Способ получения средства, обладающего мочегонной и противовоспалительной активностью

 

Использование: изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения средства, обладающего мочегонной и противовоспалительной активностью. Сущность способа заключается в экстракции листьев толокнянки обыкновенной 45 - 55% этиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент 1:10-14 трижды по 60 минут, упаривании экстракта, очистки сепарированием и сушки методом распыления. Технологический результат заключается в повышении степени очистки целевого продукта. 13 табл.

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения биологически активных веществ из растительного сырья.

Известен способ получения отвара толокнянки обыкновенной, применяющегося в качестве мочегонного средства. Для приготовления отвара листья толокнянки обыкновенной измельчают до частиц размером не более 1 мм. Измельченное лекарственное растительное сырье заливают водой комнатной температуры, взятой с учетом коэффициента водопоглощения, в соответствующей емкости и настаивают на кипящей водяной бане при частом помешивании в течение 30 мин. Процеживают без охлаждения (отжимая растительное сырье) и прибавляют воду до требуемого объема извлечения /ГФ XI, вып. 2, С. 147-148.

Недостатком данного способа является относительно низкая мочегонная активность по сравнению с суммой, полученной по заявляемому способу.

Целью изобретения является получение суммы экстрактивных веществ для повышения мочегонной активности. Для достижения поставленной цели растительный материал экстрагируют 45-55% спиртом этиловым в соотношении сырье и экстрагент 1: (10 14) с учетом коэффициента водопоглощения и ложного дна экстрактора в течение 60 мин при температуре +50^oC и постоянном помешивании. Процесс повторяют трижды. Водно-спиртовые извлечения фильтруют через сукно и последовательно упаривают до 1/10 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от 3-х извлечений доупаривают до объема 15 л объединенного водного остатка. Упаренное извлечение сепарируют, затем высушивают на распылительной сушилке. Выход готового продукта составляет 32,30% от массы растительного материала.

По мнению заявителя, признаки, отличающие предложенное техническое решение от прототипа, являются существенными, поскольку при проведении патентных исследований не обнаружены.

Одной из актуальных проблем медицинской науки о здравоохранении являются вопросы профилактики и лечения заболеваний почек и мочевыделительной системы. Социальная значимость этой проблемы обусловлена широким распространением, разнообразием этиологических факторов и особой тяжестью заболеваний, приводящих к потере трудоспособности населения. В связи с этим, поиск и разработка новых эффективных лекарственных средств из растительного сырья, обладающих малой токсичностью и не оказывающих побочное действие при длительном применении, является также актуальной задачей.

Учитывая потребности практического здравохранения в лекарственных препаратах растительного происхождения для лечения заболеваний почек и мочевыделительной системы, разработан способ получения суммы биологически активных веществ из листьев толокнянки обыкновенной.

Предложенный способ позволяет получить конечный продукт, представляющий собой аморфный порошок желтовато-зеленого цвета, потеря в массе при высушивании 2,5% 1. На основании качественного фитохимического анализа суммы экстрактивных веществ установлено наличие: 1) флавоноидов: двумерной хроматографией на бумаге марки "Filtrak" FN - 12 в системах 1, 15% уксусной кислоты и 2. Этилацетат муравьиная кислота вода (3:1:2), просматриванием хроматограмм в УФ свете до и после проявления 5% спиртовым раствором хлористого алюминия с достоверными образцами обнаружены кверцетин R_f 0,28 (1), R_f 0,75 (2); мирицетин R_f 0,20 (1), R_f 0,53 (2); гиперозид R_f 0,64 (1), R_f 0,84 (2).

2) дубильных веществ: при добавлении к водному извлечению 2 3 капель раствора железоаммониевых квасцов появляется черно-синее окрашивание и осадок.

3) фенолкарбоновых кислот: методом TCX на пластинке "Silufol" в системе хлороформ уксусная кислота (9:1), просматривая в УФ-свете, обнаружили фенолкарбоновые кислоты по ярко-голубой флюоресценции. После обработки хроматограмм в парах аммиака, идентифицированы со свидетелем галловая кислота R_f 0,5, протокатеховая кислота R_f 0,19.

