Криптаты редкоземельных металлов в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул

 

Использование: в медицине в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул. Сущность изобретения: криптаты редкоземельных металлов, образованных по меньшей мере одной солью редкоземельного металла, в сочетании с макрополициклическим соединением, отвечающим одной из приведенных ф-л I или II в описании. 4 з.п.ф-лы, 1 табл.,2 ил.

Изобретение относится к флуоресцентным маркерам, в частности к новой группе макроциклических комплексов редкоземельных металлов, которые можно использовать в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул.

Из заявки на патент Франции N 8414799 известны макрополициклические комплексы редкоземельных металлов, образованные по меньшей мере одной солью редкоземельного металла, образующего комплекс с макрополициклическим соединением общей формулы I в которой Z является атомом, имеющим 3 или 4 валентности, R ничего не означает или означает водород, гидроксильную группу, аминогруппу или углеводородный радикал, двухвалентные радикалы независимо друг от друга являются углеводородными звеньями, которые, возможно, содержат один или несколько гетероатомов и, возможно, прерываются гетеромакроциклом, причем по меньшей мере один из радикалов содержит по меньшей мере одно молекулярное звено.

Эти криптаты находят применение в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул. Цель изобретения разработка новых соединений, которые обладали бы более высокой флуоресцентной активностью.

Эта цель достигается с помощью соединений согласно изобретению, представляющих собой соль редкоземельного металла, в частности, европия или тербия, в виде комплекса с макроциклическим соединением, соответствующим одной из общих формул I или II: (I) (II) в которых цикл формулы означает один из следующих циклов:
где Y является линейным или разветвленным алкиленом C₁ - C₄,
Z является группой NH₂,
R является группой метил или группой Y Z,
R₁ является водородом или группой COOR_", в которой R_" означает алкил C₁ C₄, предпочтительно, метил, этил или трет-бутил.

Новые криптаты согласно изобретению, имеющие функциональную группу Z, способную связываться ковалентной связью с биологической молекулой, соединены с молекулой криптата через группы CO NH Y или , отдельные группы которых также способны ковалентно связываться с биологической молекулой, что значительно увеличивает флуоресцентную активность исходного криптата.

Сказанное можно проиллюстрировать на следующем сравнительном примере, согласно которому измерялась флуоресцентная активность соединений согласно изобретению с известными криптатами.

Замеры проводились на спектрометре PERKIN-ELMER LS 5 в следующих условиях:
ширина щели при возбуждении/эмиссии: 2,5/10 мм
возбуждение при указанной длине волны
измерения выражались в пересчете на концентрацию криптата, равную 10^-5 моль/л воды в качестве растворителя;
коэффициент расширения: I.

Испытывались следующие соединения:
Соединения I и II (контроль): 4,4'-динитро или дибромпроизводные соединения I.

Соединение III: 4,4'-диамидэтиленаминовое производное соединения I, которое является соединением формулы I согласно изобретению, у которого Y (CH₂)₂ и Z NH₂

Результаты описаны в следующей таблице.

Из данных таблицы видно, что соединения согласно изобретению значительно превосходят по флуоресцентному эффекту аналогичные соединения, не содержащие промежуточных групп между функциональной группой и молекулой криптата.

Криптаты согласно изобретению могут быть получены либо:
конденсацией цикла с 6,6'-дигалогенметил-2,2'-бипиридином, двухзамещенным в позициях 4,4' с последующим замещением группой или и образованием комплекса полученного макрополициклического соединения с солью редкоземельного металла, или
конденсацией молекулы 6,6'-диаминметил-2,2'-бипиридина, двузамещенного в позициях 4,4', с двумя молекулами 6,6'-дигалогенметил 2,2'-бипиридина, двузамещенного в 4,4', с последующим замещением группой NH Y Z или группой Y Z и комплексованием полученного макрополициклического соединения солью редкоземельного металла.

В названных способах образование комплекса с солью редкоземельного металла может происходить перед стадией замещения, что является предпочтительным.

Далее подробно описаны различные способы получения криптатов по изобретению.

,
где Х является галогенгруппой, R₁ алкилгруппой, имеющей от 1 до 10 атомов углерода, предпочтительно метил, этил или третичный бутил.

По этому способу конденсируют галогенпроизводное соединение бипиридина с макроциклом .

Эта реакция осуществляется в безводном органическом растворителе, таком, как, например, ацетонитрил, в присутствии основания, такого, как карбонат иона щелочного металла, например, карбонат натрия или карбонат лития при температуре рефлюкса. Получаемый макробицикл 3 находится в форме криптата иона щелочного металла, например, в виде криптата натрия.

Затем осуществляют аминолиз макробициклического соединения путем реакции его с амином формулы N₂H Y Z, в которой группы Y и Z определены выше, причем функциональная группа Z может быть блокирована известными средствами. Действуют предпочтительно в атмосфере азота и при температуре окружающей среды.

После завершения реакции избыток амина удаляют с помощью соответствующих средств, а криптат формулы 4 извлекают с помощью обычных средств.

Полученное таким образом соединение преобразуют затем в криптат редкоземельного металла посредством ионообмена, нагревая с обратным холодильником раствор криптата иона щелочного металла макробицикла 4 в метаноле, возможно, в присутствии хлороформа с раствором галогенида редкоземельного металла в метаноле.

Способ Б:


По этому способу конденсируют две молекулы галогенпроизводного 6 с одной молекулой аминопроизводного 5. Действуют в таких же условиях, что и на первой стадии способа А, т.е. эту конденсацию осуществляют в безводном органическом растворителе, таком, как ацетонитрил, в присутствии такого основания, как карбонат иона щелочного металла, например, карбоната натрия или карбоната лития.

Действуют при температуре рефлюкса. Получают макрополициклическое соединение 7, которое является ключевым промежуточным продуктом при синтезе криптатов по изобретению.

Этот макрополициклический комплекс находится в виде криптата иона щелочного металла, который предпочтительно преобразуют в криптат редкоземельного элемента перед аминолизом по способу, определенному выше.

Как и для способа А, криптат иона щелочного металла 7 может быть декомплексован для получения макрополициклического соединения 7, соответствующего свободному криптанду, который затем повторно подвергают комплексообразованию в криптат редкоземельного металла.

Затем проводят аминолиз соединения 7 по определенному выше способу и получают макрополициклический комплекс 8, т.е. криптат по изобретению формулы I, в которой является макроциклом бисбипиридина, Y, Z и R' такие, как определено выше.

Способ В

Согласно этому методу галогенпроизводное бипиридина 9, соответствующим образом замещенное, вначале конденсируют с макроциклом 2.

Эта реакция осуществляется в безводном органическом растворителе, таком, как, например, ацетонитрил, в присутствии основания, такого, как карбонат иона щелочного металла, например, карбоната натрия или карбоната лития.

