Способ определения содержания в крови гликолипидных комплексов, содержащих сиаловую кислоту

 

Использование: в медицине и может применяться для избирательного определения в крови гликолипидных комплексов, несущих сиаловую кислоту. Сущность изобретения: сыворотку крови разбавляют водой, затем экстрагируют с несмешиваемым с водой органическим растворителем или смесью растворителей до удаления промежуточных липидов, липротеиновая фракция, содержащая гликолипиды, несущие сиаловую кислоту, выпадает в осадок из водной фазы. Выпавшую в осадок фракцию вторично растворяют, содержание сиаловой кислоты в растворе или количество и качество гликолипида, несущего сиаловую кислоту определяют известным методом. Водорастворимая соль одно-, двух- и трехвалентного металла, кроме щелочных металлов, используется в качестве осадителя в количестве, соответствующем окончательной концентрации ионов металлов в смеси (0,005-0,1 моль/л), процесс осаждения осуществляется при рН 1,5-8,0. Способ позводяет повысить точность диагностики наличия опухолей в организме на ранней стадии заболевания. 1 табл.

Изобретение относится к аналитическому способу для избирательного определения липолипидных комплексов, несущих сиаловую кислоту.

Сиаловая кислота (N-ацетилнейраминовая кислота) появляется в живых организмах в свободное или связанном состояниях (Advances in Cancer Res, 1983, v. 38, р. 289-350). Сиаловая кислота может быть связана в качестве терминальной группы через олигосахаридную цепочку со сфинголипидами, связанными с мембраной (J. of Supramolecular Structure, 1978, v. 9, p. 157-177). Термины ганглиозиды, включая гликосфинголипиды, не всегда однозначны в литературе. Согласно Свеннерхолму (Comprehengive Biochemistry. Amsterdam, 1970, v. 18, р. 201). Эти соединения можно классифицировать в группы моносиалоганглиозиды, дисиалоганглиозиды и трисиалоганглиозиды. Гидробойной частью ганглиозида является церамид, который связан с мембраной посредством длинной цепочки ненасыщенных жирных кислот. Церамид связан с олигосахаридами, т.е. с глюкозой, галактозой, N-ацетилгалактозамином и сиаловой кислотой через аминогруппу.

Кроме того, благодаря наличию сиаловой кислоты гликосфинголипидная макромолекула имеет отрицательный заряд, который влияет на определенные межклеточные взаимодействия. Вследствие нарушения биохимического равновесия у опухолевых организмов, изменяются межклеточные взаимодействия, когда в крови увеличивается количество сиаловой кислоты с гликолипидными связями.

Были тщательно разработаны несколько методов по определению в крови содержания сиаловой кислоты с гликолипидной связью. Согласно методу Свеннерхольда плазма крови экстрагируется со 2:1 смесью хлороформа и метанола для отделения гликосфинголипидов от других липидных фракций крови, сиаловая кислота, содержащая гликосфинголипиды, измеряется колориметрической реакцией, приводящей к резорцину в присутствии соли двухвалентной меди. Согласно Katopodis гликосфинголипидная фракция осаждается в первую очередь от плавающего на поверхности метанола с фосфорновольфрамовой кислотой, а повторно растворенный осадок используют в колориметрическом определении. Таким способом можно увеличить метод Свеннерхольма. Однако, определить сиаловую кислоту можно также ферментативными реакциями. Согласно этому методу (Clin. Chim. Acta. 1980, v. 108, р. 493-498) гликопротеин расщепляется энзимом нейраминидазой, а освободившаяся сиаловая кислота реагирует с ферментом N-ацетилнейраминокислотной альдолазой до получения соли пировиноградной кислоты и N-ацетил-N-маннозамина. Полученная в результате реакции соль пировиноградной кислоты окисляется пируватоксидазой до пероксида, который превращается в окрашенное вещество с помощью р-хлорфенола и 4-аминоантипирина в присутствии пероксидазы, а количество образованного окрашенного вещества определяется при 505 нм.

