Штамм бактерий serratia marcescens, осуществляющий деградацию фенола и 2,4-дихлорфенола

 

Изобретение относится к микробиологии синтетических органических соединений и касается микробиологического разрушения фенола и 2,4-дихлорфенола. Цель изобретения - повышение эффективности биологической деградации фенола и его производных в сточных водах предприятий нефтехимического профиля, а также производства дубильных экстрактов. 1 ил., 3 табл.

Изобретение относится к микробиологии синтетических органических соединений и касается микробиологического разрушения фенола и 2,4-дихлорфенола.

Существуют микроорганизмы, способные осуществлять разложение фенола и его хлорированных производных. Такие штаммы представляют большой интерес для непосредственного использования в качестве деструкторов ксенобиотиков. Известны штамм, принимающие участие в биологической деградации фенола и 2,4-ДХФ Pseudomonas sp. Arthrobacter sp. Acinetobacter sp. Bacillus sp. Pseudomonas purida. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является штамм Pseudomonas putida [3] Недостатком известных штаммов является то, что для всех штаммов не установлена эффективность деградации фенола, достигаемая в результате культивирования штаммов в жидких солевых средах, в сточных водах нефтехимического производства и стоках производства дубильных экстрактов. Оцениваемый эффект касается скорости минерализации ксенобиотиков.

Штамм Serratia marcescens получен путем селекции из культуры Serratia marcescens B-1248.

Цель изобретения получение нового штамма, осуществляющего эффективную биологическую деградацию фенола и 2,4-ДХФ.

Штамм характеризуется следующими физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Грамположительные подвижные палочки. На мясо-пептонном агаре культура образует красные колонки, окраска которых обусловлена присутствием пигмента продигиозина.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб. Температурный оптимум +30^oC до +37^oC, клетки растут. Оптимум рН нейтральный или слегка щелочной: 7-8. Оценка роста штамма в среде с различным значением рН приведена в табл.1.

Клетки каталазоположительны. Штамм гидролизует желатину. Реакция Фогес-Проскауэра положительна. Штамм осуществляет декарбоксилирование лизина. Способен восстанавливать нитрат. Штамм не активен в отношении мочевины, пектата, аргинина, орнитина. В качестве источника питания использует мальтозу, маннит, сахарозу, цитрат, глюконат. Не использует арабинозу, лактозу, фенилаланин, малонат.

Тест с метиловым красным отрицательный. Штамм устойчив к ампициллину, хлорамфениколу, тетрациклину.

Штамм идентифицирован по Определителю Берги (8-е издание) как штамм вида Serratia marcescens.

Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии. Проверка жизнеспособности штамма проводится высевом на мясо-пептонный агар 1 раз в 12 мес.

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Serratia marcescens.

Пример 1. В примере 1 приведены данные по использованию фенола и 2,4-ДХФ штаммом Serratia mercescens в качестве единственного источника углерода и энергии.

Посевной материал получали выращиванием штамма в пробирках в мясо-пептонном бульоне при +30^oC. Полученный посевной материал засевали в количестве 0,01 от объема в жидкую солевую среду следующего состава, г/л: KH₂PO₄ 0,5; MgSO₄ 7H₂O 0,5; (NH₄)₂SO₄ 2,64; pH 7,0-7,2.

В данную солевую среду вносили отдельно фенол и 2,4-ДХФ в качестве единственного источника углерода и энергии до конечной концентрации 100 мг/г. Инкубацию культуры проводили при +30^oC в течение 12 сут в условиях аэрации в термостатированных установках УВМТ-12-250 при 115 об/мин.

На чертеже представлены графики изменения оптической плотности клеточной суспензии (OD₅₉₀) в процессе роста периодических культур штамма Serratia marcescens в жидких солевых средах с добавлением фенола и 2,4-ДХФ.

Из чертежа следует, что для штамма Serratia marcescens в условиях роста на минимальной солевой среде с добавлением фенола в периодической культуре наблюдалось существенное изменение оптической плотности клеточной суспензии, начиная с 1-х сут культивирования. Наибольшей плотности культура достигала к 7 сут культивирования и затем заканчивала свой рост. На среде с 2,4-ДХФ наблюдалось постепенное изменение плотности клеточной суспензии. Максимальное значение плотности клеточной суспензии было отмечено на 9 сут инкубации, после 10-х сут культура заканчивала свой рост.

Пример 2. Проводили определение содержания фенола и его производных в среде в процессе культивирования штамма в описанных выше условиях. Отбор проб проводили на 2, 5, 7, 9 сут инкубации штамма. Из проб удаляли клетки микроорганизмов центрифугированием проб при 5 тыс. об/мин в течение 15 мин.

Определение фенолов проводили с использованием стандартного фотометрического метода [4] Для этого к 5 мл пробы последовательно добавляли следующие растворы: 30 мкл 2% р-ра 4-аминоантипирина 100 мкл 2 н. р-ра аммиака 100 мкл 2 р-ра калия железосинеродистого.