При этом получают макрополициклическое соединение 10 в виде криптата иона щелочного металла. Работают предпочтительно при температуре рефлюкса.

Затем осуществляют реакцию замещения макрополициклического соединения 10, путем взаимодействия соединения 10 с галогенидом формулы XYZ, причем Z и Y такие, как определено выше, а Х ион галогенида.

Получаемое соединение II затем преобразуется в криптат редкоземельного металла путем ионообмена, например, по определенному способу.

Предпочтительно растворяют галогенид редкоземельного металла в метаноле и добавляют к нему раствор криптата иона щелочного металла в метаноле с небольшим количеством хлороформа в случае необходимости.

Смесь нагревают с обратным холодильником в атмосфере инертного газа и наблюдают за исчезновением иона щелочного металла посредством хроматографии на тонком слое.

Соединения по изобретению могут использоваться в качестве флуоресцентных маркеров биологических продуктов и подходят в качестве реактивов для количественного анализа в способах иммунологического обнаружения и определения с помощью флуоресценции как при количественном анализе по методу конкуренции, так и по методу избытка.

Изобретение будет описано более подробно с помощью описанных примеров.

П р и м е р 1. Криптат редкоземельного металла [(22)(n- OCH₃ n - OCH₂CH₂NH₂ дифенилбипиридин)] формула II" R CH₃, Y CH₂CH₂, Z NH₂, является макроциклом (22) (способ B).

А-6,6'-Диметил-4,4'-(ди-(n-метоксифенил)-2,2'-бипиридин (соединение 12).

Смесь 1,6-ди(n-метоксифенил)-1,5-гексадиен-3,4-диона (3,07 г, 9,5 ммоль), хлористого -1-пиридиниумпропан-2-она (3,27 г, 19,1 ммоль), полученную смешиванием эквимолекулярных количеств пиридина и 1-хлорацетона и ацетата аммония (19 г) в 95,5 мл CH₃OH, нагревают с обратным холодильником 38 ч в атмосфере азота.

После возвращения реакционной смеси к температуре окружающей среды образовавшийся осадок кремового цвета фильтруют и промывают в CH₃OH. Сырой продукт используют без дополнительной очистки. Он может быть кристаллизован на CH₂Cl₂/гексан.

Выход 70%
Хроматография в тонком слое (ХТС): R_f 0,5 CH₂Cl₂/CH₃OH, 95/5.

MC: 396 (M⁺), 381 (M⁺ CH₃), 365 (M⁺ - 2CH₃), 353 (M⁺ CH₃ CO), 338 (M⁺ 2CH₃ CO), 198 (M⁺/2).

Б 1,1'-ди-(N-оксид)-6,6'-диметил-4,4'-ди(n-метоксифенил)-2,2'- бипиридин (соединение 13).

К раствору полученного соединения (3,45 г, 8,7 ммоль) в 800 мл CHCl₃ добавляют по капле при 0^oC раствор м-хлорпербензойной кислоты (6 г, 34,8 ммоль) в 360 мл CHCl₃.

Оставляют на ночь при перемешивании при температуре окружающей среды. Смесь затем промывают с насыщенным раствором NaHCO₃ до щелочного рН. Органическую фазу отделяют и концентрируют. Добавка гексана вызывает осаждение соединения.

Осадок фильтруют, затем вновь растворяют в смеси CH₂Cl₂/CH₃OH (90/10) и промывают 2 н. раствором щелочи натрия. Органическую фазу, содержащую целевое соединение, отделяют, растворитель выпаривают.

В то же время фильтрат, поступающий с осаждения, также промывают 2 н. раствором щелочи натрия, затем концентрируют и подвергают хроматографии на колонке оксида алюминия с CH₂Cl₂ в качестве элюента.

Выход: 80% Т.пл. > 250^oC.

ХТC: R_f 0,5 (оксид алюминия, CH₂Cl₂/CH₃OH, 95/5)
MC: 429 (MH⁺), 411 (M⁺ H₂O).

В 6,6'-диацетоксиметил-4,4'-ди(n-метоксифенил)-2,2'-бипиридин (соединение 14).

Суспензию полученного соединения (1,21 г, 2,82 ммоль) в 18 мл уксусного ангидрида нагревают с обратным холодильником 1 ч 30 мин. Полученный раствор концентрируют. Добавляют 5 мл H₂O и 20 мл CH₂Cl₂ в пастообразный остаток и подщелачивают среду водным насыщенным раствором NaHCO₃.

Органическую фазу отделяют, водную фазу экстрагируют дважды с 30 мл CH₂Cl₂. Образующуюся органическую фазу сушат на Na₂SO₄, а растворитель выпаривают. Сырой продукт подвергают хроматографии на колонке с оксидом алюминия с CH₂Cl₂ в качестве элюента.

Выход: 90% Т.пл. 140 141^oC
ТХС: R_f 0,9 (оксид алюминия, CH₂Cl₂/CH₃OH, 95/5)
MC: 513 (MH⁺), 469 (M⁺ C(O)CH₃), 453 (M⁺ - CH₃COOH), 256 (M⁺/2)
Г 6,6'-дибромметил-4,4'-ди(n-метоксифенил)-2,2'-бипиридин (соединение 9a: R₂ CH₃)
6,6'-дибромметил-(n-4-метоксифенил, n-4'-гидроксифенил),
2,2'-бипиридин (соединение 9б: один из радикалов R₂ H, другой - CH₃).

Раствор полученного соединения 14 (0,31 г, 0,60 ммоль) в 5 мл HBr/AcOH (33% ) нагревают с обратным холодильником 12 13 ч. Добавляют 20 мл H₂O и 60 мл CHCl₃ в раствор при температуре окружающей среды. Промывают насыщенным раствором NaHCO₃ до нейтрализации. Органическую фазу отделяют, а водную фазу,а водную фазу экстрагируют дважды с 20 мл CH₂Cl₂.

Растворитель выпаривают из получаемой органической фазы, а остаток подвергается хроматографии на колонке с оксидом глинозема с помощью CH₂Cl₂, затем CH₂Cl₂/CH₃OH (95/5) в качестве элюанта.

Соединение 9a: R₂ CH₃; выход: 16%
Разложение: 210 215^oC.

XTC: R_f > 0,9 (оксид алюминия, CH₂Cl₂/CH₃OH, 95/5)
MC: 556, 555, 553 (MH⁺), 556, 554, 552 (M⁺), 475, 473 (M⁺ Br), 394 (M⁺ 2Br).

Соединение 9б: один из радикалов R₂ H; выход 35%
XTC: R_f 0,4 (оксид алюминия, CH₂Cl₂/CH₃OH, 95/5).