Все вышеописанные методы имеют один общий недостаток, который заключается в том, что ошибка определения превышает 20% Так как согласно известным способам между нормальным и патологическим уровнями сиаловой кислоты существует довольно небольшое различие (значения ниже 18 мг% можно отнести к норме, а превышающие 20 мг% в патологии), результаты можно отнести к существованию злокачественных болезней, но нельзя применять в качестве однозначного доказательства существования опухолевых или свободных от опухолей состояний. Другим недостатком является тот факт, что некоторые доброкачественные заболевания, такие как артриты, псориаз, язва, воспалительные процессы и гинекологические расстройства, могут быть также результатом увеличения в крови содержания сиаловой кислоты (J. Clin. Chem. Biochem, 1984, v. 22, р. 647-651). Следовательно, способ не позволяет определить содержание в крови сиаловой кислоты, а может только обусловить подозрение на раковое заболевание, но не может сформировать основу для установления более точного диагноза.

Цель изобретения разработка аналитического способа, который может привести к более надежному диагнозу, дающему возможность распознать наличие опухоли на очень ранней стадии, дающего надежную информацию по различению одного от другого опухолевых и безопухолевых состояний и дающего возможность сделать вывод о вероятной локализации опухоли.

Изобретение основано на том, что при соответствующей рН и ионной концентрации соли различных металлов способны отделять вполне определенные низкие фракции от сложных соединений гликолипидных комплексов, присутствующих в крови. При раковых заболеваниях различного происхождения или в случае неопухолевых болезней сиаловая кислота связана предпочтительнее с различными фракциями гликолипидов, следовательно, измеряя содержание сиаловой кислоты в отделенной гликолипидной субфракции или определяя природу гликолипида, с которым образует связь сиаловая кислота, можно сделать вывод об увеличении уровня сиаловой кислоты, характерного либо для опухолевого процесса, либо для доброкачественного заболевания (воспалительный процесс, артрит, гинекологические расстройства и др.), а в случае опухолевых процессов можно сделать вывод о вероятной локализации опухоли или о существовании метастаз. Очевиден также тот факт, что, применяя соли определенных металлов, в первую очередь соли кадмия, в качестве осадителя, можно распознать опухолевое состояние на более ранней стадии, чем в случае использования фосфорновольфрамовой кислоты в качестве осадителя.

Таким образом, изобретение касается способа для избирательного определения в крови гликолипидных комплексов, несущих сиаловую кислоту, в первую очередь в крови человека, в которой сыворотка разбавлена водой, затем экстрагирована несмешиваемым с водой органическим растворителем или смесью растворителей до удаления промежуточных липидов, гликопротеиновая фракция, содержащая гликолипиды, несущие сиаловую кислоту, осаждается из водной фазы, осажденная фракция вторично растворяется, а содержание сиаловой кислоты в растворе или количество и качество гликолипида, несущего сиаловую кислоту, определяется известным методом. Согласно изобретению водорастворимые соли одно-, двух- и трехвалентных металлов, кроме щелочных металлов, используются в качестве осадителя в количестве соответствующем окончательной концентрации ионов металла в смеси (0,005-0,1 моль/л), а процесс осаждения осуществляется при рН 1,5-8,0.

Наиболее предпочтительным способом является способ, используемый для удаления промежуточных липидов из разбавленной водой сыворотки, согласно которому в качестве экстрагирующего агента используется смесь хлороформа с метанолом в объемном соотношении 2:1. Надосадочный водный метанол в дальнейшем обрабатывается на стадии осаждения, где более низкая фракция, являющаяся раствором хлороформа и промежуточных липидов, отбрасывается. Затем в водной фракции метанола или к его аликвотной пробе добавляется осадитель в количестве, необходимом для получения смеси, содержащей 0,005-0,1 моль/л ионов металла. Предпочтительнее использование водного раствора осадителя. Ниже приведены значения рН осаждения для некоторых ионов металлов.

Ион металла рН Fe²⁺ 3,0-3,5 Fe³⁺ 3,0-5,0 Co²⁺ 4,0-5,5 Ni²⁺ 4,5-5,5 Cd²⁺ 4,5-6,0 Zn²⁺ 1,5-5,0 Ag⁺ 6,0-8,0 Hg²⁺ 1,5-3,0 Cu²⁺ 3,0-4,5
Ca²⁺ 4,5-5,5
Mg²⁺ 5,5-7,0
Получавшийся в результате осадок отфильтровывают, а затем содержание сиаловой кислоты в осадке определяется известным методом, например, на основе цветной фракции с образованием минеральной кислоты, соли двухвалентной меди и резорцина или ферментативным методом (J. Clin. Chim. Acta. 1980, v. 108, р. 493-498), тип и количество гликолипидных связей с сиаловой кислотой определяется известным методом, таким как жидкостная хроматография высокого давления (J. Clin. Chim, 1976, v. 22, р. 1516-1521).

