Анти-сенс олигонуклеотидные последовательности против рнк, тнф альфа

 

Использование: в качестве анти-сенс последовательности против развития эндотоксического инфекционного шока. Сущность изобретения: продукт: 5' - 3' (альфа)' TCA TGG TGT CCT TTG CAG - X 1 - 18 где Х - Н, или олигонуклеотидная последовательность от 1 до 17 нуклеотидов в свободной форме или в форме тиолата.

Предметом настоящего изобретения являются новые олигонуклеотидные последовательности против мРНК, ТНФ альфа.

Известно, что ТНФ (Tumor Necrosis Factor) секретируется макрофагами и вызывает метаболические нарушения, приводящие к развитию эндотоксического инфекционного шока. Для того, чтобы заблокировать продукцию ТНФ, заявитель изучал олигонуклеотидные анти-сенс последовательности против мРНК ТНФ альфа, которые способны блокировать синтез ТНФ.

Изучая различные последовательности, заявитель обнаружил, что определенная олигонуклеотидная последовательность обладает этим свойством.

Таким образом, предметом данного изобретения является разработка новых анти-сенс олигонуклеодитов против мРНК. ТНФ альфа, имеющих следующую нуклеотидную последовательность (1): где Х представляет либо атом водорода, либо последовательность нуклеотидов длиной от 1 до 17 нуклеотидов в свободной форме, алкильной или сульфидной форме, либо в форме производного поли L-лизина.

В общей формуле (1) и в последующих под последовательностью от 1 до 17 нуклеотидов обозначается любая последовательность, содержащая аденин и гуанин (пуриновые основания), цитозин и тимин (пиримидиновые основания), под алкильной формой подразумеваются алкильные производные фосфатного остатка, в частности метильные, этильные или пропильные группы. Эти группы присутствуют на всех или на части фосфатных остатков.

под сульфидной формой подразумеваются сульфидные производные фосфатной группы, главным образом тио- и дитиоаты. Эти группы присутствуют на всех или на части фосфатных остатков.

Среди продуктов согласно изобретению можно назвать олигонуклеотиды, соответствующие формуле (1), где Х представляет собой атом водорода или последовательность, полностью или частично представленную формулой (1).

_A в свободной форме, алкильной форме, сульфидной форме или в виде производного поли L-лизина.

Из последних предпочтение отдают олигонуклеотидным последовательностям, которые соответствуют формуле (1), где Х представляет собой атом водорода, последовательность -СС или последовательность, представленную формулой (1) в свободном виде, алкильной, сульфидной форме или в виде производного поли L-лизина и в особенности следующим последовательностям:
_A


Способ получения соединений формулы (1) заключается в том, что первый нуклеотид синтезируемой последовательности фиксируют в 3' положении на неподвижной фазе (носителе):

в которой S представляет неподвижную фазу, Z углеводородную группу, содержащую от 2 до 20 атомов углерода, В пуриновое или пиримидиновое основание с защищенной аминогруппой, соответствующее первому нуклеотиду, и R 5' защитная группа, затем деблокируют 5'-гидроксильную группу кислотным реагентом для получения следующего продукта:
₁
где обозначения S, Z и B имеют указанные выше значения, а этот продукт подвергают реакции со вторым нуклеотидом следующей формулы:
₁
где R имеет указанные значения, а В -пуриновое или пиримидиновое основание, соответствующее второму нуклеотиду с защищенной аминогруппой, R₂ алкильный радикал или группа OR₁' или SR₁', где R₁ защитная группа, R₁ также представляет собой защитную группу; и
получают продукт формулы:
₂
где S, R, R, B₁ и B₁ имеют уже указанные значения, затем производят окисление продукты (V) до получения следующей формулы:
₂
где S, R, R, B₁, B₁ и Z имеют уже указанные значения, а Х₂ представляет собой атом кислорода или серы, и далее, как указано выше, начиная с продукта (II), осуществляют новый цикл с продуктом (VI) и мономером нового нуклеотида до получения желаемой последовательности для получения конечного продукта.

₁
где S, R, R, B₁, B₁, X₂ и Z имеют уже указанные значения, а В₁ последний нуклеотид последовательности, затем удаляют защитную группу, продукт отделяют от неподвижной фазы и в результате получают очищенный продукт (I).