MC: 542, 540, 538 (M⁺), 461, 459 (M⁺ Br), 380 (M⁺ 2Br).

D Криптат натрия [(22)(n-OCH₃-n-OH дифенилбипиридин)] (соединение 10).

Смесь макроцикла (22) (0,262 г, 1 ммоль) и Na₂CO₃ (1,05 г, 10 ммоль) в 600 мл безводного CH₃CN нагревают с обратным холодильником 30 мин в атмосфере азота.

К ней добавляют суспензию соединения 9б (0,54 г, 1 ммоль) в 450 мл безводного CH₃CH. Смесь нагревают 20 ч с обратным холодильником в атмосфере азота.

Получаемый раствор фильтруют при нагревании, а растворитель выпаривают. Сырой продукт подвергают хроматографии на оксиде алюминия с помощью CH₂Cl₂/CH₃OH (95/5) в качестве элюанта.

Выход 60 65%
XTC: R_f 0,6 (оксид алюминия, CH₂Cl₂/CH₃OH, 90/10)
MC: 663 (M⁺), 640 (⁺ Na), 625 (M⁺ Na - CH₃), 609 (M⁺ Na OCH₃), 595 (M⁺ Na OCH₃ OH).

E криптат натрия [(22) (n OCH₃ n OCH₃CN дифенилбипиридин)]
(Соединение IIa): Z CN; Y CH₂; R CH₃.

К раствору криптата натрия соединения 10 (0,042 г, 0,066 ммоль) в минимальном объеме CH₃CN добавляют избыток NaH (в порошке) в атмосфере азота. Нагревают с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 1 ч. Раствор доводят до температуры окружающей среды перед добавлением бромацетонитрила (1,2 эквивалента). Смесь перемешивают при температуре окружающей среды в атмосфере азота всю ночь.

Добавляют 20 мл H₂O и 10 мл CH₂Cl₂. Нейтрализуют среду насыщенным раствором NaHCO₃. Органическую фазу отделяют, а водную фазу экстрагируют дважды с 20 мл CH₂Cl₂.

Получаемую органическую фазу сушат на Na₂SO₄, затем растворители выпаривают. Сырой продукт подвергается хроматографии на колонке оксида алюминия с помощью CH₂Cl₂/CH₃OH (96/4) в качестве элюанта.

Выход 75%
XTC R_f 0,5 (сине-фиолетовое пятно), (оксид алюминия, CH₂Cl₂/CH₃OH, 92,5/7,5)
MC: 702 (M⁺), 679 (M⁺ Na), 663 (M⁺ Na H - CH₃), 654 (MH⁺ Na CH), 640 (MH⁺ Na CH₂CN).

Ж криптат натрия [(22) (n OCH₃n - OCH₂CH₂NH₂ дифенилбипиридин)]
(Соединение IIb: Z NH₂; Y CH₂ CH₂; R CH₃).

К суспензии соединения IIa (0,078 г, 0,1 ммоль) в 8 мл безводного ТГФ добавляют 2 мл B₂H₆ (IM в ТГФ) и 5 мл дополнительного ТГФ. Перемешивают при температуре окружающей среды в течение ночи. Добавляют 10 мл CH₂OH и перемешивают 20 30 мин. Растворители выпаривают. Добавляют к остатку 20 мл смеси H₂O/HCl концентрированной (1/1).

Наблюдают осадок желтого цвета и выделение газа. Постепенно происходит растворение. Выпаривают растворители и обрабатывают полученный остаток водным раствором NaOH (6 N). Амин IIб извлекают с помощью 25 мл CH₂Cl₂. Количественный выход. Образование соединения выявляется с помощью 1H-ЯМР.

З реакция комплексообразования: обмен натрия на ион Zn³⁺ (Eu, Tb).

Растворяют ZnCl₃ х H₂O (0,1 ммоль) в 25 мл CH₃OН и добавляют туда полученный предварительно раствор криптата натрия (0,06 ммоль) в 4 8 мл CHCl₃ (минимальный объем). Нагревают смесь с обратным холодильником в атмосфере азота (от 6 ч до 4 дней в зависимости от рассматриваемого криптата натрия). Следят за исчезновением криптата натрия с помощью хроматографии на колонке (оксид алюминия, CH₂Cl₂/CH₃OH, 90/10).

После окончания реакции фильтруют реакционную смесь в случае необходимости и выпаривают растворители. Вновь растворяют остаток в 15 20 мл CH₃OH и добавляют эфир до устойчивого помутнения (5 мл до 25 30 мл).

Образовавшийся криптат редкоземельного элемента кристаллизуют и осаждают очень быстро или после нескольких часов в зависимости от типа криптата. Образование криптата выявляется с помощью ¹Н-ЯМР и ультрафиолетовой спектроскопии видимой области.

В соответствии с этим рабочим способом получали соответственно криптат европия и криптат тербия формулы II, которые имеют следующие спектроскопические характеристики.

Криптат европия: ультрафиолетовое излучения видимая часть в CH₃OH, 280 нм максимум; 292 нм плечо; 320 нм максимум.

Криптат тербия: ультрафиолетовое излучение видимая часть в H₂O 282 нм максимум; 310 нм плечо.

П р и м е р 2. Криптат редкоземельного элемента [бипиридин, бипиридин (n- OCH₃ n OCH₂CH₂NH₂ дифенилбипиридин)]
R CH₃; Y CH₂ CH₂ -; Z NH₂; R¹ является макроциклом биспиридина (способ B).

А криптат натрия [бипиридин.бипиридин(n-OCH>₃n-OН дифенилбипиридин)] (соединение 10).

Смесь макроцикла бис-бипиридина (0,48 г, 1,21 ммоль) и Na₂CO₃ (1,16 г, 11 ммоль) в 480 мл безводного CH₃CN нагревают с обратным холодильником 30 мин в атмосфере азота. В нее добавляют суспензию 6,6'-диброметил-(n-4-метоксифенил,n-4'-гидроксифенил)-2,2'- бипиридина, приготовленную, как показано выше (см.пример 1, пункт Г) (0,65 г, 1,20 ммоль) в 340 мл CH₃CN.

Полученный раствор нагревают 24 ч с обратным холодильником в атмосфере азота. После возвращения к температуре окружающей среды реакционную смесь фильтруют, а растворитель выпаривают. Сырой продукт затем подвергают хроматографии на колонке оксида алюминия с CH₂Cl₂/CH₃OH (98/2) в качестве элюанта.

Выход 45%
XTC. R_f 0,4 (оксид алюминия, CH₂Cl₂/CH₃OH, 90/10)
фиолетовое пятно (254 нм), зеленое (366 нм)
MC: a) IC(NH₃): 795 (M⁺), 773 (MH⁺-Na)
b) FAB (тиоглицерин): 875 (MBr⁺), 795 (M⁺).

