверхности клеток.

Суть изобретения заключается в следующем.

Еще в начале 60-х годов в эпидемиологических опытах было показано, что Н-антиген сальмонелл тифа обладает высокой защитной активностью и присутствие его в брюшнотифозных вакцинах делает ее более эффективной. Причем большую роль в этом играет сохранение нормальной конфигурации макромолекулы белкового компонента жгутиков флаггелина, которая легко разрушается под действием кислотности среды (pH ниже 4 или выше 11), повышенных температур и прочих неблагоприятных факторов. Экспериментально установлено, что введение в организм животных таких разрушенных молекул влечет за собой снижение продукции антител и индуцирование только 7S антител (IgG), тогда как 19S-антитела (IgM) полностью отсутствуют, а между тем они выполняют первую линию защиты против целой микробной клетки.

Таким образом, сохранение структурных компонентов сальмонелл (жгутиков, оболочек) необходимо для синтеза иммуноглобулинов различных классов (IgG и IgM), которые способствуют формированию полноценного и напряженного иммунитета, что обеспечивается предложенным антигенным составом вакцины.

Кроме того, известно, что антигены сальмонелл весьма токсичны, что обусловлено в наибольшей степени наличием липидов, особенно липида А, и характером связей между липидами и другими компонентами, составляющими антигенное вещество, белками, полисахаридами. Разрушение этих связей сопровождается выходом липидов в раствор и увеличением токсичности антигенов. В предложенном препарате межмолекулярные связи сохраняются благодаря методу изготовления.

Сравнительные данные, подтверждающие морфологически особенности экспериментальных антигенов сальмонелл и Т-вакцины, как прототипа представлены на фиг. 1, 2, 3, 4, а биологическая активность (токсичность, иммуногенность), химический состав и количественный выход антигенного вещества в табл. 1.

На представленных фотографиях ультратонких срезов антигенов, сделанных в электронном микроскопе (фиг. 1, 2, 3), выявлена макромолекулярная структура жгутиков и клеточных стенок носителей соматического О- и жгутикового Н-антигенов.

На фиг. 1 представлена структура клеточных остатков в антигенах S.typhi (Ж жгутики, КС -клеточные стенки, ЦМ цитоплазматическая мембрана, РБ и ХС рибосомы и хроматиновая субстанции. Увеличение в 10 000 тыс. раз); на фиг. 2 структура клеточных остатков в антигенах S. paratyphi. Обозначения те же, что на фиг. 1. Увеличение в 10 000 раз; на фиг. 3 нить жгутика S. paratuphi B. (Ж жгутик, ОН осевая нить (в виде продольной и поперечной), ЦЭ -цитоплазматические элементы вне клетки. Увеличение в 30 000 раз); на фиг. 4 - содержимое клеточных остатков в антигенах Т-вакцины (ОМ -осмеофильный материал, представляющий структурные единицы бактериальной клетки. Увеличение в 10 000 раз).

Особенно показательным является сохранение мономеров флаггелина, составляющего полимерную структуру жгутиков (фиг. 3), что в свою очередь свидетельствует о сохранении молекулярных связей.

Таким образом, высокоиммуногенные О- и Н-антигены находятся в упаковке в указанных структурах, что и является, по-видимому, причиной их низкой токсичности. Подтверждением тому является наличие в них незначительного содержания липидных компонентов в виде следов (см. табл. 1).

В отличие от экспериментальных антигенов электронная микроскопия антигенов брюшного тифа, составляющих Т-вакцину, выявила сильное изменение всех клеточных структур, при этом видны лишь мелкие осколки клеток (фиг. 4). Кроме того, установлено значительное содержание липидов в них и высокая токсичность (см. табл. 1).

Таким образом, полученные данные подтверждают сильное нарушение молекулярных связей в антигенных структурных компонентах Т-вакцины и вытекающие из этого последствия.

Кроме названных свойств, предложенная тетравакцина обладает также антигенной активностью при разных методах введения парентеральном и пероральном. Установлено, что подкожная инъекция или пероральное введение вакцины (см. табл. 2) индуцирует синтез специфических антител ко всем сальмонеллезным и дизентерийным компонентам вакцины. При этом на фоне полного отсутствия специфических агглютининов у контрольных, неиммунизированных животных сформировались антитела в высокой концентрации как к сальмонеллам, так и к шигеллам дизентерии.