Дифференциальное диагностическое значение метода изобретения можно значительно повысить, если содержание сиаловой кислоты в пробе крови одного и того же происхождения определять последовательно, используя, по меньшей мере, пять ионов различных металлов, что сводится к отношению измеренное значение/нормальное значение, где термин "нормальное значение" относится к статистически рассчитанной непатологической концентрации сиаловой кислоты с использованием концов данных металлов в качестве осадителя. Согласно экспериментальным данным значение (измеренное/нормальное) уменьшается (для локализованных опухолей) в следующем порядке: опухоль молочной железы опухоль толстой кишки опухоль яичников опухоль отдела голова/шея здоровое состояние без наличия опухолей.

Аналогично можно получить дифференциальный диагностический ряд, где согласно изобретению, результаты определения сиаловой кислоты (проводимого, по меньшей мере, с ионами пяти металлов) имеют различия с результатами уже известного определения сиаловой кислоты, где содержание сиаловой кислоты не зависит от ее происхождения. Индивидуальные отклонения также могут иметь дифференциальное диагностическое значение.

Изобретение поясняется примерами, в которых пробы крови подвергались предварительной обработке, а содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось следующим образом.

Для определения брали венозную кровь. После отбора крови проба центрифугировалась в течение 15 мин при скорости 4000 об/мин, 0,6 мл пробы замораживали. Концентрация сиаловой кислоты с липидными связями в пробе, хранящейся при -20^оС, оставалась неизменной в течение 6 мес. До начала проведения анализа пробирки тщательно прополаскивали метанолом, затем высушивались и предварительно охлаждались в холодильнике. Каждая пробирка заполнялась 0,2 мл сывороточной пробы и 0,2 мл дважды дистиллированной воды, смесь перемешивалась в вихревой (завитковой) мешалке в течение 15 с, а затем помещалась в ледяную баню (0^оС). Из сыворотки готовили две параллельные пробы для эксперимента и для контроля.

3 мл предварительно охлажденной смеси хлороформа и метанола (2:1 по объему) заполняли каждую пробирку, содержимое пробирок перемешивали в завитковой мешалке в течение 30 с. Затем пробирки снова помещали в ледяную баню. 0,5 мл предварительно охлажденной до 4^оС дважды дистиллированной воды добавляли к индивидуальной пробе, содержимое пробирок перемешивали в завитковой мешалке в течение 15 с, а затем смеси выдерживались в течение 5 мин при комнатной температуре. После этого пробы центрифугировали в течение 10 мин при скорости оборотов 3000 об/мин. 1 мл надосадочной жидкости осторожно добавляли в пронумерованные пробирки центрифуги, добавляли водный раствор солей металлов в количестве и концентрации, данном в примере, рН смеси доводили до величины, данной в примере, содержимое каждой пробирки центрифуги перемешивали завитковой мешалкой, а затем выдерживали в течение 5 мин.

В конце отстаивания содержимое каждой пробирки центрифугировали в течение 15 мин при скорости 4000 об/мин, затем надосадочная жидкость полностью отделялась от осадка декантированием (надосадочная жидкость сбрасывалась).

Каждый 1 мл трехбуферного раствора вводился в пробирку центрифуги, тем самым вторично растворяя осадок. Такой трехбуферный раствор готовили растворением 10 ммолей три/гидроксиметил/аминометана в 1 л дважды дистиллированной воды и регулированием рН полученного раствора до 8,6.

Стандартная и чистая пробы готовились для фотометрических измерений следующим образом.

50 мг аналитически чистой сиаловой кислоты растворяли в 100 мл дважды дистиллированной воды, полученный раствор использовали в качестве основного раствора для приготовления двух дальнейших разбавлений (концентрации 25 мг/100 мл и 12,5 мг/100 мл) с дважды дистиллированной водой. Стандартные растворы хранили при 4^оС. Пробы стандартных растворов в количестве 0,2 мл с тремя различными концентрациями добавляли в пробирки центрифуги, объем раствора доводили до 1 мл добавлением дважды дистиллированной воды в каждую пробирку. В качестве чистого раствора брали 1 мл дважды дистиллированной воды.

