Штамм гриба aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты

 

Использование: биотехнология, получение лимонной кислоты. Сущность изобретения: новый штамм-продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-678, полученный из ранее применяемого штамма Aspergillus niger Л-1 методом ступенчатой селекции. При промышленном культивировании данного штамма конверсия сахара в лимонную кислоту достигает 90,1%. 4 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения штамма гриба Aspergillus niger продуцента лимонной кислоты для глубинного культивирования на мелассных средах. Селекционированный штамм Aspergillus niger F-678 обладает высокой активностью образования лимонной кислоты при глубинном культивировании на разбавленных и концентрированных по сахару мелассных средах, продуцируя до 10,9 кг/м³ в сутки лимонной кислоты. При этом выход лимонной кислоты от редуцирующих веществ достигает 90,1% Известен штамм гриба Aspergillus niger CCF-1599, селекционированный чехословацкими исследователями и способный в условиях глубинного культивирования на средах, содержащих 10 20% сахарного субстрата, в течение 5 7 сут ферментации синтезировать до 75% лимонной кислоты от введенного сахара.

Недостатком штамма CCF-1599 является его низкая промышленная эффективность [1] Технико-экономические показатели известных штаммов, применяемых в странах СНГ в условиях производства лимонной кислоты методом глубинного культивирования, представлены в табл. 1.

Недостатком этих штаммов является короткая продолжительность периода активного кислотообразования, высокий расход сырья и низкий выход кислоты от сахара [2 4] Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-326 - продуцент лимонной кислоты, обладающий высокой активностью образования лимонной кислоты при глубинном культивировании на разбавленных по сахару мелассных средах, образуя до 9,9 кг/м³ в сутки лимонной кислоты. При этом выход от редуцирующих веществ составляет 88,2% Однако по технико-экономическим показателям прототип уступает новому штамму [4] Целью изобретения является получение нового универсального штамма, имеющего более высокую активность по образованию лимонной кислоты как в условиях коротких циклов, так и при длительной ферментации разбавленных и концентрированных по сахару мелассных сред.

Новый штамм гриба Aspergillus niger F-678 получен методом ступенчатой селекции на основе мутагенеза с использованием мутагенов химической и физической природы из ранее применяемого промышленного штамма Aspergillus niger Л-1 с последующим стабилизирующим отбором спонтанных вариантов.

Штамм Asp. niger F-678 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ВНИИГенетика.

Штамм Asp. piger F-678 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки Новый штамм на сусло-агаре через 5 сут культивирования образует колонии диаметром 6,7 см. Окраска колоний цвета слоновой кости. Воздушный мицелий развит слабо. Конидиеобразование обильное. Обратная сторона колонии гладкая. Конидиальные головки круглые, диаметром 135,412,5 мкм. Вздутия конидиеносцев шаровидные размером (37,53,9)(35,83,7) мкм. Стеригмы двухслойные. Длина стеригм I порядка 9,10,9 мкм, второго - 5,90,4 мкм. Диаметр конидий 3,90,1 мкм. Оболочка конидий имеет окраску цвета слоновой кости. Конидиеносцы прямые бесцветные длиной 942282 мкм, шириной 12,90,3 мкм.

Физиолого-биохимические признаки Аэроб.

Температурный диапазон роста 22 38^oC.

Оптимальная температура роста 321^oC.

Оптимум pH 5,6 7,2.

Отношение к источникам азота: усваивает азот органических соединений, например пептон, белок, аминокислоты, дрожжевой автолизат, мочевину, а также ассимилирует азот минеральных солей, предпочтительнее соли аммония, нитраты.

Отношение к источникам углерода; хорошо усваивает и растет на мальтозе, глюкозе, сахарозе, фруктозе, D-ксилозе, D-маннозе, в меньшей степени усваивает декстрин, сорбит, крахмал, D-раффинозу и плохо растет на лактозе.

Хорошо хранится в виде высушенных конидий (до 5 10% остаточной влажности) или в виде культуры, выращенной на скошенном сусло-агаре.

Температура культивирования 321^oC.

Длительность культивирования 7 сут.

Температура хранения +181^oC.

Генетические особенности прототроф, осмофил.