4) органических кислот: путем хроматографического разделения на пластинке силуфол в системе 95% спирт этиловый концентрированный раствор аммиака (16:4,5), проявитель 0,05% спиртовой раствор бромкрезолового зеленого. Обнаружены муравьиная (R_f 0,23 и хинная R_f 0,39) кислоты.

5) урсоловая кислота: из хлороформных извлечений методом TCX на "Silufol" в системе хлороформ-этилацетат (1:1) установлено наличие вещества тритерпеновой природы. По величине R_f 0,36 со свидетелем и окраске после обработки пятихлористой сурьмой идентифицировали с урсоловой кислотой.

6) арбутин: путем хроматографического разделения на бумаге FN-12 в 15% уксусной кислоте хроматограмму обрабатывают 10% раствором натра едкого водно-спиртовым, а через 10 минут диазореактивом. Арбутин имеет R_f 0,85 и проявляется в виде ярко-красного пятна.

II. Количественное определение.

Арбутин Титриметрическим методом /ГФ XI изд./ найдено 14,430,44% арбутина. Предлагаемый способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях по выпуску лекарственных препаратов. При производстве фитохимических препаратов основное место среди других технологических операций занимает экстрагирование лекарственного растительного сырья. Совершенствование и интенсификация производства с целью повышения выхода целевого продукта и эффективности использования сырьевых ресурсов требует детального рассмотрения различных факторов, влияющих на процесс экстрагирования действующих веществ. Нами изучены влияние состава и природы экстрагента, его соотношения с сырьем, температурного режима, степени измельчения сырья, продолжительности и кратности числа экстракций на выход биологически активных соединений из исследуемого лекарственного растения.

Количественная оценка велась по выходу экстрактивных веществ и содержанию арбутина /ГФ XI, вып.1, С. 295; ГФ XI, вып. 2, с. 26/. См. табл. 1.

Подбор оптимального экстрагента является одним из основных моментов при получении извлечений. В качестве экстрагента был использован спирт этиловый различной концентрации: 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 96% Как видно из таблицы 2, 45 55% спирт этиловый является оптимальным экстрагентом, так как позволяет получить наибольшее количество арбутина с учетом выхода экстрактивных веществ.

Как известно, размер частиц сырья обусловливает полноту и скорость перехода в раствор экстрагируемых веществ. Для изучения влияния степени измельчения на выход экстрактивных веществ и арбутина, сырье подвергалось измельчению до диаметра частиц 0, 5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 7,0; 10,0 мм. В таблице 3 представлены результаты исследований.

Установлено, что оптимальной степенью измельчения для сырья является размер частиц, не превышающий 2 мм. Подобрано оптимальное соотношение сырье-экстрагент 1:(10:14) для однократного залива сырья. См. табл. 4.

Дальнейшее увеличение объема экстрагента нецелесообразно, т.к. не наблюдается увеличения выхода извлекаемых веществ. На основании экспериментальных данных можно заключить, что увеличение температуры экстрагента положительно влияет на ход процесса. Установлена оптимальная температура экстракции (+502)^oC. Результаты представлены в таблице 5.

С целью определения продолжительности и кратности числа экстракций изучено время достижения равновесной концентрации в системе сырье-экстрагент. Для этого проводили трехкратную двухчасовую экстракцию измельченного сырья 50% спиртом этиловым в соотношении 1:(10 14) на водяной бане при температуре +50^oC с обратным холодильником до полного истощения сырья. Через каждые 15 минут во время трех контактов фаз отбирали по 25 мл извлечения для определенного количества экстрактивных веществ. Результаты представлены в таблице 6.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что равновесное состояние во время всех трех фаз наступает через 60 минут. В течение I контакта фаз экстрагируется около 65 70 экстрактивных веществ, II контакт фаз обеспечивает выход 15 20% и III 5 10% т.е. для полноты истощения сырья достаточно трехкратной экстракции.

Для доказательства температуры сушки нами изучены способы сушки с применением вакуум-сушильного аппарата и методом распыления. Готовый продукт, отвечающий требованиям предварительной нормативно-технической документации, получен по II способу на распылительной сушилке. Для выяснения механизма разложения веществ в готовом продукте проводились термографические исследования /снята дериватограмма/. Дериватограмма подтверждает, что разложение веществ начинается при температуре +127-130^oC, основное удаление влаги происходит при температуре от +43 до 100^oC. В связи с этим, показатель потери в массе при высушивании определяли при температуре +100^oC.