1 мл реакционного раствора резорцина добавляли ко всем пробам (стандартной сыворотке, чистой сыворотке, контрольной сыворотке и исследуемой сыворотке). Реакционный раствор резорцина готовили следующим образом. 2 г аналитически чистого резорцина растворяли в 100 мл дважды дистиллированной воды. 2,49 г безводного сульфата двухвалентной меди растворяли в 100 мл дважды дистиллированной воды. После этого 10 мл раствора резорцина примешивали к 0,25 мл раствора сульфата меди (II) и к 9,75 мл дважды дистиллированной воды, в смесь добавляли 100 мл аналитически чистой концентрированной водной хлористоводородной кислоты.

Пробирки помещали в водяную баню при 100^оС точно на 10 мин. После этого все пробирки сразу же помещали в ледяную баню с температурой 0^оС и выдерживали там 10 мин 2 мл смеси (85:15 по объему) бутилацетата и п-бутанола вводили в каждую пробирку, а содержимое пробирок перемешивали в вихревой мешалке в течение 5 мин. Смесь отстаивали при редком перемешивании, пробы центрифугировались в течение 10 мин при скорости 2500 об/мин, затем из каждой пробирки центрифуги в исследуемую клетку добавляли надосадочную жидкость голубого цвета. Плотность голубого образования не менялась в течение 6 ч.

Фотометрические измерения проводились при длине волны 580 нм. Нулевая точка фотометра была отрегулирована для дважды дистиллированной воды. Далее в зависимости от типа используемого фотометра (однолучевого или двухлучевого) измерение проводилось либо по отношению к импульсу, либо по угасанию луча, вычитаемого из затухания луча измеренной пробы до получения правильной величины Е(правильная) Е(измеренная) Е(затухания).

Содержание сиаловой кислоты рассчитывалось одним из двух следующих методов.

Согласно первому методу по результатам, полученным из стандартных проб сиаловой кислоты известной концентрации, затухание в зависимости от кривых концентрации, выводимые либо графически, либо расчетным путем, из-за степеней разбавления первоначальные концентрации следует вторично рассчитать согласно нижеприведенной таблице.

Из построенной градуировочной кривой, описанной выше, можно определить содержание (А) сиаловой кислоты в надосадочной пробе в объеме 1 мл. Кривая дает содержание сиаловой кислоты в единицах (ug сиаловой кислоты) 1 мл надосадочной жидкости. Содержание сиаловой кислоты в сыворотке крови можно рассчитать по следующей формуле:
Содержание сиаловой кислоты А х 0,72 (мг/100 мл), где А содержание сиаловой кислоты в надосадочной жидкости в единицах, ug/мл;
0,72 фактор сравнения степени разбавления и превращения, мг.

Согласно второму методу расчета используются пробы сыворотки, выбранные для сравнения с известной концентрацией сиаловой кислоты. Из нескольких параллельных измерений фактор F рассчитывается по следующей формуле:
F С_{сравнения}/Е_{сравнения}, где С_{сравнения} содержание сиаловой в пробе сыворотки, выбранной для сравнения в мг/100 мл;
Е_{сравнения} угасание луча в пробе, выбранной для сравнения.

Содержание сиаловой кислоты в исследуемой пробе можно рассчитывать по формуле
Содержание сиаловой кислоты Еm x F (мг/100 мл), где Е измеренное затухание луча исследуемой пробы.