Получаемый криптат натрия был переобразован в криптат тербия по способу, описанному в примере 13. Этот криптат имеет следующие спектроскопические характеристики:
Ультрафиолетовое излучение видимой части в H₂O:
244 нм (максимум); 303 нм (максимум)
Ультрафиолетовое излучение видимой части в CH₃OH:
244 нм (максимум); 301 нм (максимум); 318 нм (закраина).

Б Криптат натрия [бипиридинбипиридин((n-OCH₃-n-OCH₂CNдифенилбипирид- ин)]
К раствору криптата натрия 10 (0,21 г, 0,24 ммоль) в 12 мл CH₂Cl₂ и 12 мл CH₃OH добавляют раствор NaOH в CH₃OH (1,5 эквивалента в 2 мл). Смесь нагревают 1 ч 30 мин в атмосфере азота с обратным холодильником.

После возвращения к температуре окружающей среды растворитель выпаривают; образующуюся в ходе реакции воду удаляют с помощью азоатропной дистилляции с толуолом.

Полученный таким образом продукт сушат с помощью лопастного насоса всю ночь. Полученное соединение ярко-оранжевого цвета растворяют в 35 мл тетрагидрофурана (раствор мутный). С добавлением бромацетонитрила (30 мкл, 1,8 эквивалента) раствор становится прозрачным.

Оставляют на всю ночь при температуре окружающей среды с перемешиванием в атмосфере азота. Добавляют 20 мл H₂O и около 10 мл CH₂Cl₂. Нейтрализуют среду насыщенным раствором NaHCO₃. Органическую фазу отделяют, а водную фазу экстрагируют за два раза с 20 мл CH₂Cl₂.

Получаемую органическую фазу сушат на Na₂SO₄, затем растворители выпаривают. Сырой продукт подвергают хроматографии на колонке с оксидом алюминия, используя CH₂Cl₂/CH₃OH (95/5) в качестве элюанта.

Выход 92%
MC: FAB 834 (M⁺).

Получаемый криптат натрия был преобразован в соответствующий криптат тербия по способу, описанному в примере 1. Этот криптат имеет следующие спектроскопические характеристики:
Ультрафиолетовое излучение видимой части в CH₃OH: 300 нм (максимум); 314 нм (плечо).

В Криптат редкоземельного элемента [бипиридин.бипиридин. (n-OCH₃-n-OCH₂CH₂ NH₂ дифенилбипиридин)]
Действуя по способу, описанному в пункте Ж примера 1, получают криптат редкоземельного элемента нижеуказанного соединения.

П р и м е р 3. Получение криптата европия [(бисбипиридин)бипиридиндиамидоэтиленамин)] (Способ А).

Соединение формулы I: Z NH₂; Y -CH₂-CH₂-;
Макроцикл бипиридина, а R' водород.

А получение криптата натрия [(бис-бипиридин)бипиридин диэфир]
Соединение формулы 1, в которой R₁ CH₃.

Смесь 0,300 г (7,6110^-4 моль) макроцикла бисбипиридина и 1,10 г (10,410^-3 моль) Na₂CO₃ нагревают с обратным холодильником в течение 30 мин в 450 мл CH₃CN. Раствор 0,350 г (7,6410^-4 моль) 6,6'-диброметил-6,6'(n-4,4'-диметоксикарбонил)-2,2'-бипиридина (соединение I; X Br) в 375 мл CH₃CN добавляют затем при активном перемешивании в течение 60 мин.

Реакционную смесь перемешивают в течение 18 ч с обратным холодильником, затем охлаждают до температуры окружающей среды и фильтруют. Растворитель удаляют в вакууме во вращающемся выпаренном аппарате.

Получаемую твердую фракцию растворяют в CHCl₃ и подвергают хроматографии на колонке оксида алюминия (с небольшим количеством оксида кремния в верхней части) посредством элюирования с CHCl₃/CH₃OH (98/2). Растворители удаляют в вакууме и получают целевой комплекс 0,230 г (38%). Он имеет следующие физико-химические характеристики:
плавление > 240^oC
1H-ЯМР (CD₃OD): 3,89 (C,8H,CH₂-бипиридин), 3,98 (С,4Н, CH₂-бипиридинэфир); 4,03 (с, 6H,COOCH₃); 7,42 (д, J 7,4 Гц, 4Н-бипиридин); 7,92 (m, J 7,4 Гц, 4Н-бипиридин); 7,96 (д, J 1,2 Гц, 2Н-бипиридинэфир); 8,10 (д, J 7,4 Гц, 4Н-бипиридин); 8,60 (д, J 1,2 Гц, 2Н-бипиридинэфир).

¹³C-ЯМР (CDCl₃): 52,9; 59,5; 119,7; 120,4; 123,4; 124,1; 138,2; 139,7; 155,2; 158,3; 160,4; 164,9;
Вычислено,C55,49; H 4,89;N 12,94.

C₄₀H₃₄N₈O₄NaBr4H₂O (865,71);
Найдено, C 55,44; H 4,33; N 13,10.

Б Аминолиз указанного криптата.

Полученный криптат (0,100 г; 1,2610^-4 моль) подвергают аминолизу, добавляя его по частям в 4 мл этилендиамина, перегнанного с KOH, предварительно нагретого до 90^oC. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч, затем охлаждают до температуры окружающей среды.

Избыток этилендиамина удаляют затем в вакууме и получают масло. Это последнее поглощают 2 мл смеси CHCl₃/CH₃OH (2/1), которую в свою очередь удаляют в вакууме. Очистку повторяют 5 раз и при этом получают ожидаемый комплекс с выходом 89%
В. Преобразование указанного криптата в соответствующий криптат европия.

Действуя по способу, описанному на стадии 3 примера 1, получают криптат европия [(бис-бипиридин)(бипиридин-ди(амидоэтиленамина))] который имеет следующие спектроскопические характеристики.

Ультрафиолетовое излучение видимой части в H₂O 240 нм, 303 нм (максимум).

П р и м е р 4. Получение криптата европия [(бис-бипиридин)-(бипиридин-ди)амидоэтиленамина))] (Способ А).

Соединение формулы 1: Z NH₂; Y -CH₂-CH₂-; R' H
является макроциклом бипиридина.

А Получение криптата европия [(бис-бипиридин)-бипиридиндиэфир)]
Криптат натрия, получаемый в пункте А предыдущего примера (0,10 ммоль), растворяют в 8 мл CHCl₃ и добавляют к раствору Eu Cl₃, 6H₂O (0,15 ммоль) в 40 мл CH₃OH. Раствор перемешивают с обратным холодильником в атмосфере азота до исчезновения криптата натрия (хроматография на колонке оксид алюминия, элюант; CH₂Cl₂, CH₃OH (90/10)).

