Способ определения концентрации гемоглобина в крови и реактив для лизирования клеток крови

 

Использование: медицина, гематология, для определения концентрации гемоглобина в крови. Сущность: разведенную пробу крови обрабатывают лидирующим реактивом на основе четвертичной аммониевой соли и измеряют оптическую плотность раствора при 405 нм. 2 с. и 5 з. п. ф-лы, 5 ил., 1 табл.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в гематологии при проведении исследований крови.

Измерения концентраций гемоглобина и лейкоцитов в крови являются наиболее распространенными лабораторными исследованиями крови. В настоящее время определение концентрации лейкоцитов в крови производят с использованием лизирующих реактивов (гемолитиков) веществ, разрушающих эритроциты, при этом в течение времени, необходимого для измерений, в разведении крови остаются лейкоциты, концентрация которых измеряется кондуктометрическими счетчиками.

Определение концентрации гемоглобина в крови производят по результатам измерения в области определенной длины волны оптической плотности гемолизата продукта, получающегося в результате добавления гемолитика к разбавленной крови. Под действием гемолитика разрушаются эритроциты и происходит выход гемоглобина в раствор. Так как в крови содержатся различные формы гемоглобина (оксигемоглобин, дезоксигемоглобин, карбоксигемоглобин, метгемоглобин и др. ), имеющие различные показатели оптической плотности, то для определения концентрации гемоглобина по оптической плотности необходимо трансформировать все формы гемоглобина в одну устойчивую форму, что выполняется с помощью специальных веществ трансформирующих агентов. В качестве унифицированного в настоящее время принят цианметгемоглобиновый метод, при котором все формы гемоглобина трансформируются к гемоглобинцианиду, оптическая плотность которого измеряется в области длины волны 540 нм.

Главным недостатком цианметгемоглобинового метода является использование токсичных трансформирующих агентов (цианистый калий или ацетонциангидрин).

Поскольку при определении концентрации в крови как лейкоцитов, так и гемоглобина требуется произвести разрушение эритроцитов, сопровождающееся выходом гемоглобина в раствор, для упрощения процедуры исследования на практике используют гемолизат, полученный из одного и того же разведения крови, как для определения концентрации лейкоцитов (с использованием, например, кондуктометрических счетчиков), так и для определения концентрации гемоглобина. Однако, в этом случае к лизирующему реактиву предъявляются противоречивые требования: с одной стороны, для точного определения концентрации гемоглобина требуется произвести разрушение не только эритроцитов, но и лейкоцитов (поскольку рассеяние света на лейкоцитах может приводить к существенным погрешностям при измерении оптической плотности например, в случаях лейкоцитоза и т.д.), а для определения концентрации лейкоцитов последние должны быть сохранены. Кроме того желательно наличие у лизирующего реактива свойства трансформировать все формы гемоглобина к единому продукту, чтобы избежать использование токсичных трансформирующих агентов.

Наиболее близким к предлагаемым способу определения концентрации гемоглобина в крови и реактиву для лизирования клеток крови являются известный способ и реактив. Известный реактив включает лизирующий агент на основе полиоксиэтилена, буферный агент для поддержания определенного значения рН и воду. Известный реактив эффективно и быстро лизирует эритроциты, при этом число лейкоцитов остается неизменным. Определение концентрации гемоглобина с использованием данного лизирующего реактива не требует применения трансформирующих агентов и производится путем разбавления пробы крови в заданном соотношении, добавления к получившемуся разведению лизирующего реактива и последующего измерения оптической плотности гемолизата в области длины волны 540 нм. В отличие от цианметгемоглобинового в данном способе не используются токсичные вещества, однако при использовании указанного лизирующего реактива происходит преобразование различных форм гемоглобина к оксигемоглобину, что ограничивает точность определения концентрации гемоглобина, так как известно, что не все формы гемоглобина (например, метгемоглобин, карбоксигемоглобин и др.) могут быть трансформированы в оксигемоглобин. В результате в ряде случаев возникает существенная погрешность в определении концентрации гемоглобина (например, у курильщиков, при некоторых отравлениях и т.д.). Другим недостатком известных способа и реактива, ограничивающим точность определения концентрации гемоглобина, является то, что присутствии лейкоцитов в гемолизате при измерении оптической плотности вызывает рассеяние света, что проявляется при измерениях как увеличение оптической плотности, приводящее к завышению измеряемой концентрации гемоглобина.