Пример 1. 10 кг листьев толокнянки обыкновенной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2 мм (сито N 20 ГОСТ 214 83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 150 л спирта 45 в соотношении сырье-экстрагент 1:10 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре +40^oC и постоянном перемешивании в течение 60 минут. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Аналогичным образом проводят еще две экстракции по 1 часу, подавая каждый раз в экстрактор спирт 45% в количестве, равном объему слитого экстракта. I слив 129 л; II слив 128 л; III слив 126 л. Водно-спиртовые извлечения последовательно упаривают до 1/10 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от 3-х извлечений доупаривают до объема 15 л объединенного водного остатка. Концентрированный экстракт сепарируют и сушат на распределительной сушилке. Получают 3,207 г готового продукта, что составляет 32,07 экстрактивных веществ от веса исходного сырья. Аморфный порошок желтовато-зеленого цвета комкуется, потеря в массе при высушивании -3,75% Диуретическую активность готового продукта оценивали в соответствии с "Методическими рекомендациями," (1989). Опыты проведены на 18 беспородных белых крысах обоего пола массой 190 200 г. Сумму экстрактивных веществ в виде водного раствора вводили однократно внутрижелудочно в дозе 12 мг/кг (1/20 ЛД₅₀) определение оптимальной условно-терапевтической дозы было проведено в предварительных экспериментах в объеме 1 мл/100 г за 30 минут до водной нагрузки, составляющей 2,5% от массы тела. Крыса контрольной группы получали в соответствующем объеме дистиллированную воду. В качестве препарата сравнения (прототипа) использовали отвар листьев толокнянки, приготовленный по ГФXI, в объеме 1 мл/100 г. Сбор мочи осуществляли в обменных клетках в течение 4 часов после водной нагрузки. Измеряли объем выделенной мочи, а также определяли содержание ионов калия и натрия в моче методом пламенной фотометрии на приборе "Flapho-4" (Германия).

Полученные результаты представлены в таблице 7.

Как следует из таблицы 7, однократное введение суммы экстрактивных веществ в указанной дозе оказывало умеренное стимулирующее действие на экскрецию воды и ионов натрия у белых крыс. При этом, диуретическая активность испытуемого средства была аналогичной таковой у препарата сравнения.

Во второй серии экспериментов оценивали противовоспалительную активность суммы экстрактивных веществ по классическому методу Менкина (Ойвин, Шетель, 1961). Опыты проведены на 18 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 160 180 г. Воспалительную реакцию воспроизводили путем подкожного введения белым крысам 9% раствора уксусной кислоты в объеме 0,5 мл в область спины с одновременным внутрибрюшинным введением раствора декстрана в дозе 300 мг/кг. Сумму экстрактивных веществ вводили в виде водного раствора внутрижелудочно в оптимальной условно-терапевтической дозе, составляющей 25 мг/кг (1/10 ЛД₅₀) определение оптимальной условно-терапевтической дозы было проведено в предварительных экспериментах. в объеме 1 мл/100 г. Первое введение испытуемого средства осуществляли за 1 час до введения уксусной кислоты, а затем ежедневно 1 раз в сутки в течение 25 дней. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в объеме 1 мл/100 г по аналогичной схеме.

В качестве препарата сравнения использовали отвар листьев толокнянки обыкновенной, приготовленный по ГФ XI, который вводили по аналогичной схеме в объеме 1 мл/100 г. На 2, 15 и 25 сутки исследования оценивали площадь некротизированной ткани путем нанесения контура некроза на прозрачную пленку.

Установлено, что курсовое введение суммы экстрактивных веществ в дозе 25 мг/кг оказывает противовоспалительное действие, снижая степень альтерации тканей при воздействии флогогенного агента (табл. 8). При этом активность испытуемого средства на 15 и 25 сутки исследования несколько уступала таковой у препарата сравнения.

Пример 2. 10 кг листьев толокнянки обыкновенной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2 мм (сито N 20 ГОСТ 214 83). Измельчают сырье, загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 150 л спирта 50% в соотношении сырье-экстрагент 1:10 с учетом коэффициента водопоглощения.