Штамм Asp. niger F-678 идентифицирован по Определителю грибов рода Aspergillus [5] Штамм F-678 отличается от родительского штамма Л-1 морфолого-культуральными признаками. В отличие от родительского штамма имеет более мелкие конидии, стеригмы I и II порядков и вздутия конидиеносцев. Конидиальная оболочка окрашена в цвет слоновой кости, т.е. практически лишена пигмента. У родительского штамма оболочка имеет темно-бежевый цвет.

Кроме того, селекционный штамм обладает высокой энергией прорастания конидий, т.е. время прорастания конидий штамма F-678 в сусле (7^o Б по сахару) 5 ч, в то время как у родительского штамма 7 ч.

При выращивании посевного мицелия (инокулюма) у селекционированного штамма накопление биомассы за счет быстрого прорастания конидий идет интенсивнее, что позволяет на 5 7 ч сократить время подготовки инокулюма.

Новый штамм уже в первые сутки процесса синтезирует преимущественно лимонную кислоту. Так, на третьи сутки в составе синтезируемых кислот на долю лимонной кислоты приходится 90 и более процентов, а у родительского штамма Л-1 около 80% Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Asp. niger F-678.

Пример 1. Выращивание кислотообразующего мицелия и синтез лимонной кислоты осуществляли в лабораторных условиях на качалке с числом качаний 1605 мин^-1 в колбах емкостью 700 см³ при 321^oC. Для выращивания посевного мицелия приготавливали мелассный раствор с концентрацией по сахару 30 г/дм³ следующего состава, г/дм³: Меласса 60,0
Карбонат натрия 0,08
Гексацианоферроат калия, гидрат 0,14
Оксалат аммония гидрат (для полного осаждения солей кальция и магния из расчета на CaO) 2,13
Дигидроортофосфат калия 0,16
Сульфат магния, гидрат 0,25
Сульфат цинка, гидрат 0,005
Вода водопроводная остальное до 1 дм³
pH 6,7
Для ферментации приготавливали мелассную среду, содержащую 30 г/дм³ сахара, по рецептуре, приведенной выше, но без добавления сульфата магния. Состав среды для подпитки культуры, г/дм³:
Меласса 497,0
Гексацианоферроат калия, гидрат 1,18
Вода водопроводная остальное до 1 дм³
pH 6,0
Выращивание посевного мицелия осуществляли в 50 см³ мелассной среды путем засева ее гомогенной суспензией конидий из расчета 0,01 г/м³. Объем конидиальной суспензии 10 см³. Длительность выращивания посевного мицелия 24 ч. Подготовленный таким образом инокулюм служил посевным материалом для засева ферментационной среды. Затем в среду, приготовленную для ферментации, в объеме 50 см³³ вносили по 10 см³ посевного мицелия.

В процессе ферментации проводили подпитку культуры мелассным раствором, содержащим 250 г/дм³ сахара, в два приема: первую подпитку через 24 ч ферментации в количестве 10 см³, вторую через 32 ч. ферментации в количестве 9 см³. Процесс заканчивали через 5 сут.

В качестве контроля использовали известный производственный штамм F-326. Результаты испытаний представлены в таблице 2. Данные табл. 2 показывают, что у селекционированного штамма возрастает массовая доля лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот на 5,4% съем лимонной кислоты на 13,7% а выход кислоты от сахара на 7,8%
Пример 2. Условия проведения и подготовки питательных сред те же, что в примере 1. Но изменена схема подпитки культуры: первый подлив через 24 ч ферментации в количестве 10 см³, второй через 30 ч. ферментации в количестве 9 см³, а затем по 4 см³ на 5, 6 и 7-е сутки ферментации. Процесс вели 9 сут. В качестве контроля (прототип) использовали тот же отечественный штамм F-326. Результаты опытов, представленные в табл. 2, показывают, что при длительных циклах у селекционированного штамма F-678 возрастает массовая доля (до 98,2% ) лимонной кислоты в сумме синтезируемых кислот. Образование лимонной кислоты с 1 м³ в сутки (съем) у нового штамма в этих условиях увеличивается по сравнению со штаммом F-326 на 8,4% а выход ее от сахара на 5,0% соответственно.