В оптимальных условиях описанный выше способ приготовления характеризуется следующими признаками:
освобождение 5'гидроксида продукта (II) осуществляют в присутствии такого кислотного реагента, как уксусная, ди- или трихлоруксусная кислота,
реакцию сочетания продукта (III) с продуктом (IV) осуществляют с помощью тетразола, растворенного в ацетонитриле,
окисление фосфитной группы продукта (V) в фосфатную продукта (VI) осуществляют с помощью йода, растворенного в следующей смеси: вода/лутидин/тетрагидрофуран или в смеси вода/пиридин/тетрагидрофуран,
окисление фосфитной группы продукта (V) для получения сульфидной формы (VI) осуществляют с помощью серы, растворенной в смеси сероуглерода, пиридина и безводного триэтиламина,
в конце синтеза снятие защиты с концевой 5'-гидроксильной группы осуществляют с помощью таких кислот как уксусная, ди- или трихлоруксусная кислота,
снятие защиты с олигонуклеотида (VII) осуществляют с помощью концентрированного раствора аммония при умеренном подогреве реакционной среды.

Для осуществления описываемого способа в основном используется автоматический синтезатор "Applied Biosystems Modele 381A".

При использовании описываемого способа неподвижная фаза S-твердая и может быть представлена двуокисью кремния или пористым стеклом. Можно также использовать неподвижные фазы, описанные в европейском патенте 0 208 599.

В соответствии с описываемым изобретением, Z представляет собой углеводородную группу -(СH_Z)₂, где n целое число от 2 до 20. Чаще всего используются соединения, в которых Z представлено радикалом (СН_n)₂.

В формулах (II)-(VII) основания В₂, B₁.B₂ представляют собой пуриновые или пиримидиновые основания, аминогруппы которых защищены. Защитные группы могут быть, например, бензольными или изобутирильными. В случае аденина или цитозина в основном используются бензольные группы. В случае гуанина в основном используются изобутирильные группы.

Защитной группой R для 5' гидроксильной группы может быть, например, трифенилметильная, монометокси-, диметокситрифенилметильная или пиксильная группы.

Защитная группа R₂' для гидроксилов фосфата может состоять, например, из метильной, цианоэтильной, орто- или парахлорофенильной групп. Предпочтение отдается цианоэтильной группе. Защитная группа R₁ может быть представлена таким алкильным радикалом как метил, этил, изопропил или радикалом морфолина или пиперидина. Предпочтение отдается использованию изопропильной группе.

При использовании описываемого способа непрореагировавшую фракцию промежуточного продукта (III) сразу же превращают в эфир во избежание ошибок в синтезируемой олигонуклеотидной последовательности при присоединении следующего нуклеотида. Такая каппинг-реакция происходит в основном с помощью ацетангидрида, растворенного в смеси диметилпиридин/тетрагидрофуран и катализируется диметиламинопиридином или метилимидазолом.

Олигонуклеотидные последовательности, производные поли L-лизина, могут быть приготовлены по способу, при котором вступает в реакцию вещество, изображенное формулой (VIII):
₂
где S, Z, R, R обозначены выше, с соединением формулы (IV) для получения соединения (IX):
₁
где S, R, Z, R, B₁ и B₁ обозначены выше, которые окисляют, отделяют продукт от неподвижной фазы и удаляют активирующую группу для получения соединения (X):
₂ (X)
где R, R, B₁ и B₁ обозначены выше, X₂ атом кислорода или серы, окисляют конечный рибозный остаток, затем полученный продукт подвергают реакции с L-лизином с восстанавливающей среде для получения соединения (XI):
₁
где R, R, B₁, B₁ и Х₂ обозначены выше, и затем продолжают синтез исходя из соединения (VI).

Произвольные поли L-лизина могут быть приготовлены по способу I.P.LEONETTI et coll. GENE 72 (1988) 323-332.

Новые олигонуклеотидные последовательности, получаемые по описываемому методу, обладают очень интересными фармакологическими свойствами: они, в частности, обладают способностью блокировать продуцирование клетками ТНФ- альфа за счет специфического комплементарного взаимодействия с последовательностью (166-185) мНРК-мишеней, которая перекрывает кодон AUG.

Эти свойства более подробно рассматриваются ниже в экспериментальной части.

Эти свойства служат основой для использования новых олигонуклеотидных последовательностей, описанных выше формулой (I), в качестве медикаментов.

В ряду медикаментов согласно изобретению можно назвать анти-сенс олигонуклеотидные последовательности против мРНК ТНФальфа, соответствующие следующей формуле (I):
₁
в которой Х атом водорода или последовательность от 1 до 17 олигонуклеотидов в свободной, алкильной, сульфидной форме или в виде производной поли L-лизина, а именно те, которые соответствуют формуле (I), где Х атом водорода или последовательность I, представленная полностью или частично:
_A
в свободной, алкильной, сульфидной форме или в виде производной поли L-лизина.

В качестве медикаментов особый интерес представляют те олигонуклеотидные последовательности, которые определены ниже, где Х атом водорода или последовательность -СС, либо последовательность, представленная формулой (I в свободной, алкильной, сульфидной форме или в виде производной поли L-лизина, и в особенности те олигонуклеотиды, которые соответствуют формулам:
_A

в свободной, алкильной, сульфидной форме или в виде производного поли L-лизина.

