Способ определения холестерина

 

Использование: медицина, ферментативный анализ. Цель изобретения - повышение точности способа. Сущность изобретения: процесс осуществляют в две стадии, на первой из которых ведут обработку образца при температуре 20-55°С в течение 2-20 минут реагентом, содержащим холестеринэстеразу, буферную смесь и детергент , при этом происходит гидролиз этерифицированного холестерина. На второй стадии осуществляют окисление холестерина с помощью холестериноксидазы и регистрацию скорости образования пероксида водорода. Регистрацию ведут фотометрическим методом.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4850152/14 (22) 22.05.90 (46) 15.01,93, Бюл. N 2 (71) МГУ им. M.B.Ëîìîíoñîâà (72) lQ.В,Родионов, Н.Ю.Филиппова, А.Ф.Духо в ич и Н. Н, Уга ро ва (56) EP N 265933, кл, С 12 Q 1/60, 1988. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА (57) Использование: медицина, ферментативный анализ, Цель изобретения — повыИзобретение относится к области ферментативного анализа и может быть использовано в клинических исследованиях при диагностике атеросклероза, диабета, мочекаменной болезни, функциональных расстройств печени и некоторых инфекционных заболеваний, Известен способ определения холестерина, основанный на измерении скорости выделения пероксида водорода. Определение холестерина данным способом, которой по своей сути наиболее близок к заявляемому изобретению, выполняется следующим образом. Аликвота исследуемого образца, например, сыворотки крови, вносится в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую реакционную смесь следующего состава:

Буферная смесь 0,1 М, рН 5-9

Субстраты пероксидазы

Соли желчных кислот 1 — 20 мМ, Неионные детергенты — 0,1 — 10 г/л

Холестеринэстераза 100 — 30000 ед/л

Холестериноксидаза 100 — 30000 ед/л

Я2 1788466 А1 (я)л G 01 N 33/48, 33/92, С 12 Q 1/60, 1/28, 1/46 шение точности способа, Сущность изобретения: процесс осуществляют в две стадии, на первой из которых ведут обработку образца при температуре 20-55 C в течение

2 — 20 минут реагентом, содержащим холестеринэстеразу, буферную смесь и детергент, при этом происходит гидролиз этерифицированного холестерина, На второй стадии осуществляют окисление холестерина с помощью холестериноксидазы и регистрацию скорости образования пероксида водорода. Регистрацию ведут фотометрическим методом.

Пероксидаза 2500 ед/л, Далее проводят регистрацию изменения оптической плотности при температуре 2040 С в течение 2 — 15 мин, Недостатки рассматриваемого способа определения холестерина заключаются в следующем, Оптимальные условия проведения реакций гидролиза и окисления не идентичны (не совпадают оптимум рН, температурный оптимум, концентрации детергентов), что приводит к использованию больших количеств ферментов.

Проведение определения холестерина рассматриваемым способом основано на одновременном проведении 3-х последовательных реакций. Исходно в исследуемых образцах содержится как этерифицированный. так и неэтерифицированный холестерин, причем соотношение этих форм холестерина может меняться в зависимости от сыворотки, Кроме того, скорость гидролиза этерифицированного холестерина холестеринэстеразой зависит от длины и

1788466 степени насыщенности остатка жирной кислоты. Поэтому начальная скорость образования пероксида водорода зависит не

1олько от общей концентрации холестерина, но и от соотношения разных форм холестерина в образце, что приводит к снижению достоверности определения.

Целью изобретения является повышение точности определения.

Поставленная цель достигается предложенным способом, заключающимся в том, что исследуемую пробу добавляют в водную среду инкубации состава: не менее 0,01 М буфера с рН 6,5-8, не менее 5 г/л холевокислого натрия и не менее 10 ед/л холестеринэстеразы, инкубируют при температуре

22 — 55 C не менее 2 мин, после чего аликвоту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую не менее 0,01 м/л буфера с рН

6,5 — 8, не менее 2 г/л холевокислого натрия, не менее 0,3 ед/л пероксидазы, не менее 0,5 ед/л холестериноксидазы, не менее 0,08 г/л

4-аминоантипирина и не менее 0,03 г/л 8оксихинолина, с последующей спектрофотометрической регистрацией скорости реакции образования пероксида водорода.