Продолжительность реакции порядка 48 ч. Реакционную смесь охлаждают до температуры окружающей среды и фильтруют, если имеется помутнение. Растворители удаляют во вращающемся выпарном аппарате, а остаток повторно растворяют в 20 25 мл CH₃OH.

Этиловый эфир добавляют по каплям до устойчивого очень слабого помутнения. Криптат европия кристаллизуют таким образом при температуре окружающей среды. Удаляют растворители пипеткой, а криптат высушивают.

Выход: около 40% (первая кристаллизация). Фильтрат концентрируется сухим способом, а операция повторяется.

Получаемый продукт имеет следующие физико-химические характеристики:
1Н-ЯМР (D₂O эталон-трет Бу OH): 10,51 (2H,c,CH (бипиридинэфир), 8,66 (2Н, c, СН-бипиридинидиэфир), 8,06 (4H,т,CH-бипиридин), 7,08 (4Н,д,CH-бипиридин), 6,74 (4Н,д,СН-бипиридин), 4,66 (6Н,с,OCH₃), 0,9 (8H,c, CH₂-бипиридин), 0,78 (4Н,с,CH₂-бипиридиндиэфир).

Вычислено,C44,13; H 3,98;N 10,29.

C₄₀H₃₄N₈O₄EuCl₃NaCl, 9/2 H₂O (1088,58)
Найдено, C 43,93; H 3,79; N 9,88.

C 44,06; H 3,70; N 10,03.

Б Аминолиз криптата европия.

Полученный криптат европия (40 мг) добавляют частями к 40 мл этилендиамина, предварительно отогнанного с KOH. Прозрачный раствор перемешивают 3 ч в атмосфере азота при температуре окружающей среды. Этилендиамин удаляют в вакууме во вращающемся выпарном аппарате. Остаток поглощают несколькими миллилитрами CH₂Cl₂/MeOH (2/1), а растворители удаляют в вакууме. Операцию повторяют 5 раз для получения твердого соединения.

Полученный криптат просушивают 24 ч в вакууме лопастного насоса.

Т.плавления 168 170^oC.

Этот криптат европия имеет такие же характеристики, что и криптат европия, полученный в предыдущем примере. Эти два примера показывают, что возможно проводить комплексование криптата щелочного иона ионом редкоземельного элемента до или после замещения.

Пример 5. Получение криптата европия или тербия [(22)бипиридин-ди-(амидоэтиленамина)]
Соединение формулы I -макроцикл (22);
Z NH₂; Y -CH₂-CH₂.

А Получение криптата натрия [(22)бипиридиндиэфир]
Смесь 0,114 г (4,3710^-4 моль) макроцикла (22) и 0,460 г (4,3410^-3 моля) Na₂CO₃ нагревают 30 мин с обратным холодильником в 130 мл CH₃CN. Раствор 0,200 г (4,3710^-4 моль) соединения I в 220 мл CH₃CN добавляют затем при сильном перемешивании в течение 60 мин. Реакционную смесь затем перемешивают в течение 15 ч с обратным холодильником, затем охлаждают до температуры окружающей среды и фильтруют. Растворитель удаляют в вакууме во вращающемся выпарном аппарате.

Полученную твердую фракцию растворяют в CH₂Cl₂ и очищают с помощью хроматографии на колонке с оксидом алюминия (с небольшим количеством оксида кремнезема в верхней части). Примесь вначале элюируют с помощью CH₂Cl₂.

Образовавшийся макроцикл затем элюируют CH₂Cl₂/CH₃OH (98/2). Растворители удаляют в вакууме и получают 0,135 г (61%) макробицикла.

Б. Получение криптата европия или тербия [(22)бипиридиндиэфир]
Действуя по способу, описанному в примере 1а, получают соответственно криптаты европия и тербия [(22)бипиридиндиэфир] которые имеют следующие спектроскопические характеристики:
криптат европия: ультрафиолетовое излучение видимой части CH₃OH, 242 нм и 342 нм (максимум),
криптат тербия: ультрафиолетовое излучение видимой части в CH₃OH 242 нм и 325 нм (максимум).

В. Получение криптата европия [(22) бипиридин(амидоэтиленамин)]
Получаемый криптат европия (0,100 г, 1,4310^-4 моль) добавляют по частям к 5 мл этилендиамина, перегнанного с KOH, предварительно нагретого до 90^oC. Реакционную смесь перемешивают 1 ч, затем охлаждают при температуре окружающей среды. Избыток этилендиамина удаляют в вакууме. Получают масло.

Это последнее поглощают 2 мл CHCl₃, который в свою очередь удаляют в вакууме. Очистку повторяют 3 раза и получают 93 мг (90%) криптата европия. Этот криптат имеет следующие спектроскопические характеристики.

Ультрафиолетовое излучение видимой части в H₂O.

240 и 315 нм (максимум).

Таким же образом можно подвергнуть аминолизу криптат тербия, получаемый в пункте Б.

П р и м е р 6. Получение криптата натрия [(бипиридиндикарбометокси)3]
(Способ Б).

Формула 7 R' R" OCH₃; является макроциклом биспиридина.

А.Синтез 4,4'-дикарбометокси-6,6'-диазидометрил-2,2'-бипиридина.

Смесь 4,4'-дикарбометокси-6,6'-дибромметил-2,2'-бипиридина (0,50 г, 1,1010^-3 моль) и NaN₃ (1,0 г, 15,410^-3 моль) нагревают с обратным холодильником в течение 36 ч в 15 мл тетрагидрофурана.

Реакционную смесь охлаждают при температуре окружающей среды, фильтруют на целите и концентрируют досуха. Остаток растворяют в CHCl₃ и подвергают хроматографии на колонке с оксидом кремния посредством элюации с CHCl₃.

Выпаривание растворителя приводит к получению 0,40 г (95%) целевого соединения, которое имеет следующие физико-химические характеристики.

Т.пл. 168 170^oC
1Н-ЯМР (CDCl₃): 4,02 (с,6Н,COOCH₃); 4,63 (c,4H,CH₂-H₃); 7,94 (д, J 1,3 Гц, 2Н); 8,96 (д, J 1,3 Гц, 2Н);
¹³C-ЯМР (CDCl₃): 52,7; 55,1; 120,0; 121,5; 139,7; 156,0; 156,8; 165,3;
ИК (KBr): 1715 см^-1 (эфир), 2090 см^-1 (азид).

M.C. 383 (MH⁺).

Вычислено,C 50,27,H 33,69,N 29,31.

C₆H₁₄N₈O₄ (382,34).

Найдено, C 50,37, H 3,51, N 27,69.