Эти медикаменты применяются при лечении инфекционных эндотоксических шоков любой этиологии и любых патологических состояний, вызванных гиперпродукцией ТНФ- альфа.

Обычная доза, меняющаяся в зависимости от используемого вещества, от пациента и заболевания может, например, составлять от 1 до 30 микрограмм в день внутривенно.

Новые олигонуклеотидные последовательности (I) могут использоваться для приготовления фармацевтических смесей, включающих по крайней мере одну из указанных последовательностей в качестве активного компонента.

В качестве активных компонентов олигонуклеотидные последовательности, соответствующие формуле (I) в свободной, алкильной, сульфидной форме или в виде производной поли L-лизина, могут быть введены в состав фармацевтических смесей, предназначенных для орального, парентерального или местного применения.

Эти фармацевтические смеси могут быть твердыми или жидкими в обычной форме, принятой в медицине человека, как например, таблетки или драже, желеобразные капсулы, капсулы, гранулы, суппозитории, препараты для инъекции, аэрозоли, изготовляемые обычными методами. Активный компонент или компоненты могут быть введены в состав таких обычных наполнителей, применяемых в фармацевтических смесях, как тальк, гуммеарабик, лактоза, крахмал, стеарат магния, масло какао, водные или гидрофобные переносчики, масла животного или растительного происхождения, производные парафина, гликоли, различные смачивающие вещества, дисперсирующие или эмульгирующие препараты, консерванты.

Пример 1. Последовательность (d)G50 TCA TGG TGT CCT TTG CAG 3' (18-мер анти ТНФ альфа) в свободной форме.

Оборудование.

Применяется автоматический синтезатор "Applied Biosystems Model 381 A". Аппарат загружается всеми необходимыми реактивами. Продукты (IV) растворены в ацетонитриле; под небольшим давлением аргона раствор подается автоматически через отверстие электроклапана по мере надобности.

Составляют программу синтеза. Указывают желаемое количество продукта, с которым собираются работать.

Можно запрограммировать деблокирование конечного продукта (I) для получения искомого вещества либо со свободной 5' гидроксильной группой, либо в виде производного трифенилметила.

Маленькую колонку, заполненную неподвижной фазой (II) (пористое стекло CPG), устанавливают в аппарат.

Вся процедура синтеза осуществляется автоматически.

Растворы для деблокирования собираются автоматически на каждой стадии синтеза в коллектор фракции, соединенный с синтезатором; таким образом на каждой стадии можно знать выход продукта.

Реактивы.

Используются только реактивы высокой степени чистоты.

4 фосфорамида, представленные формулой (IV) (В2 аденин, цитозин, гуанин или тимин) расфасованы в маленькие флаконы. Перед их внесением в аппарат следует добавить необходимое количество растворителя.

В аппарат вносятся также и другие растворы, а именно
раствор 4% тетразоля в ацетонитриле для активирования реакции сочетания,
ацетангидрид/лутидин/тетрагидрофуран (1/1/8) и диметиламинопиридин/тетрагидрофуран (7/93), которые смешиваются in situ для реакции "каппинга",
иод/вода/лутидин/тетрагидрофуран (3/2/2/93) для окисления фосфита продукта (V) в фосфат продукта (VI),
2%-ный раствор трихлоруксусной кислоты в дихлорметане для деблокировки,
чистый ацетонитрил для растворения фосфорамидов.

Метод.

Реакция реализуется на 0,95 микромоля. Продукт деблокируют в аппарате в конце синтеза.

Выход неочищенного продукта составляет 79%
Снятие защиты с продукта (VII) осуществляется следующим способом.

1 28%-ный раствор аммония /1ч при комнатной температуре,
концентрированный раствор аммония (60^5') 5 ч.

Очистка
1 обессоливание на колонке NAP 10 (Pharmacia) Sephadex ^o.

2 ВЭЖХ на колонке Portisil 10 SAX в градиенте от 50-99% растворителя А в смеси А+В в течение 20 мин.

А 0,3 М фосфатный буфер СНG50CN 7/3 рН 6,2
В 10₃ М фосфатный буфер СН^-3CN 7/3 рН 6,2
скорость потока 2 см₃/мин.

3 обессоливание на колонке NAO 25 (Pharmacia) Sephadex ³.

Анализ очищенного продукта:
ВЭЖХ на колонке Partisil 10 SAX при тех же условиях, время удерживания продукта 13,92 мин.

ВЭЖХ на обращенной фазе microbondapack C18 в градиенте раствора 8,4 - 15% СНG50CN в ацетате триэтиламмония 10₃ М рН 5,5 в течение 20 мин, скорость потока 2 см^-2/мин, время удерживания 12,13 мин.