Настоящее изобретение направлено на достижение следующего технического результата: повышение точности определения концентрации гемоглобина при возможности использования гемолизата, полученного из одного и того же разведения крови, для определения концентраций как лейкоцитов, так и гемоглобина.

Указанный результат достигается тем, что в способе определения концентрации гемоглобина в крови, включающем разбавление крови в заданном соотношении, добавление к полученному разведению лизирующего реактива и определение концентрации гемоглобина путем измерения оптической плотности гемолизата, согласно изобретению измерение оптической плотности проводят в области длины волны 405 нм.

В предложенном способе используется реактив для лизирования клеток крови, включающий лизирующий агент, буферный агент для поддержания значения рН и воду, при этом в качестве лизирующего агента используется четвертичная аммониевая соль, имеющая общую формулу строения R2 ___ R3X^- где R1, R2, R3 короткие алкильные группы, содержащие от 1 до 4 атомов углерода; R4 алкильная группа, содержащая от 12 до 16 атомов углерода; Х галоген.

Предпочтительным является использование четвертичной аммониевой соли с алкильной группой R4, содержащей от 14 до 16 атомов углерода.

Кроме того, реактив может дополнительно содержать неионное поверхностно-активное вещество (ПАВ).

Кроме того, реактив может дополнительно содержать антикоагулянт.

Кроме того, реактив может дополнительно содержать консервант.

В качестве неионного ПАВ могут быть использованы Triton X-100 или Brij-35.

В качестве антикоагулянта могут быть использованы цитрат натрия или калия.

В качестве консерванта могут быть использованы тетраборат натрия или формалин.

В качестве буферного агента может быть использован трис-гидроксиметил-аминометан.

Измерение оптической плотности в области длины волны 405 нм позволяет повысить точность определения концентрации гемоглобина за счет того, что конечный продукт реакции гемолитика с разведением крови, имеющий максимум спектра поглощения в области 405 нм, является производным от всех основных форм гемоглобина. Кроме того, в области длины волны 405 нм оптическая плотность гемолизата существенно выше, чем в области 540 нм, что позволяет уменьшить ошибку из-за рассеяния света на лейкоцитах и других рассеивающих частицах.

Использование в качестве лизирующего агента четвертичной аммониевой соли с указанной формулой строения позволяет осуществлять не только разрушение (лизис) эритроцитов, но и трансформацию всех основных форм гемоглобина к устойчивому конечному продукту (без использования трансформирующих агентов), спектр поглощения которого имеет максимум в области 405 нм. Кроме того, под действием данного лизирующего агента лизис эритроцитов протекает существенно быстрее, чем лизис лейкоцитов, что позволяет проводить точные определения концентраций лейкоцитов и гемоглобина при использовании гемолизата, полученного из одного и того же разведения крови.

Использование четвертичной аммониевой соли с алкильной группой, содержащей от 14 до 16 атомов углерода, позволяет повысить эффективность лизиса эритроцитов за счет разрушения их на более мелкие частицы. В качестве лизирующего агента могут быть использованы, например, этилгексадецилдиметиламмоний бромид, этилгексадецилдиметиламмоний хлорид, гексадецилтриметиламмоний бромид и т.д.

Введение в состав реактива неионного ПАВ способствует дальнейшему "дроблению" частиц, получающихся в результате разрушения эритроцитов.

Введение в состав реактива антикоагулянта позволяет избежать снижения точности, возникающего вследствие образования в гемолизате с течением времени сгустков, соизмеримых по объему с лейкоцитами.

Введение в состав реактива консерванта позволяет избежать бактериального загрязнения, что обеспечивает возможность длительного хранения реактива.

На фиг.1-3 представлены распределения лейкоцитов по объему, полученные в различные моменты времени после добавления к разведению крови лизирующего реактива; на фиг.4 спектр поглощения получаемого гемолизата крови; на фиг.5 корреляционная зависимость между результатами определения концентрации гемоглобина предложенным способом и референтным цианметгемоглобиновым методом.

Способ осуществляется следующим образом. Проводят разбавление пробы крови (с использованием, например, физиологического раствора или раствора Локка) в соотношении, например, 1:500. Затем добавляют к полученному разведению крови лизирующий реактив, после истечения определенного времени (длительность этого времени зависит как от количественного состава, так и от объема добавляемого гемолитика) проводят измерение оптической плотности гемолизата в области длины волны 405 нм, по результатам измерения определяют концентрацию гемоглобина (при этом имеется однозначное соответствие между измеренным значением оптической плотности и концентрацией гемоглобина, а конкретное значение коэффициента связи между ними определяют предварительно, как и в известных способах, с помощью проб крови с известными значениями концентрации гемоглобина, полученными, например, референтным методом).