Экстрагируют при температуре 50^oC и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно. Заливают спиртом 50% в количестве, равном слитому, и экстрагируют. Операцию повторяют трижды. I слив 131 л; II слив 129 л; III слив 128 л. Водно-спиртовые извлечения последовательно упаривают до 1/10 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от 3-х извлечений доупаривают до объема 15 л объединенного водного остатка. Концентрированный экстракт сепарируют и сушат на распылительной сушилке. Получают 3,230 кг готового продукта, что составляет 32,3 экстрактивных веществ от веса исходного сырья. Аморфный порошок желтовато-зеленого цвета, комкуется, потеря в массе при высушивании 2,5 Исследовали острую токсичность суммы экстрактивных веществ по общепринятому методу Кербера (Требования. 1984). Опыты проведены на 36 беспородных белых крысах-самцах с исходной массой 160 180 г. Испытуемое вещество в виде водного раствора вводили однократно внутрибрюшинно в дозах от 150 до 400 мг/кг. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток.

Проведенные исследования показали, что ЛД₅₀ суммы экстрактивных веществ при внутрибрюшинном введении белым крысам составляет 225 мг/кг (136,2^oC313,8). Полученные результаты позволяет классифицировать испытуемое средство как малотоксичное вещество по классификации Сидорова К.К. (1973).

Диуретическую активность суммы экстрактивных веществ оценивали по общепринятому методу к 2,5 водной нагрузкой. На 18 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 190 200 г. Описание схемы эксперимента см. в предыдущем разделе. Испытуемое средство в виде водного раствора вводили однократно внутрижелудочно в дозе 12 мг/кг. Полученные результаты приведены в таблице 9.

Как следует из приведенной таблицы, сумма экстрактивных веществ в дозе 12 мг/кг оказывает выраженное диуретическое действие, о чем свидетельствует увеличение объема выделяемой мочи у белых крыс. Наряду с этим, отмечается достоверное повышение экскреции ионов натрия с мочой. При этом диуретическая активность испытуемого средства несколько превосходила таковую у отвара толокнянки.

В следующей серии экспериментов исследовали противовоспалительную активность суммы экстрактивных веществ по методу Менкина (Ойвин, Шетель, 1961), описанному в предыдущем разделе. Опыты проведены на 18 белых беспородных крысах обоего пола с исходной массой 160 180 г. Испытуемое средство в виде водного раствора вводили по вышеописанной схеме в дозе 25 мг/кг. Полученные результаты приведены в таблице 10.

Данные, приведенные в таблице 10, свидетельствуют, что курсовое введение суммы экстрактивных веществ в дозе 25 мг/кг оказывает выраженное противовоспалительное действие, оказывая протекторное антиальтеративное действие и способствуя ускорению регенерации поврежденной ткани. При этом, противовоспалительная активность предлагаемого средства на ранних сроках исследования превосходит таковую у отвара толокнянки обыкновенной.

Исследовали также противовоспалительную активность суммы экстрактивных веществ с использованием модели отека конечности по методу Стрельникова Ю.Е. (1960). Опыты проведены на белых беспородных крысах обоего пола массой 180 - 200 г. Отек конечности вызывали субплантарным введением 0,1 мл 3 раствора формалина. Сумму экстрактивных веществ в виде водного раствора вводили внутрижелудочно в дозе 25 мг/кг в объеме 1 мл/100 г 3-х кратно: первое ведение осуществляли за 3 часа до субплантарного введения формалина, а затем через 5 и 18 часов после этого. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в равном объеме 1 мл/100 г. Через 24 часа после введения формалина животных умерщвляли и мгновенной декапитацией под эфирным наркозом ампутировали задние лапки на уровне коленного сустава и производили оценку антиэкссудативной активности по формуле:
где: P_к разность веса лапок с отеком и без отека у животных контрольной группы.

P разность веса лапок с отеком и без отека у животных опытной группы.

Полученные результаты приведены в таблице 11.

Как следует из приведенной таблицы, сумма экстрактивных веществ в дозе 25 мг/кг оказывает умеренное антиэкссудативное действие, аналогичное действию отвара толокнянки.