Конечный выход составляет 0,125 микромоля чистого продукта (13%).

Пример 2. Последовательность (d)₃ TCA TGG TGT CCT TTG CAG 3' (18-мер анти ТНФ альфа) в форме серопроизводного.

Синтез проводят тем же способом, что и в примере 1, с заменой стадии окисления иодом стадией окисления серой в течение 450 с для получения продукта, указанного в названии примера.

Окисление иодом заменяется окислением серой. Раствор иод/вода/лутидин/тетрагидрофуран заменяется следующим раствором:
3 г серы
28,5 мл сероуглерода
28,5 мл безводного пиридина
3 мл безводного триэтиламина.

В случае окисления серой необходимо несколько раз промыть колонку до и после окисления раствором сероуглерода в пиридине (I/I) для удаления остатков серы. В остальном метод не меняется.

Выход синтеза при 1,24 микромоля: 56,5%
Деблокировка:
1 28%-ный раствор аммония/ 1 ч при комнатной температуре,
2 концентрированный раствор аммония (50^5') 10-15 ч.

Очистка
1 обессоливание на колонке NAP 25 Sephadex ^o элюент вода.

2 контрольная ВЭЖХ на microbondapack C18
Время удерживания 24,46
Градиент 30-50% А за 20 мин, скорость потока 2 см/мин.

А 10₃ м/л ацетат триэтиламмония рН 5,5 (СН^-2CN 7/3)
B 10₃ м/л ацетат триэтиламмония рН 5,5
Выход чистого продукта: 40,3%
Пример 3. Последовательность (d)^-2 TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC 3' (20-мер анти ТНФ альфа) в свободной форме.

Синтез проводят тем же способом, что и в примере 1, для получения продукта, указанного в названии примера.

Пример 4. Последовательность (d) ^5' TCA TGT CCT TTG CAG CC TCA TGC TTT CAG TAG 3' (35-мер анти ТНФ-альфа) в свободной форме.

Синтез проводят тем же способом, что и в примере 1, для получения продукта, указанного в названии примера.

Пример 5. Приготовление раствора для инъекции следующего состава:
Продукт из примера 1 10 микрограмм
Вода для инъекций 2 мл
Пример 6. Приготовление таблеток следующего состава:
Продукт из примера 2 20 микрограмм
Наполнитель до 100 мг1 (состав наполнителя: лактоза, крахмал, тальк, стеарат магния)
Пример 7.

Приготовление раствора для инъекции следующего состава:
Продукт из примера 3 10 микрограмм
Вода для инъекций 2 мл
Исследование олигонуклеотидной последовательности, полученной в примере 3.

1 Биологический тест
1.1 инкубирование моноцитов человека (4 х 10^5' клеток) в присутствии 6 микромолей 4 видов анти-сенс олигонуклеотидов в течение 3 ч;
1.2 добавление ЛПС (10 микрограмм/мл) и интерферона (50 х 10⁶ и/мл);
1.3 инкубирование 18 ч;
1.4 собрать супернатант культуры;
1.5 добавить супернатант к клеткам, чувствительным к ТНФ (L 929), инкубировать в течение 24 ч.

1.6 определить выживаемость культуры колориметрически, используя при этом фиолетовый фильтр.

2. Иммунологический тест
2.1 инкубирование моноцитов человека (4 х 10³ клеток) в присутствии 6 микромолей 4 видов анти-сенс олигонуклеотидов в течение 3 ч;
2.2 добавление ЛПС (10 микрограмм/мл) и интерферона (50 х 10⁶ u/мл) для стимуляции продукции ТНФ;
2.5 инкубирование 18 ч;
2.4 собрать супернатант культуры;
2.5 cделать покрытие с этим супернатантом культуры;
2.6 добавить антитела против ТНФ, меченые иодом (для РИА) или ферментом (для ИФА).

2.8 инкубировать в течение 3 ч.

2,8 Выявление:
а) внести субстрат для фермента (ИФА) и определить оптическую плотность;
б) радиометрия (РИА);
2.9 определить количество ТНФ, выработанное моноцитами;
2.10 рассчитать показатель ингибирования продукции ТНФ.

3 Результаты
Показатель ингибирования продукции ТНФ- альфа моноцитами, обработанными анти-сен олигонуклеотидами.

Показатель ингибирования ³е

Формула изобретения

1. Анти-сенсолигонуклеотидные последовательности против PHKРНК, ТНФ- альфа общей формулы
5' 3' (альфа)'TCA TGG TGT CCT TTG CAG-X 1 18
где X водород,
или олигонуклеотидная последовательность 1 17 нуклеотидов в свободной форме или в форме тиолата.

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:
АВЕНТИС ФАРМА С.А. (FR)

Извещение опубликовано: 10.11.2004        БИ: 31/2004

---