Особенно важными представляются данные исследований сыворотки крови добровольцев (см. табл. 3), иммунизированных тетравакциной перорально (4 человека), поскольку этот путь введения является наименее реактогенным и безболезненным.

Результаты определения специфических антител свидетельствуют о наличии агглютининов к О-, Н- и Vi-антигенам сальмонелл тифа. Подобные результаты говорят о высокой иммунологической эффективности тетравакцины, которая даже при энтеральном введении может индуцировать синтез специфических антител ко всем наиболее иммуногенным компонентам бактериальной клетки, в том числе и к Н-антигенам, тогда как ферментативный метод не обеспечивает его сохранности.

Препарат обладает также неспецифической иммуностимулирующей активностью, создавая резистентность к неродственным бактериям, при введении его животным, ослабленным сублетальными дозами гамма-облучения, а также иммуномодулирующим действием.

Так, однократная подкожная инъекция тетравакцины в дозе 50 мкг через 4 часа после лучевого воздействия гамма-излучения ¹³⁷Cs в дозе 300 P, а затем зараженным внутрибрюшинно различными неродственными бактериями способствовало многократному повышению сопротивляемости животных к патогенной кишечной палочке (E. coli 093), бактериям синезеленого гноя (Pseudomonas aeruginosa) и бактериям мышиного тифа (S. typhimurium). Последние вызывают также сальмонеллы у животных и человека.

Иммуномодулирующая активность тетрана установлена на мышах, при совместном его введении с эритроцитами барана (ЭБ). Установлено, что введение вакцины в дозе 50 мкг и ЭБ в дозе 2х10⁶ повышает уровень антител к T-зависимым антигенам эритроцитам барана, что является косвенным свидетельством влияния препарата на T-систему иммунитета.

Так, через 7 и 14 суток после введения препаратов Ig титров в группах, получивших инъекцию ЭБ и тетравакцины, был равен 6,050,3 и 6,40,16 соответственно, при этом в контроле иммунизированных только ЭБ, Ig титров антител был равен соответственно 5,30,5 и 5,30,4.

Таким образом, использование предложенной вакцины позволяет расширить спектр не только как препарат со специфической антимикробной активностью, но также как неспецифический стимулятор иммунологической реактивности организма, повышающего уровень сопротивляемости к инфицированию неродственными микроорганизмами, как патогенными, так и условно патогенными. По-видимому, в основе данного феномена лежит влияние вакцины на Т- и Б-системы иммунитета, о чем свидетельствуют опыты по совместному введению тетравакцины с Т-зависимыми антигенами (ЭБ) и иммунного ответа на это введение.

Итак, суть изобретения заключается в дополнительном включении сальмонелл паратифа Б и шигелл дизентерии Флекснера и Зонне и сохранении структурных компонентов бактериальных клеток (жгутиков, клеточных стенок) и целостности макромолекулярных связей в них. При этом в клеточных структурах сохраняются и удачно сочетаются высокоиммуногенные О-, Н- и Vi-антигены, что сопровождается кумуляцией эффекта и по сравнению с прототипом позволяет увеличить эффективность вакцины в 2-2,5 раза и снизить интегральную токсичность вакцины в 40 раз.

Описанные свойства вакцины обеспечены способом ее получения.

Известен способ получения брошнотифозной вакцины методом панкреолиза. Однако он не позволяет получать низкотоксичное и высокоэффективное вакационное средство в связи с сильным повреждением клеточных структур.

Наиболее удачным техническим решением, принятым за прототип, является "Способ получения иммуностимулятора".

Способ включает водно-солевую экстракцию вещества из бактерий дизентерии, при одновременной механической дезинтеграции и последующую очистку диализом.

Однако было экспериментально установлено, что для получения предложенной тетравакцины, сохранения ее структуры и ее эффективности необходимо изменить режим щуттелирования и последовательность операций лиофилизации и смешивания компонентов бактерий. Сохранение целостности клеточных структур повышает выход целевого продукта.