П р и м е р 1. Сыворотка, взятая у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,5 мол/л раствору NiCl₂ при рН 5,5 до образования осадка, осажденная сиаловая кислота измерялась. Получали величину, равную 4,65 мг%
П р и м е р 2. Сыворотка, взятая у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10: 1 к 1,0 моль/л раствору NiCl₂ при рН 5,5 до образования осадка, количество осажденной сиаловой кислоты измерялось. Получали величину, равную 6,43 мг%
П р и м е р 3. Сыворотку, полученную у здорового человека, экстрагировали со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10: 1 к 0,1 моль/л раствору CdCl₂ при рН 5,9 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина равнялась 11,42 мг%
П р и м е р 4. Сыворотку, полученную у здорового человека, экстрагировали со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10: 1 к 0,5 моль/л раствору CdCl₂ при рН 5,5 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина равнялась 10,48 мг%
П р и м е р 5. Сыворотку, взятую у здорового человека, экстрагировали со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол перемешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CdCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина равнялась 14,81 мг%
П р и м е р 6. Сыворотку, полученную у здорового человека, экстрагировали со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10: 1 к 0,1 моль/л раствору FeSO₄ при рН 3,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина равнялась 9,08 мг%
П р и м е р 7. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,5 моль/л раствору FeSO₄ при рН 3,0 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 9,54 мг%
П р и м е р 8. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,1 моль/л раствору FeSO₄ при рН 2,9 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 9,52 мг%
П р и м е р 9. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,1 моль/л раствору ZnCl₂ при рН 2,7 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 6,52 мг%
П р и м е р 10. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,5 моль/л раствору ZnCl₂ при рН 1,9 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 12,34 мг%
П р и м е р 11. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,1 моль/л раствору Pb(NO₃)₂ при рН 4,4 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 8,61 мг%
П р и м е р 12. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,5 моль/л раствору Pb(NO₃) при рН 3,7 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 12,11 мг%
П р и м е р 13. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору Pb(NO₃) при рН 3,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составила 12,35 мг%
П р и м е р 14. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,1 моль/л раствор AgNO₃ при рН 8,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 9,78 мг%
П р и м е р 15. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,5 моль/л раствору AgNO₃ при рН 6,0 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялась. Полученная величина составляла 14,67 мг%
П р и м е р 16. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору AgNO₃ при рН 5,8 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 14,81 мг%
П р и м е р 17. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,1 моль/л раствору HgCl₂ при рН 1,9 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 6,05 мг%
П р и м е р 18. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,5 моль/л раствору HgCl₂ при рН 1,7 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 7,68 мг%
П р и м е р 19. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору HgCl₂ при рН 1,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 11,99 мг%
П р и м е р 20. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,1 моль/л раствору CuSO₄ при рН 4,2 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина соответствовала 10,13 мг%
П р и м е р 21. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,5 моль/л раствору CuSO₄ при рН 3,8 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина соответствовала 10,48 мг%
П р и м е р 22. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CuSO₄ при рН 3,6 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 12,22 мг%П р и м е р 23. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,1 моль/л раствору CaCl₂ при рН 5,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 3,72 мг%
П р и м е р 24. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,5 моль/л раствору CaCl₂ при рН 5,4 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 3,02 мг%
П р и м е р 25. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CaCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 7,05 мг%
П р и м е р 26. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,1 моль/л раствору MgCl₂ до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 4,19 мг%
П р и м е р 27. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 0,5 моль/л раствору MgCl2 при рН 6,7 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 3,61 мг%
П р и м е р 28. Сыворотка, полученная у здорового человека, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору MgCl₂ при рН 6,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 4,81 мг%
П р и м е р 29. Сыворотка, полученная у пациентки с раком молочной железы, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору NiCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 28,87 мг%
П р и м е р 30. Сыворотка, полученная у пациентки с раком молочной железы, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CdCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 41,31 мг%
П р и м е р 31. Сыворотка, полученная у пациентки с раком молочной железы, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору FeSO₄ при рН 2,9 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 33,39 мг%
П р и м е р 32. Сыворотка, полученная у пациентки с раком молочной железы, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору ZnCl₂ при рН 1,7 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 39,41 мг%
П р и м е р 33. Сыворотка, полученная у пациентки с раком молочной железы, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол перемешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору ZnCl₂ при рН 1,7 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 38,90 мг%
П р и м е р 34. Сыворотка, полученная у пациентки с раком молочной железы, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору Pb(NO₃)₂ при рН 3,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 45,02 мг%
П р и м е р 35. Сыворотка, полученная у пациентки с раком молочной железы, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору AgNO₃ при рН 5,8 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 29,58 мг%
П р и м е р 36. Сыворотка, полученная у пациентки с раком молочной железы, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору HgCl₂ при рН 1,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 33,89 мг%
П р и м е р 37. Сыворотка, полученная у пациентки с раком молочной железы,экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CuSO₄ при рН 3,6 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 37,20 мг%
П р и м е р 38. Сыворотка, полученная у пациентки с раком молочной железы, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CaCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 28,18 мг%
П р и м е р 39. Сыворотка, полученная со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору MgCl₂ при рН 6,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 25,67 мг%
П р и м е р 40. Сыворотка, полученная у пациентки с раком молочной железы, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору NiCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 22,09 мг%
П р и м е р 41. Сыворотка, полученная у пациентки с раком яичников, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол, примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CdCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 25,80 мг%
П р и м е р 42. Сыворотка, полученная у пациентки с раком яичников, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору FeSO₄ при рН 2,9 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 18,75 мг%
П р и м е р 43. Сыворотка, полученная у пациентки с раком яичников, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к раствору ZnCl₂ концентрацией 1,0 моль/л, при рН 1,7 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 23,77 мг%
П р и м е р 44. Сыворотка, полученная у пациентки с раком яичников, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору ZnSO₄ при рН 1,7 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 26,87 мг%