Б.Синтез 4,4'-дикарбометокси-6,6'-диаминометил-2,2'-бипиридина.

(Соединение 5).

Смесь соединения, полученного на стадии А (0,126 г, 3,3010^-4 моль) и 12,6 мг 10% Pd/C в 38 мл CH₂Cl₂/CH₃OH (2/1) перемешивают при температуре окружающей среды в атмосфере водорода в течение 12 ч.

Реакционную смесь фильтруют на целите и после выпаривания растворителей получают 0,100 г (92%) целевого соединения, которое используется без очистки на следующей стадии.

В.Синтез криптата натрия (бипиридин-дикарбометокси)3.

(Соединение 7).

Смесь соединения 6 (R' OCH₃; X Br) (0,280 г, 6,1110^-4 моль) и Na₂CO₃ (0,65 г, 6,1310^-3 моль) нагревают с обратным холодильником в 500 мл CH₃CN.

Затем добавляют 0,100 г (3,0310^-4 моль) соединения 5, а реакционную смесь перемешивают с обратным холодильником в течение 48 ч. Реакционную смесь охлаждают до температуры окружающей среды и фильтруют. Растворитель удаляют в вакууме.

Остаток поглощают CHCl₃ и подвергают хроматографии на колонке с оксидом алюминия (с небольшим количеством оксида кремния в верхней части), осуществляя элюацию с CHCl₃/MeOH (98/2). Выпаривание растворителей приводит к 0,132 г (40%) макробицикла 7 (R" R' OCH₃).

Т.пл. > 250^oC.

1Н-ЯМР (CDCl₃): 4,02 (c, 18H, COOCH₃); 4,08 (c, 12H, CH₂); 7,96 (д, J 1,2 Гц, 6Н); 8,49 (д, J 1,2 Гц, 6Н).

¹³C-ЯМР (CDCl₃): 53,2; 59,2; 120,0; 123,8; 139,9; 155,6; 159,9; 164,8;
Вычислено,C 53,59;H 4,48;N 10,38.

C₄₈H₄₂N₈O₁₂, NaBr, 3H₂O (1079,84).

Найдено, C 53,40; H 4,40; N 9,75.

Полученный криптат может подвергаться аминолизу с этилендиамином по описанному в предыдущих примерах способу. Обычно получают смесь моно-, ди- до гексазамещенных криптатов, замещенных группой CO-NH-CH₂-NH₂; Эти соединения могут разделяться обычными средствами.

Пример 7. Получение криптата европия [бис(бипиридиндикарбоксибутокси), бипиридин-диамидоэтиленамина]
Формула I Y -CH₂-CH₂-; Z NH₂; является макроциклом бис-бипиридина, R' трет.Бу.

А. Получение криптата натрия [бис(бипиридиндикарбоксибутокси), бипиридиндикарбоксиметокси]
Действуя по способу, описанному в примере 6, используя соединение 5, получаемое на стадии Б этого примера, и соединение 6 (R' COO (трет.-C₄H₉); X Br), получают криптат натрия формулы 7 (R' COO (трет.-C₄H₉); R" COOCH₃), имеющей следующие физико-химические характеристики.

Т.пл. > 220^oC.

1Н-ЯМР (CDCl₃): 1,60 (с, 36Н, COOБу⁺); 3,99; 4,02; 4,06, (3c, 18H, CH₂бпи ди COO Me + CH₂бпи ди COO Бу⁺, + - COOCH₃); 7,81 (c, 4H, бпи ди COO Бу⁺); 7,95 (с, 2Н, бпи ди COO Me; 8,36 (c, 4H, бпи ди COO Бу⁺); 8,45 (c, 2H, бпи ди COO Me).

¹³С-ЯМР (CDCl₃): 28,0; 53,1; 59,1; 83,4; 119,8; 119,9; 123,4; 123,7; 139,8; 141,7;
Вычислено,C 57,73;H 5,81;N 8,98.

C₆₀H₆₆N₈O₁₂. NaBr, 3H₂O (1248,18).

Найдено, C 57,99; H 5,31; N 9,03.

Этот криптат натрия затем преобразуют в соответствующий криптата европия по описанному способу.

Затем его подвергают аминолизу с этилендиамином.

Возможно вначале подвергнуть аминолизу соединение 7, а затем преобразовать полученный криптат натрия в соответствующий криптат европия по описанным способам.

Применение соединений в качестве флуоресцентных маркеров.

Как указано выше, соединения по изобретению подходят в качестве реагентов для маркировки биологических веществ, которая осуществляется путем сочетания соединения по изобретению с помощью ковалентной связи с биологическим веществом, подлежащим анализу и обнаружению.

Это сочетание может быть выполнено классическими методами сочетания, используемыми в этой области, такими, как например, методом с S MCC/S PDP или с карбодиимидом (см.труд Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Practise and Theory on Enzym and Immunoassays P.Tijssen, Elsivier 1 ed.1985).

Криптаты по изобретению подходят в качестве флуоресцентных маркеров во всех типах определения или обнаружения биологических веществ и, в частности, в методах количественного анализа по конкуренции или избытку, в однородной или неоднородной фазе, хорошо известных специалисту и описанных, в частности, Ландоном Аип. Clin.Bioche. 1981, 18, p.253 С уани Clin.Chem. 25, 353, 1979.

Они могут также использоваться в однородном способе обнаружения и/или определения посредством люминесценции, описанном в международной заявке WO 87/00927.

Биологические вещества, подлежащие обнаружению или определению, могут быть, например, антителами, антигенами, токсинами, энзимами, протеинами, гормонами, рецепторами гормонов, стероидами, випином, биотином, стрептадизином, микроорганизмами, гаптенами, нуклеиновыми кислотами, фрагментами дезоксирибонуклеиновой кислоты и рибонуклеиновой кислоты, липидами, углеводами и т.д. Примеры таких веществ приведены в описании заявки на патент ЕР 17098, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.

Использование соединений по изобретению в качестве флуоресцентных маркеров показано с помощью пяти приводимых ниже испытаний:
В испытаниях А, Г и Д использовали реактивы СПДП и сульфо-СМЦК, которые являются соответственно: "N-сукцинимидил-3-(2-пиридинтио)пропианат" и "сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циколгексан-1 -карбоксилат".

Испытание А: образование сопряженной пары антитело-криптат посредством СМЦК/СПДП.

1.Активация криптата европия, полученного по примеру 3.

К 500 мкл раствора этого криптата с концентрацией 1,5 мг/мл в фосфатном буфере (20 ммоль, рН 7) добавляют 50 мкл сульфо-СМЦК 13,1 мг/мл в том же буфере.