Пример 3. 10 кг листьев толокнянки обыкновенной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2 мм (сито N 20 ГОСТ 214 83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 150 л спирта 55 в соотношении сырье-экстрагент 1:10 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре 60^oC и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно. Заливают спиртом 55 в количестве равном слитому и экстрагируют. Операцию повторяют трижды. I слив 128 л; II слив 128 л; III слив 128 л. Водно-спиртовые извлечения последовательно упаривают до 1/10 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от 3-х извлечений доупаривают до объема 15 л объединенного водного остатка. Концентрированный экстракт сепарируют и сушат на распылительной сушилке. Получают 3,217 кг готового продукта, что составляет 32,17 экстрактивных веществ от веса исходного сырья. Аморфный порошок желтовато-зеленого цвета, комкуется, потеря в массе при высушивании 2,8 Изучали диуретическую активность полученной суммы экстрактивных веществ с использованием 2,5 водной нагрузки по вышеописанному методу. Испытуемое средство в виде водного раствора вводили однократно внутрижелудочно в дозе 12 мг/кг. Установлено, что сумма экстрактивных веществ в указанной дозе обладает умеренной диуретановой активностью, способствуя увеличению экскреции воды и электролитов у белых крыс. См. табл. 12. При этом, желчегонная активность испытуемого средства была аналогичной таковой у препарата сравнения. Таблица 12.

Как следует из приведенной таблицы, при однократном введении суммы экстрактивных веществ в дозе 12 мг/кг наблюдается умеренное повышение диуреза у белых крыс, о чем свидетельствует достоверное увеличение объема мочи и экскреции ионов натрия. Диуретическая активность испытуемого вещества была аналогичной таковой у отвара толокнянки. В следующей серии экспериментов изучали противовоспалительную активность суммы экстрактивных веществ по методу Менкина (Ойвин, Шетель, 1961), описанному в предыдущих разделах. Сумму экстрактивных веществ в виде водного раствора вводили по вышеописанной схеме в дозе 25 мг/кг. Результаты исследований показали, что курсовое введение суммы экстрактивных веществ в указанной дозе оказывает противовоспалительное действие, несколько уступающее действию отвара листьев толокнянки. См. табл. 13.

Источники информации
1. Государственная Фармакопея X издания. М. 1968.

2. Государственная Фармакопея XI издания. Вып. 1, 2. М. 1987. 1990.

3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. 1 т. 1988. с. 498
4. Макаров А. А. Химическая оценка сырья толокнянки /Учен. зап. Якут. Ун-та. Вып. 18. 1971. с. 41-44.

5. Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению диуретических веществ (Изд. официальное). М. 1989. с. 17
6. Ойвин И. А. Шетель С.Л. Методика изучения местных нарушений капиллярной проницаемости // Материалы по патогенезу воспаления и патологии белков крови. Душанбе. 1961. Т. 49, N 5, с. 167 173.

7. Пономарев В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья. М. 1976. с. 202
8. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения и их химический состав, использование. Л. 1987. с. 73 74.

9. Сидоров К. К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения. Токсикология новых промышленных химических веществ. М. 1973, с. 47 51.

10. Стрельников Ю.Е. Сравнительная характеристика противовоспалительного действия некоторых пиримидиновых производных. Фармакол. и токсикол. 1960. N 6. c. 526 531.

11. Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ. М. 1984.

12. Шнякина Г.П. Седельникова В.А. Цыганкова Н.В. О содержании арбутина в листьях некоторых растений Советского Дальнего Востока. Растит. ресурсы. -1981. N 4, с. 568 571.

13. Hochleistungsflussigchromotographishe Trennung und quantative bestimmung von Arbutin, Methylarbutin, Hydrochinon and hydrochinonmonomethylaether in Arctostaphylos, Bergenia, Calluna und Vaccinium Arten // Planta medica. 1979. Vol. 35 P. 53 261.

Формула изобретения

Способ получения средства, обладающего мочегонной и противовоспалительной активностью путем экстракции листьев толокнянки обыкновенной (Aratostaphylos Uva. ursi L. ), отличающийся тем, что экстракцию проводят 45-55% -ным этиловым спиртом в соотношении сырье: экстрагент 1 10-14 трижды по 60 мин, водно-спиртовые извелечения упаривают, очищают сепарированием и высушивают методом распыления.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13