Способ выделения фикоцианина c из клеток цианобактерий

 

Использование: в биотехнологии, в частности способе получения красителя из микробиологического и растительного сырья. Сущность изобретения: клетки цианобактерии обезжиривают и промывают 35 - 100-кратным объемом дистиллированной воды, затем клетки разрушают и подвергают экстракции одновременно ультразвуком в течение 15 - 25 мин, экстракт отделяют и сушат.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения красителей из микробиологического и растительного сырья.

Фикоцианин является одним из ряда флуоресцентных пигментов, известных как фикобилипротеины, которые продуцируются красными и сине-зелеными водорослями (цианобактериями). В цианобактериях этот пигмент доминирующий. Флуорофорной группой фикоцианина является фикоцианобилин [1] который ковалентно связан с белковой молекулой.

(1) Фикоцианин С является одной из основных форм фикоцианинов и может легко связываться с биологически активными молекулами белками, ферментами, нуклеиновыми кислотами, полипептидными гормонами и т.д. Это свойство позволяет использовать фикоцианин С в иммунологии, диагностической медицине, жидкостной хроматографии. Этот краситель находит применение в качестве поверхностной флуоресцентной метки антител, в особенности моноклональных. С этой целью фикоцианин С в виде индивидуального вещества, а также в виде конъюгатов с авидином и биотином представлен в каталогах фирм "Sigma" и "ICN Flow". Кроме того, величина квантового выхода (около 100%) позволяет использовать фикоцианин С в качестве лазерного красителя в длинноволновой части спектра (максимум поглощения 615 нм, максимум испускания 635 нм). С другой стороны, микроводоросль Spirulina platensis, чаще всего используемая в качестве источника фикоцианинов, является нетоксичной и находит применение в пищевой промышленности. Это позволяет рассматривать фикоцианин С также в качестве известного пищевого красителя и рекомендовать для использования в косметике и парфюмерии.

Известны способы выделения и очистки фикоцианина С, основанные на 1) отделении клеток микроводорослей фильтрацией; 2) обработке влажных клеток лизоцимом в водно-солевом буферном растворе; 3) отделении водонерастворимых веществ центрифугированием; 4) многократном осаждении фикоцианинов 50%-ным сульфатом аммония; 5) колоночной хроматографии на DEAE-сефадексе; 6) переосаждении фикоцианинов 50%-ным сульфатом аммония. Выход очищенных фикоцианинов менее 0,01% в пересчете на исходные водоросли, чистота более 95% отношение молярных коэффициентов инкстинкции в УФ-спектре при длинах волн 620 нм и 280 нм (₆₂₀/₂₈₀) более 4. Основными недостатками способа являются: 1) многостадийность; 2) низкий выход целевого продукта; 3) использование ферментного препарата (внесение в экстракт дополнительного белка); 4) значительная длительность процесса (7-8 дней).

Наиболее близок по технической сущности к предлагаемому изобретению является известный способ выделения фикоцианина С из цианобактерии Spirulina platensis. Способ состоит из следующих стадий: (1) разрушение клеток с помощью механического клеточного гомогенизатора; (2) отделение водонерастворимых веществ центрифугированием при 10000 g; (3) осаждение фикоцианина С вместе с балластными белками 50%-ным раствором сульфата аммония; (4) отделение белкового осадка центрифугированием при 40000 g; (5) диализ фикоцианина С; (6) хроматография на гидроксилапатитной колонке; (7) хроматография на колонке с DEAЕ-сефадексом.

Выход очищенного фикоцианина С 0,08% в пересчете на сухую биомассу цианобактерии, чистота более 95% отношение ₆₂₀/₂₈₀- более 4. Технологическое время 9-10 дней.

Главные недостатки способа заключаются в следующем:
технологический процесс многостадиен и весьма продолжителен;
низкий выход целевого продукта;
неэффективность механического разрушения клеточной биомассы;
использование в технологическом процессе двух стадий хроматографической очистки.