Затем инкубируют в течение 30 мин при температуре окружающей среды и перемешивают насосом в течение 5 мин. Центрифугируют раствор для удаления осадка. Очищают пропусканием на ионообменной колонке Pharmacia Моно Q с образованием градиента между:
Буфер А: фосфатный 20 ммоль рН 7 + 10% ДМФ.

Буфер Б: фосфатный 20 ммоль рН 7 + 10% ДМФ + 1 молярный NaCl.

Криптат обнаруживается измерением его абсорбции при 307 нм + 25000 М^-1 см^-1 при 307 нм).

Активированный криптат выходит в мертвый объем
Избыток сульфо-СМЦК элюируется в градиенте.

2.Активация антитела.

Используемое моноклональное антитело E₁ является антипролактиновым антителом, содержащимся в наборах для иммунорентгенометрического анализа пролактина, изготовляемых компанией Орис Индюстри и известных под названием "EZSA PROZ".

К 1,2 мл раствора антитела Е₁ с концентрацией 14,8 мг/мл в фосфатном буфере (50 ммоль, 150 ммоль NaCl, рН 7,1) добавляют 30 мкм раствора СПДП 30 ммоль в абсолютном этаноле.

Выдерживают при температуре окружающей среды в течение 30 мин с перемешиванием.

Раствор пропускается на колонке из геля G25 Pharmacia, уравновешенной тем же фосфатным буфером e 210000 М^-1 см^-1 при 280 нм).

Извлекают элюированную фракцию из мертвого объема.

Добавляют 60 мкл раствора, содержащего 400 ммоль ДТТ (дитиотреитол) в фосфатном буфере.

Инкубируют 15 мин при температуре окружающей среды с перемешиванием и извлекают фракцию, выходящую из мертвого объема после пропускания на колонке G25, уравновешенной фосфатным буфером.

Сочетание активированного антитела и активированного криптата.

К 60 мкл активированного антитела (2,6 мг/мл) в фосфатном буфере добавляют 50 мкл криптата (200 мкмоль/л).

Инкубируют 12 ч при температуре окружающей среды и центрифугируют. Всплывший продукт подвергается диализу с фосфатным буфером 50 ммоль, рН 7,4.

Испытание Б. Образование сопряженной пары антитело-криптат посредством карбодиимида.

Сукцинилирование антитела.

Добавляют за три раза 83 мкл раствора, содержащего 50 мг/мл янтарного ангидрида в 1/3 ДМСО, 2/3 бората 100 ммоль, рН 9 и 440 мкл антитела Е₁ (9,4 мг/мл) в борате 100 ммоль рН 9, погруженного в плавящийся лед.

рН поддерживается равным 9 с помощью щелочи натрия. Реакцию проводят за 30 мин при 0^oC.

Очистка.

Она осуществляет с помощью хроматографии высокого давления на колонке геля фильтрации TSK 3000SU, причем элюант является фосфатным буфером 50 ммоль рН 7,4. Расход 1 мл/мин.

Извлекают антитело после сукцинилирования в объеме 3 мл. Концентрируют до получения 370 мкл.

Сочетание сукцинилированное антитело/криптат.

Раствор 1: смешивают 25,5 мг карбодиимида в 1335 мкл фосфатного буфера (50 ммоль рН 7,4).

Раствор 2: 50 мг/мл сульфо-N-гидроксисукцинимида в таком же буфере (14,7 мл в 222,7 мкл).

Раствор 3: 0,95 мг/мл криптата по примеру 3 в таком же буфере.

Проводят реакцию 1 ч при температуре окружающей среды:
175 мкл раствора сукцинилированного антитела;
480 мкл раствора 3;
72,5 мкл раствора 1;
10 мкл раствора 2.

После полного диализа с фосфатным буфером (50 ммоль рН 7,4) продукт концентрируется на конусе Амикона. Получают сопряженный продукт с концентрацией 0,86 мг/мл.

Продукт замораживается в буфере с 1 мг/мл белковой человеческой сыворотки (ВЧС).

Результаты. Анализ пролактина.

Применяют реактивы набора для анализа пролактина EZSA-PROL.

В каждую колбу, содержащую твердую фазу Эльса, добавляют 100 мкл стандартного образца; 300 мкл сопряженного продукта E₁-криптат, полученного в испытания А или Б в фосфатном буфере (50 ммоль рН 7,4) и ВЧС 1 мг/мл. Выдерживают в течение 3 ч при 37^oC. Промывают твердую фазу 2 раза 3 мл H₂O. Добавляют 400 мкл буфера, содержащего 5 ммоль в додецилсульфате натрия (СДН). Отбирают 300 мкл этого раствора для измерения флуоресценции на приборе ARCUS ZKB.

Полученные результаты нанесены на фиг.1. На фиг.1 нанесли по ординате интенсивность флуоресценции, а по абсциссе количество пролактина в мкед./мл.

Результаты показывают, что криптаты по изобретению подходят в качестве флуоресцентных маркеров при иммунологическом анализе.

В приведенном испытании В показывают использование криптатов по изобретению в аналогичном способе по международной заявке WO 87/00927.

Испытание В. Анализ пролактина.

1.Количественный анализ пролактина проводят аналогичным методом.

А. Фиксация кода на антителе.

Маркируют моноклональное антитело антипролактина G₂ реактивом Вуда [описанным в Anal.Biochem. 69, 339 349 (1975)] 2,93 мг реактива Вуда растворяют в 400 мкл 0,5 н. щелочи натрия. Добавляют 400 мкл карбонатного буфера (200 ммоль, рН 9,3). Добавляют к этому раствору 200 мкл антитела G2 (10 мг/мл) в карбонатном буфере 100 ммоль, рН 9,3 и выдерживают в течение 17 ч при 30^oC. Очищают на колонке Pharmacia PD10 с карбонатным буфером 100 ммоль, рН 9,3.

Элюированные из мертвого объема фракции собирают; сопряженный продукт характеризуется отношением оптической плотности при 320 и 280 нм
.

Его концентрация оценивается, допуская, что 90% антител извлекаются. Сопряженное соединение аликвотируется и сохраняется при 20^oC.

Б. Количественный анализ пролактина (кривая А).

Используют стандартные растворы пролактина с концентрацией 0, 15, 30, 60 и 150 нг/мл. Анализ осуществляется в образцах из 12 каналов EFZAB, N каталога 9602107.

Добавляют последовательно: 100 мкл стандартного раствора; 100 мкл антитела G2 Вуд с концентрацией 5 мкг/мл; 100 мкл сопряженного соединения Е₁ из испытания А с концентрацией 0,375 мкг/мл; инкубируют 15 мин при температуре окружающей среды; снимают показания прибора ARCUS; вычерчивают стандартную кривую, нанося значение F в зависимости от значения стандартов (фиг.2)

Флуоресценция стандарта О.