В таблице представлен пример количественного состава лизирующего реактива.

Содержание каждой составляющей может отличаться от табличных значений и выбирается из следующих соображений.

Уменьшение содержания лизирующего агента приводит к замедлению лизиса эритроцитов и увеличению размеров, образующихся в результате частиц, а увеличение к ускоренному разрушению лейкоцитов.

Содержание буферного агента выбирается исходя из необходимости поддержания значения рН в пределах 9.11 для воспроизведения стабильных условий протекания реакции гемолитика с разведением крови.

Уменьшение содержания антикоагулянта приводит к ускорению слипания эритроцитарных частиц.

Уменьшение содержания неионного ПАВ приводит к увеличению размеров эритроцитарных частиц, а увеличение к ускоренному разрушению лейкоцитов.

На фиг.1-3 приведены распределения частиц по объему, полученные через 1, 15 и 30 мин после добавления данного реактива к разведению крови. Как видно из фиг. 1, уже через 1 мин после добавления гемолитика происходит полный и эффективный гемолиз эритроцитов, а в распределении лейкоцитов имеется два пика, соответствующие двум основным субпопуляциям лейкоцитов лимфоцитам и гранулоцитам. Из фиг.2 видно, что через 15 мин второй пик исчезает, что объясняется уменьшением гранулоцитов в объеме, однако общая концентрация лейкоцитов остается неизменной. Из фиг.2, 3 видно, что такое распределение частиц по объему сохраняется в течение 30 мин. Таким образом, в интервале от 1 до 30 мин может быть выполнено точное определение концентрации лейкоцитов с использованием, например, кондуктометрического счетчика.

На фиг. 4 представлен спектр поглощения получаемого гемолизата. Путем экспериментальных исследований установлено, что этот спектр, отличающийся от спектров основных форм гемоглобина, соответствует определенному устойчивому конечному продукту реакции используемого гемолитика с разведением крови, причем данный конечный продукт является производным от всех основных форм гемоглобина, т.е. все основные формы гемоглобина трансформируются к данному конечному продукту, при этом подобная трансформация гемоглобина может происходить при использовании как предложенного гемолитика, так и некоторых других. Характер получаемого спектра позволяет сделать вывод, что для определения концентрации гемоглобина по оптической плотности гемолизата следует использовать область длины волны 405 нм. Для физиологических и патологических концентраций гемоглобина оптическая плотность в области указанной длины волны существенно выше, чем в области длины волны 540 нм, поэтому измерение в области высоких значений оптической плотности позволяет существенно уменьшить ошибку, связанную с рассеянием света на лейкоцитах.

Корреляционный анализ результатов определения концентрации гемоглобина референтным цианметгемоглобиновым методом и предложенным способом показал, что коэффициент корреляции результатов составляет 0,984. Близкое к единице значение коэффициента корреляции подтверждает высокую точность предложенного способа и адекватность положенных в его основу предпосылок.

Формула изобретения

Способ определения концентрации гемоглобина в крови, включающий обработку разведения пробы крови лизирующим реактивом и определение концентрации гемоглобина по результатам измерения оптической плотности гемолизата, отличающийся тем, что в качестве лизирующего реактива используют реактив на основе четвертичной аммониевой соли, имеющей общую формулу строения где R₁, R₂, R₃ - С₁ - С₄-алкил; R₄ - С₁₂ - С₁₆-алкил; X - галоген.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измерения оптической плотности проводят в области длины волны 405 нм.

3. Реактив для лизирования клеток крови, включающий лизирующий агент, буферный агент для поддержания значения pH и воду, отличающийся тем, что в качестве лизирующего агента используется четвертичная аммониевая соль, имеющая общую формулу строения
где R₁, R₂, R₃ - короткий С₁-С₄-алкил;
R₄ - С₁₂ - С₁₆-алкил;
Х - галоген,
при содержании лизирующего агента не менее 45,6 г/л.

4. Реактив по п.3, отличающийся тем, что в нем используется четвертичная аммониевая соль с С₁₄ - С₁₆-алкильной группой.

5. Реактив по п. 3, отличающийся тем, что он дополнительно содержит неионное поверхностно-активное вещество.

6. Реактив по п.3 или 4, отличающийся тем, что он дополнительно содержит антикоагулянт.

7. Реактив по п.3 или 4, отличающийся тем, что он дополнительно содержит консервант.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6