Целью изобретения является упрощение технологического процесса и повышение выхода фикоцианина С при получении его из цианобактерии.

Поставленная цель достигается тем, что обезжиренные органическими растворителями клетки цианобактерии промывают 35-100-кратным объемом бидистиллированной воды, суспендируют не менее, чем в 10-кратном объеме бидистиллированной воды, обрабатывают ультразвуком в течение 15-25 мин и центрифугированием или фильтрацией отделяют полученный экстракт, представляющий собой водный раствор фикоцианина С, который затем лиофильно высушивают.

Предложение соответствует критерию "существенные отличия", так как не обнаружены известные технические решения, содержащие признаки, сходные с отличительными признаками предложенного способа.

Указанные выше параметры подобраны экспериментальным путем и являются оптимальными. Предлагаемый способ может быть применен к клеточной биомассе, остающейся после извлечения органическими растворителями из цианобактерии липофильных биологически активных веществ: хлорофилла, полиеновых липидов и жирных кислот (в том числе и -линоленовой кислоты), ксантофилов, -токоферола, -каротина и др.

Первая операция, состоящая в промывке обезжиренной биомассы 35-100-кратным объемом бидистиллированной воды, предназначена для удаления из клеток водорастворимых веществ и остатков органических растворителей (фикоцианин С при этом не вымывается, по-видимому, за счет связывания с остатками гликопротеиновой клеточной стенки). Уменьшение количества промывной воды ниже названного предела значительно снижает качество выделяемого фикоцианина за счет неполноты удаления примесных веществ. С другой стороны, использование для промывки биомассы более чем 100-кратного объема промывной воды не оправдано, ввиду практически полного отсутствия в растворе вышеназванных примесей.

Для экстракции фикоцианина С твердый остаток клеточной биомассы, полученный на предыдущей стадии, суспендируют не менее, чем в 10-кратном объеме бидистиллированной воды, и обрабатывают ультразвуком в течение 15-25 минут. Уменьшение количества экстрагента (воды) и/или времени обработки суспензии ультразвуком ниже указанных пределов значительно снижает выход фикоцианина. Увеличение времени обработки ультразвуком приводит к деструкции молекулы фикоцианина, появлению продуктов развала и снижению качества выделяемого вещества.

Для характеристики качества выделяемого препарата фикоцианина С использовался электрофорез в 7%-ном полиакриламидном геле в буферном растворе 0,25 М трис-НСl (рН 7,0), содержащем 2% додецилсульфата натрия и 1% меркаптоэтанола; вещества обнаруживались на электрофореграмме с помощью кумасси брилиантового синего. В качестве стандарта применялся препарат фикоцианина фирмы "Sigma" (США). Содержание флуорофорной группы определялось по величине отношения ₆₂₀/₂₈₀, а также по экспериментально установленному для 1%-ного раствора фикоцианина значению ₆₂₀73 [7,8] УФ-спектры и спектры флуоресценции полностью совпадают с приведенными в литературе. Определение содержания белка проводилось по методу Лоури.

П р и м е р 1. Обезжиривание клеток. Отфильтрованные и высушенные клетки цианобактерии Spirulina platensis (15 г) суспендируют при комнатной температуре, перемешивают 5 ч, клетки отделяют центрифугированием при температуре 0-4^оС в течение 50 мин при 400000 g, супернатант сливают, а остаток (10,5 г) используют для дальнейшего выделения фикоцианина С.

Выделение фикоцианина С. Клеточную биомассу после обезжиривания переносят на пористый фильтр с размером пор 0,2 мкм и промывают 1,05 л (100-кратный объем) бидистиллированной воды, суспендируют в 105 мл бидистиллированной воды (10-кратный объем), обрабатывают ультразвуком в течение 25 мин и центрифугированием при температуре 0-4^оС в течение 80 мин при 40000 g отделяют полученный экстракт, представляющий собой водный раствор фикоцианина С, который затем лиофильно высушивают. Выход очищенного фикоцианина С 127 мг (0,85% в пересчете на сухую биомассу цианобактерии), чистота более 95% отношение ₆₂₀/₂₈₀- 2,95. Технологическое время 12 ч.