Поставленная задача повышение выхода целевого продукта, расширение спектра антигенных веществ в его составе, повышение эффективности и снижение токсичности решена тем, что в способе получения вакционного препарата против патогенных кишечных инфекций, включающем раздельное культивирование шигелл Флекснера и Зонне, экстракцию иммуностимулятора из бактерий водно-солевым раствором, с одновременным механическим разрушением в присутствии антибиотика, с последующим центрифугированием, диализом надосадочной жидкости и лиофилизацией, раздельно обрабатывают сальмонеллы тифа, паратифа Б, шигеллы Флекснера и Зонне, проводят механическое разрушение путем щуттелирования в течение 1-1,5 ч, а затем после диализа производят раздельную лиофилизацию каждого компонента и смешивают их в равных пропорциях (1:1:1:1).

Суть изобретения заключается в том, что включение в состав вакцины компонентов сальмонелл тифа, паратифа Б, а также дизентерийных бактерий Флекснера и Зонне создало тем самым полидетерминантную структуру антигенов, что позволило увеличить поликлональную активацию лимфоидных клеток, продуцирующих антитела, вследствие чего повысилась в 2-2,5 раза иммуногенная эффективность препарата, а чтобы снизить в 40 раз токсичность вакцины, нужно было сохранить структурные компоненты клетки (клеточные стенки, жгутики). Для этого оказалось необходимым сократить время щуттелирования до 1-1,5 ч, а лиофилизацию проводить раздельно для каждого компонента, после чего смешать их в равных пропорциях.

Предположительно можно объяснить снижение токсичности и увеличение эффективности вакцины сохранением межмолекулярных связей.

Сохранение структуры клеточных стенок и жгутиков привело также к увеличению выхода антигенного вещества в 6-7 раз (см. табл.1).

Проведенный анализ уровня известных технических решений по патентам и научно-техническим источникам информации позволил установить, что предложение содержит новые существенные признаки, свойства которых позволяют решить поставленную задачу с получением положительного результата, не явного для специалистов в данной области техники.

Признаки, отличающие предложенное техническое решение от прототипа других вакцин, не выявлены, не выявлены они также и в способах их получения, поэтому оно соответствует критерию изобретения "новизна" и "изобретательский" уровень. Проверенный регламент получения вакцины позволяет сделать вывод в соответствии критерию "промышленная применимость".

Пример реализации способа. Проводят раздельное культивирование каждого из представителей сальмонелл и шигелл на плотных питательных средах, предварительно засеяв каждую из культур на жидкую питательную среду (инкубация 18-24 ч, 37^oC).

После получения микробной массы путем смыва ее с поверхности питательной среды небольшим объемом физиологического раствора (каждую культуру в отдельности) приступают к подготовке ее дезинтеграции. Для этого культуру помещают в бутыли со стерильным битым стеклом, добавляют антибиотик и приступают к щуттелированию культуры в бутылях, укрепленных в щуттель-аппарате. Встряхивание проводят в течение 1-1,5 ч.

Далее проводят центрифугирование дезинтегрированной культуры и отделение надосадочной жидкости от осадка, т.е. декантирование надосадочной жидкости, в которой содержится антигенное вещество бактерий.

После контроля стерильности декантата проводят его очистку от примеси питательной среды путем диализа против водопроводной (1 сутки), а затем дистиллированной воды (1 сутки).

Затем проводят раздельное высушивание декантатов каждой из входящих компонентов вакцины в лиофилизированном состоянии.

После высушивания декантатов (сухое антигенное вещество) приступают к их смешиванию в равных пропорциях (1:1:1:1) по весу.

Полученная смесь является вакциной против патогенных кишечных инфекций, содержащей сальмонеллы тифа, паратифа Б и шигеллы Флекснера и Зонне.

Таким образом, реализация предложенного способа позволяет увеличить выход антигенного вещества, при этом снизить токсичность и увеличить эффективность.

Формула изобретения

Способ получения поливалентной вакцины против кишечных инфекций, включающий раздельное выращивание культур Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B, Shigella Flexneria, Shigella Sonne, отделение биомассы от питательной среды, раздельную экстракцию антигенов, их очистку, выделение иммуногенных компонентов, их высушивание с последующим смешиванием в равных соотношениях, отличающийся тем, что экстракцию антигенов проводят водно-солевым раствором при шуттелировании в присутствии антибиотика и мелкораздробленного стекла в течение 1 1,5 ч, полученные экстракты центрифугируют, очистке подвергают супернатанты и после смешивания получают целевой продукт в виде смеси клеточных стенок, содержащих О-антигены используемых культур, с жгутиками, содержащими Н-антигены, и растворимыми Vi-антигенами сальмонелл.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5