П р и м е р 45. Сыворотка, полученная у пациентки с раком яичников, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору Pb(NO₃)₂ при рН 3,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 26,3 мг%
П р и м е р 46. Сыворотка, полученная у пациентки с раком яичников, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору AgNO₃ при рН 5,8 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 28,66 мг%
П р и м е р 47. Сыворотка, полученная у пациентки с раком яичников, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору HgCl₂ при рН 1,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 33,08 мг%
П р и м е р 48. Сыворотка, полученная у пациентки с раком яичников, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CuSO₄ при рН 3,6 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 26,63 мг%
П р и м е р 49. Сыворотка, полученная у пациентки с раком яичников, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CaCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 13,26 мг%
П р и м е р 50. Сыворотка полученная у пациентки с раком яичников, экстрагировалась со смесью хлороформа и метаноле, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору MgCl₂ при рН 6,5 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляет 11,82 мг%
П р и м е р 51. Сыворотка, полученная у пациента с раком в области головы/шеи, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору NiCl₂ при 5,3 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 12,62 мг%
П р и м е р 52. Сыворотка, полученная у пациента с раком отдела голова/шея, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CdCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 21,99 мг%
П р и м е р 53. Сыворотка, полученная у пациента с раком отдела голова/шея, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору FeSO₃ при рН 2,9 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 16,09 мг%
П р и м е р 54. Сыворотка, полученная у пациента с раком отдела голова/шея, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору ZnCl₂ при рН 1,7 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 19,56 мг%
П р и м е р 55. Сыворотка, полученная у пациента с раком отдела голова-шея, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору ZnSO₄ при рН 1,7 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 21,41 мг%
П р и м е р 56. Сыворотка, полученная у пациента с раком отдела голова/шея, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору Pb(NO₃)₂ при рН 3,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 29,98 мг%
П р и м е р 57. Сыворотка, полученная у пациента с раком отдела голова/шея, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору AgNO₃, при рН 5,8 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 14,93 мг%
П р и м е р 58. Сыворотка, полученная у пациента с раком отдела голова/шея, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору HgCl₂ при рН 1,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 18,87 мг%
П р и м е р 59. Сыворотка, полученная у пациента с раком отдела голова/шея, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CuSO₄ при рН 3,6 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 14,70 мг%
П р и м е р 60. Сыворотка, полученная у пациента с раком отдела голова/шея, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CaCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 9,72 мг%
П р и м е р 61. Сыворотка, полученная у пациента с раком отдела голова/шея, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору MgCl₂ при рН 6,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 12,27 мг%
П р и м е р 62. Сыворотка, полученная у пациента с аденокарциномой, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору NiCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 11,77 мг%
П р и м е р 63. Сыворотка, полученная у пациента с аденокарциномой, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CdCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 20,09 мг%
П р и м е р 64. Сыворотка, полученная у пациента с аденокарциномой, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору FeSO₄ при рН 2,9 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 16,13 мг%
П р и м е р 65. Сыворотка, полученная у пациента с аденокарциномой, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору ZnCl₂ при рН 1,7 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 18,69 мг%
П р и м е р 66. Сыворотка, полученная у пациента с аденокарциномой, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору ZnSO₄ при рН 1,7 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 17,15 мг%
П р и м е р 67. Сыворотка, полученная у пациента с аденокарциномой, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору Pb(NO₃)₂ при рН 3,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 22,66 мг%
П р и м е р 68. Сыворотка, полученная у пациента с аденокарциномой, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору AgNO₃ при рН 5,8 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 16,51 мг%
П р и м е р 69. Сыворотка, полученная у пациента с аденокарциномой, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору HgCl₂ при рН 1,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 18,94 мг%
П р и м е р 70. Сыворотка, полученная у пациента с аденокарциномой, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CuSO₄ при рН 3,6 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измеряли. Полученная величина составляла 17,41 мг%
П р и м е р 71. Сыворотка, полученная у пациента с аденокарциномой, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CaCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 9,73 мг%
П р и м е р 72. Сыворотка, полученная у пациента с аденокарциномой, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору MgCl₂ при рН 6,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 7,94 мг%
П р и м е р 73. Сыворотка, полученная у пациента с раком толстой кишки, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору NiCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 20,70 мг%
П р и м е р 74. Сыворотка, полученная у пациента с раком толстой кишки, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CdCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 32,14 мг%
П р и м е р 75. Сыворотка, полученная у пациента с раком толстой кишки, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивался в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору FeSO₄ при рН 2,9 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 24,23 мг%
П р и м е р 76. Сыворотка, полученная у пациента с раком толстой кишки, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивался в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору ZnCl₂ при рН 1,7 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 27,52 мг%
П р и м е р 77. Сыворотка, полученная у пациента с раком толстой кишки, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивался в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору ZnSO₄ при рН 1,7 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты измерялось. Полученная величина составляла 3,63 мг%
П р и м е р 78. Сыворотка, полученная у пациента с раком толстой кишки, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивался в соотношении 10: 1 к 1,0 моль/л раствору Pb(NO₃)₂ при рН 3,5 до получения осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 35,55 мг%
П р и м е р 79. Сыворотка, полученная у пациента с раком толстой кишки, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивался в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствор AgNO₃ при рН 5,8 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 19,46 мг%
П р и м е р 80. Сыворотка, полученная у пациента с раком толстой кишки, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивали в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору MgCl₂ при рН 1,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 31,66 мг%
П р и м е р 81. Сыворотка, полученная у пациента с раком толстой кишки, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивался в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CuSO₄ при рН 3,6 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 32,51 мг%
П р и м е р 82. Сыворотка, полученная у пациента с раком толстой кишки, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивался в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору CaCl₂ при рН 5,3 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измеряли. Полученная величина составляла 18,51 мг%
П р и м е р 83. Сыворотка, полученная у пациента с раком толстой кишки, экстрагировалась со смесью хлороформа и метанола, как описано выше. Надосадочный метанол примешивался в соотношении 10:1 к 1,0 моль/л раствору MgCl₂ при рН 6,5 до образования осадка, содержание сиаловой кислоты в осадке измерялось. Полученная величина составляла 16,68 мг%