1. Анализ пролактина посредством рентгеноиммунометрии (кривая В).

Используют набор ELSA-PRL (компания Орис). В колбу ELSA добавляют: 300 мкл радиоактивного индикатора, 100 мкл стандартного раствора, после перемешивания инкубируют 3 ч при 37^oC, 2 колбы промывают водой за 2 раза, 2 колбы подсчитывают на счетчике, наносят значение B/T для каждого стандартного раствора (фиг. 2), причем B радиоактивность стандартного раствора; Т радиоактивность для 300 мкл радиоактивного индикатора.

Полученные результаты (фиг. 2) показывают, что криптаты по изобретению подходят в качестве маркеров в способе по международной заявке WO 87/00927.

С другой стороны можно отметить, что благодаря криптатам по изобретению этот однородный способ особенно удобен по сравнению с аналитическим способом, использующим радиоактивный элемент, который требует гораздо более длительного времени инкубирования, стадии промывки и операций с радиоактивными элементами.

Испытание Г. Образование сопряженного соединения ДНК-криптат с помощью СМЦК/СПДП.

1. Функционализация ДНК в ДНК-NH₂,
Модифицированный нуклеотид, 5-амино(12)дУТР (продукт, продаваемый Калбиохем) вводится в ДНК методом ник-трансляции по способу Калбиохем. Аминированная ДНК затем очищается тремя последовательными промывками на фильтре "Центрикон" (продаваемый Амикон) с фосфатным буфером 10 ммоль, рН 7,4.

2.Сочетание ДНК-NH₂ с СПДП.

55 мкл раствора, содержащего 9 мкг ДНК-NH₂ (измеренный посредством ультрафиолетового излучения), в обратном буфере (0,1 моль, рН 9,0) добавляют к 5 мкл раствора СПДП (20 ммоль). Реакция длится 4 ч при 45^oC.

Непрореагировавший СПДП удаляют тремя промывками на "Центриконе" с фосфатным буфером (50 ммоль, рН 7,0).

3.Снятие защиты ДНК-СПДП и сочетание с криптатом.

90 мкл раствора 6 мкг (оценивается по оптической плотности) ДНК-СПДП в фосфатном буфере (50 моль, рН 7,0) обрабатывают непосредственно перед сочетанием с помощью 10 мкл раствора 10 ммоль ДТТ в том же буфере.

Снятие защиты длится 20 мин при температуре окружающей среды. ДТТ ингибитор последующего сочетания удаляется тремя промывками на "Центриконе" с упомянутым фосфатным буфером. Раствор ДНК-SH концентрируют на "Центриконе" до конечного объема 90 мкл.

К 90 мкл раствора ДНК-SH добавляют 50 мкл криптата европия из примера 3, активированного СМЦК на стадии 1 испытания А (14 ммоль) фосфатном буфере (20 ммоль, рН 7,0), содержащем 10% ДМФ.

Сочетание происходит при 30^oC в течение 1 ч. Сопряженное соединение ДНК-криптат очищают тремя последовательными осаждениями в этаноле. Степень сочетания оценивается измерением абсорбции при 260 нм и флуоресценции при 620 нм.

4. Зонд ДНК, связанный таким образом с криптатом, может использоваться для обнаружения и анализа последовательностей комплементарной нуклеиновой кислоты в соответствии с одной из стратегий, описанных в журнале Дж. Маттиус и др. "Аналитикал Биокемистри" 169, 1 25 (1988) под названием "Аналитические стратегии при использовании зондов ДНК".

Испытание Д. Образование ковалентного сопряженного соединения стрептавидин-криптат.

1.Сочетание стрептавидин-СПДП.

20 мкл раствора 20 ммоль СПДП в карбонатном буфере (0,5 ммоль, рН 9,5) добавляются к 180 мкл раствора, содержащего 1 мг стрептавидина в том же буфере.

Реакция длится 1 ч при температуре окружающей среды. Избыток СПДП удаляется за четыре последовательных промывки на "Центриконе" с фосфатным буфером (0,1 моль, рН 7,4).

2.Снятие защиты со стрептавидин-СПДП и сочетание с криптатом.

К 360 мкл раствора стрептавидина-СПДП (около 1 мг) в фосфате (0,1 моль, рН 7,4) добавляют 40 мкл ДТТ 100 ммоль в том же буфере.

Реакция длится 15 мин при температуре окружающей среды с перемешиванием, затем реакционную смесь промывают три раза на "Центриконе" с предыдущим буфером.

Стрептавидин-SH (около 1 мг) в 625 мкл фосфатного буфера 0,1 моль, рН 7,4, сочетают с 43 мкг криптата европия из примера 3, активированного СМЦК согласно стадии 1 испытания А в 175 мкл фосфатного буфера (20 ммоль, рН 7) с 10% ДМФ. Сочетание длится 2 ч 30 мин при температуре окружающей среды. Непрореагировавший криптат-СМЦК удаляют за четыре промывки на "Центриконе" с фосфатным буфером (0,1 моль, рН 7,4).

Степень сочетания оценивается измерением абсорбции при 280 нм и флуоресценции при 620 нм.

Сопряженный продукт очищают гель-фильтрацией на колонке TSRG3000SW с помощью буфера NaCl 1 М, ТФА 0,1% Замер осуществляют по показателю абсорбции при 280 нм и флуоресценции при 620 нм.

3. Соединение стрептавидин-криптат может использоваться в качестве флуоресцентного маркера биотинилированных молекул (нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, антитела, антигены, гептены или другие биологические вещества), к которым они имеют большое сродство.

Формула изобретения

1. Криптаты редкоземельных металлов, состоящие по меньшей мере из одной соли европия или тербия в виде комплекса с макрополициклическим соединением, соответствующим общей формуле I

или общей формуле II

в которых цикл формулы

означает один из следующих циклов:

где n 0 или 1,

(макроцикл бис-бипиридин),
где Y линейный или разветвленный алкилен C₁ C₄;
Z группа -NH₂;
R группа метил или группа -Y-Z;
R' водород или группа -COOR", где R" алкил С₁ C₄, предпочтительно метил, этил или трет-бутил,
полученные ионообменом соли щелочного металла соответствующего макрополициклического соединения общей формулы I или II с солью европия или тербия при нагревании в растворе метанола, при необходимости в присутствии хлороформа, в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул.

2. Криптаты по п.1 формулы I, где Y -CH₂-CH₂-.

3. Криптаты по пп.1 и 2, где

означает бис-бипиридиновый макроцикл.

4. Криптаты по п.1 общей формулы II, где Y CH₂-CH₂, R - CH₃.

5. Криптаты по п. 1 общей формулы I, где Y -CH₂-CH₂, R₁ COOR", где R" имеет значение, указанное в п.1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2