Смесь перемешивали после добавления каждого компонента реакции и через 10 мин измеряли коэффициент пропускания на фотоэлектрическом концентрированном колориметре КФК-2 при длине волны 540 нм и чувствительности равной 2. Для каждого опыта коэффициент пропускания определяли как среднее арифметическое из 3-х измерений. Количество фенолов определяли по градуировочному графику, построенному в стандартных условиях определения.

Из данных табл. 2 видно, что в процессе инкубации штамма Serratia marcescens наблюдалось уменьшение концентрации фенола и 2,4-ДХФ в среде культивирования.

В результате анализов установлено, что содержание фенола от начальной концентрации 100 мг/л уменьшалось на 2-е сут культивирования на 20 на пятые сут на 46 на седьмые сут на 62 и на девятые сут на 80 Далее измерение концентрации фенола не проводили, так как культура заканчивала свой рост, как следует из чертежа. Уменьшение концентрации 2,4-ДХФ от начальной концентрации 100 мг/л составляло на двое сут культивирования 25 на пятые сут на 30 на седьмые сут на 44 на девятые сут на 60 Из этих данных следует, что предлагаемый штамм Serratia marcescens осуществляет деградацию фенола и 2,4-ДХФ в жидкой среде.

Пример 3. Пример 3 демонстрирует результаты применения штамма Serratia marcescens для очистки сточных вод нефтехимического производства и производства дубильных экстрактов.

Для исследований использовали сточную воду нефтехимического производства, в которой, согласно анализам технологического регламента производства, содержалось 0,09 мг/л фенолов, рН 6,6 7,0 и сточную воду производства дубильных экстрактов, содержащую согласно анализам технологического производства 0,75 мг/л фенолов, рН 6,5 7,0.

Для проведения микробиологической очистки сточных вод от фенолов в несколько колб объемом 250 мл вносили 100 мл сточной воды. Колбы засевали 3 от объема сточной воды посевным материалом содержащим 10⁷ кл/мл штамма Serratia marcescens. Наращивание биомассы проводили в гермостатированных установках УВМТ-12-250 при 155 об/мин при +30^oC в течение 1 7 сут.

В отобранных на определенные сутки культивирования пробах сточных вод определяли содержание фенолов. Для определения использовали стандартную методику фотоколориметрического определения фенолов согласно методического руководства по анализу сточных вод нефтеперерабатывающих и нефтехимических заводов [5] После отбора пробы сточных вод консервировали для предотвращения окисления фенолов. Для этого в колбу с пробой сточной воды добавляли едкий натр из расчета 5 мл 50 едкого натра на 1 л пробы. Затем помещали необходимый объем анализируемой сточной воды в перегонную колбу, добавляли 10 раствор сернокислой меди (1 мл на 100 мл) и подкисляли разбавленной серной кислотой. После этого из проб отгоняли фенолы в перегонном аппарате. Ход определения фенолов меняли в зависимости от концентрации фенолов в полученном отгоне. При концентрации фенолов больше 0,4 мг/л фотоколориметрированию подвергали водные растворы после реакции с 4-аминоантипирином в присутствии калия железосинеродистого. При содержании фенолов меньше 0,4 мг/л соединения извлекали экстрагирующей смесью хлороформ -изоамиловый спирт и фотоколориметрированию подвергали окрашенные растворы экстракта после реакции с 4-аминоантипирином в присутствии калия железосинеродистого. Оптическую плотность окрашенных растворов определяли на фотоэлектроколориметре КФ-2. Содержание фенола в анализируемой пробе находили по калибровочной кривой, которую строили по значениям оптической плотности экстрактов стандартных образцов.

Определяли степень очистки сточной воды в процентах к контролю. В качестве контроля использовали показатель содержания фенолов до инкубации проб с микроорганизмами (0 сут). Контроль принимали за 100 Как видно из приведенных в табл. 3 данных, предлагаемая культура Serratia marcescens активна в реальных стоках нефтехимического производства. Степень биологической очистки от фенола после одних суток инкубации составляет 63,5 после 3 сут 75,7 после 7 сут 88,6 Культура активна также в стоках производства дубильных экстрактов. Степень очистки после 3 сут культивирования составляет 87,3 Преимущества штамма Serratia marcescens, который осуществляет деградацию фенола и 2,4-дихлорфенола. Это свойство штамма определяет возможность использования его для очистки загрязненных жидких сред, если загрязнителем является указанные выше соединения.

При использовании штамма Serratia marcescens для очистки сточных вод от фенолов в течение 3 сут степень очистки сточных вод нефтехимического производства составляет 75,7 производства дубильных экстрактов 87,3

Формула изобретения

Штамм бактерий Serratia marcescens ВКПМ В-6493, осуществляющий деградацию фенола и 2,4-дихлорфенола.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2