П р и м е р 2. Обезжиривание клеток. Отфильтрованные и высушенные клетки цианобактерии Spirulina platensis (13,5 г) суспендируют при комнатной температуре в 800 мл ацетона, перемешивают 5 ч, клетки отделяют центрифугированием при температуре 0-4^оС в течение 50 мин при 40000 g, супернатант сливают, а остаток (9,8 г) используют для дальнейшего выделения фикоцианина С.

Выделение фикоцианина С. Клеточную биомассу после обезжиривания переносят на пористый фильтр с размером пор 0,2 мкм и промывают 343 мл (35-кратный объем) бидистиллированной воды, суспендируют в 137 мл бидистиллированной воды (14-кратный объем), обрабатывают ультразвуком в течение 15 мин и фильтрацией через пористый фильтр с размером пор 0,2 мкм отделяют полученный экстракт, представляющий собой водный раствор фикоцианина С, который затем лиофильно высушивают. Выход очищенного фикоцианина С 119 мг (0,88% в пересчете на сухую биомассу цианобактерии), чистота более 95% отношение ₆₂₀/₂₈₀- 3,98. Технологическое время 7 ч.

П р и м е р 3. Обезжиривание клеток. Отфильтрованные и высушенные клетки цианобактерии Spirullina platensis (14,7 г) суспендируют при комнатной температуре в 800 мл смеси хлороформ-этанол (2:1, соотношение объемное), перемешивают 5 ч, клетки отделяют центрифугированием при температуре 0-4^оС в течение 50 мин при 40000 g, супернатант сливают, а остаток (10,1 г) используют для дальнейшего выделения фикоцианина С.

Выделение фикоцианина С. Клеточную биомассу после обезжиривания переносят на пористый фильтр с размером пор 0,2 мкм и промывают 910 мл (90-кратный объем) бидистиллированной воды, суспендируют в 111 мл бидистиллированной воды (11-кратный объем), обрабатывают ультразвуком в течение 20 мин и фильтрацией через пористый фильтр с размером пор 0,2 мкм отделяют полученный экстракт, представляющий собой водный раствор фикоцианина С, который затем лиофильно высушивают. Выход очищенного фикоцианина С 132 мг (0,9% в пересчете на сухую биомассу цианобактерии), чистота более 95% отношение ₆₂₀/₂₈₀- 4,1. Технологическое время 10 ч.

Предлагаемый способ представляет собой принципиально новое техническое решение и, по сравнению с известным способом, имеет следующие преимущества:
количество стадий сокращается до двух, т.е. более чем в 3 раза; при этом полностью исключаются усложняющие процесс стадии хроматографической очистки;
технологическое время снижается до 7-12 ч, т.е. не менее, чем в 20 раз;
несмотря на перечисленные выше упрощения технологического процесса выход продукта в пересчете на сухую биомассу увеличивается до 0,85-0,9% т.е. более, чем в 10 раз, а качество не снижается: его чистота (не менее 95%) соответствует таковой в прототипе;
технологический процесс предполагает возможность параллельного извлечения из цианобактерии липофильных биологически активных веществ (хлорофилла, ксантофиллов полиеновых липидов, -линоленовой кислоты, -токоферола, -каротина и др.), экстрагируемых в процессе обезжиривания, т.е. позволяет комплексно перерабатывать биосырье и повышает полноту его утилизации;
технологический процесс может быть воспроизведен практически в любом масштабе и не требует сложной аппаратуры.

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФИКОЦИАНИНА C ИЗ КЛЕТОК ЦИАНОБАКТЕРИЙ, включающий разрушение клеток, экстрацию красителя водой, отделение экстракта от клеток и высушивание, отличающийся тем, что перед разрушением клеток последние обезжиривают и промывают 35 - 100-кратным объемом дистиллированной воды, причем разрушение клеток и экстракцию красителя осуществляют одновременно ультразвуком в течение 15 - 25 мин.