Формула изобретения

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ В КРОВИ ГЛИКОЛИПИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ, СОДЕРЖАЩИХ СИАЛОВУЮ КИСЛОТУ, включающий разбавление сыворотки водой, экстракцию водонесмешиваемым органическим растворителем или смесью растворителей до удаления промежуточных липидов, осаждение из водной фазы липопротеиновой фракции, содержащей гликопиды, несущие сиаловую кислоту, растворение ее с последующим определением содержания в растворе сиаловой кислоты или количества и качества гликолипидов, несущих сиаловую кислоту, отличающийся тем, что осаждение липопротеиновой фракции проводят водорастворимой солью металлов, принадлежащих к группам I/б, II, II/б, IV, VII/б и VIII/б Периодической системы, хлорной, серной и азотной кислот в конечной концентрации в смеси 0,009 0,09 моль/л при pH 1,5 8,0.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при использовании в качестве осадителя водорастворимой соли Fe²⁺ осаждение осуществляют при pH 3,0 3,5, Fe³⁺ 3,0 5,0, Co²⁺ 4,0 5,5, Ni²⁺ 4,5 5,5, Cd²⁺ 4,5 6,0, Zn²⁺ - 1,5 5,0, Ag⁺ 5,8 8,0, Hg²⁺ 1,5 3,0, Cu²⁺ 3,0 4,5, Ca²⁺ 4,5 5,5, Mg²⁺ - 5,5 7,0.

РИСУНКИ

Рисунок 1