Пример 3. Условия проведения те же, что в примере 1. Выращивание посевного мицелия вели на мелассных средах, содержащих 50 г/дм³ сахара; ферментацию на мелассных средах с содержанием сахара 130 г/дм³ без дополнительной подпитки гриба.

Для выращивания посевного мицелия использовали мелассную среду состава, г/дм³:
Меласса 100,0
Карбонат натрия 0,13
Гексацианоферроат калия, гидрат 0,23
Оксалат аммония, гидрат 3,5
Сульфат магния, гидрат 0,25
Дигидроортофосфат калия 0,16
Сульфат цинка, гидрат 0,01
Вода водопроводная остальное до 1 дм³
pH 6,5.

Для ферментации применяли мелассную среду состава, г/дм³:
Меласса 260,0
Карбонат натрия 0,35
Гексацианоферроат калия, гидрат 0,610
Оксалат аммония, гидрат 4,6
Дигидроортофосфат калия 0,16
Сульфат цинка, гидрат 0,01
Вода водопроводная остальное до 1 дм³
pH 6,8.

Длительность ферментации 5 сут. Испытания показали, что на концентрированных по сахару мелассных средах с содержанием сахара 130 г/дм³ селекционированный штамм образует на 11,4% больше лимонной кислоты, чем известный штамм F-326 (табл. 3). При этом выход кислоты от сахара увеличивается на 6,1%
Пример 4. Выращивание посевного мицелия нового штамма и синтез лимонной кислоты осуществляли глубинным способом в производственных условиях по применению на Санкт-Петербургском заводе технологии. Контролем служил производственный штамм F-326.

На приготовление конидиальной суспензии, выращивание посевного мицелия, ферментацию и подписку культур обоих штаммов использовали мелассный раствора одного и того же состава. Посевной мицелий выращивали в посевных ферментаторах емкостью 5 м³. Объем мелассной среды 3 м³. Содержание сахара в ней 30 г/дм³. Через 24 ч выращенный мицелий переводили в ферментатор емкостью 50 м³, содержащий 27 м³ мелассного раствора с концентрацией сахара 30 г/дм³. Через 24 ч ферментации начинали подпитку гриба путем доливов мелассного раствора, содержащего 225 г/дм³ сахара, по 1 м³ через каждые 1,5 ч.

На четвертые и пятые сутки ферментации проводили отъем сферментированного раствора в количестве 5 м³. После чего в ферментатор вливали 2 м³ воды и 5 м³ мелассного раствора с концентрацией по сахару 225 г/дм³. Длительность процесса в опытных циклах составила в среднем 6,72 сут, в контрольных 6,69 сут.

В условиях производства у селекционированного штамма массовая доля лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот в среднем из трех опытов достигала 90,9% масса лимонной кислоты с 1 м³ ферментатора в сутки - 10,93 кг, удельный расход 46%-ной по сахару мелассы на 1 т лимонной кислоты - 2412 кг, выход кислоты от сахара 90,13% (табл. 4). У промышленного штамма F-326 массовая доля лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот в среднем из трех опытов составляла 89,7% продуктивность по массе лимонной кислоты с 1 м³ в сутки 10,21 кг,удельный расход 46%-ной мелассы на 1 т лимонной кислоты 2821 кг, выход лимонной кислоты от сахара 77,05%
Таким образом, новый селекционированный штамм в условиях производства образует на 7,0% больше лимонной кислоты с 1 м³ в сутки и дает экономию мелассы на 14,5 по сравнению с производственным штаммом F-326.

Следовательно, штамм F-678 обладает рядом приемуществ: более высокая продуктивность по лимонной кислоте и высокий выход ее от сахара до 90% и более обуславливает снижение основного расхода сырья и вспомогательных материалов; высокая энергия прорастания конидий позволяет снизить опасность вторичного инфициирования в период ферментации; большая технологичность нового штамма дает возможность увеличить конкурентноспособность его на мировом рынке.

Экономический эффект от использования штамма F-678 в производстве лимонной кислоты составит 10355 руб на 1 т лимонной кислоты (цены 1993 г).

Формула изобретения

Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-678 продуцент лимонной кислоты.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2