Предло>кенный способ отличается от известного порядком проведения операций, а именно, разделением стадии гидролиза и экстракции со стадией окисления, что дает возможность осуществлять гидролиз в оптимальных условиях при температуре 2555 С не менее 2 мин, а также соотношением реагентов в гидролизующей и окисляющей смесях.

Эти отличия позволяют повысить точность определения и существенно сократить расход реагентов.

Пример 1. Образец сыворотки (0,02 мл) вносят в пробирку с реакционной смесью (0,2 мл), содержащей 0,01 M К-фосфатного буфера рН 7,0, холевокислого натрия 10 г/л, 30 ед/л холестеринэстеразы из поджелудочной железы. Параллельно в раствор того же состава вносят 0,02 мл стандартного раствора холестерина (5 мМ). Пробы инкубируют 10 мин при 45 С. Затем из каждой пробирки отбирают по 0,1 мл реакционной смеси, вносят - в спектрофотометрическую кювету, содержащую 0,7 мл раствора следующего состава:

0,03 М К-фосфатный буфер, рН 7.0, 5 г/л холевокислого натрия, холестериноксидазу (5 ед/л), пероксидазу (20 ед/л), 4-аминоантипирин (0,16 г/л), 8-оксихинолин (0,20 г/n).

Для каждого из образцов измеряют начальную скорость изменения оптической плотности в течение 2 мин при длине волны 500

25 Пример 3. Условия эксперимента аналогичны условиям в примере 1, за исклю30

55

20 нм, Результаты измерений приведены в табл, 1, Концентрацию холестерина рассчитывают по уравнению: (холестерин) = / х 5,0 мМ, /ст где (холестерин) — концентрация холестерина в исследуемой пробе;

V>«» — скорость изменения оптической плотности для исследуемой пробы; . V — скорость увеличения оптической плотности в случае стандартного раствора холесте рина, Пример 2. Условия проведения эксперимента аналогичны таковым в примере

1, за исключением того, что при анализе стандартной сыворотки (5 мМ) используют различные значения рН при проведении первой стадии реакции гидролиза, Результаты измерений приведены в табл. 2.

Из полученных данных следует, что оптимальные значения рН для проведения реакции гидролиза составляют 6,5 — 8,0 чением того, что используют различные концентрации холевокислого натрия в гидролизующей смеси. Результаты измерений приведены в табл. 3.

На основании данных, приведенных в табл. 3, оптимальная концентрация холевокислого натрия в гидролизующей смеси составляет не менее 5 г/л, Пример 4. Условия проведения эксперимента аналогичны таковым в примере

1, за исключением того, что изменяют температуру при которой проводится гидролиз (табл, 4).

Из данных приведенных в табл, 4 следует, что полный гидролиз этерифицированного холестерина достигается при температуре 20 — 55 С при концентрации холестеринэстеразы из поджелудочной железы в гидролизующей смеси 2 мг/мл (активность холестеринэстеразы 0,03 ед/мл), Пример 5. Условия измерения те же, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию холестеринэстеразы в гидролизующей смеси. Данные представлены в табл, 5.

На основании данных, приведенных в табл. 5, оптимальная концентрация холестеринэстеразы составляет не менее 10 ед/л при температуры 45 С и времени гидролиза

10 мин.

Пример 6, Условия проведения реакции аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что изменяют состав ре1788466

55 акционной смеси для проведения реакции окисления холестерина: (табл. 6), варьируя концентрацию холевокислого натрия.

Таким образом, оптимальная концентрация холевокислого натрия в реакционной смеси при окислении холестерина составляет не менее 2,0 г/л, Пример 7. Условия проведения эксперимента такие же как в примере 1, но изменяется концентрация 8-оксихинолина.

Результаты измерений представлены в табл, 7 получены для стандартной сыворотки с концентрацией 5 мМ, Таким образом, оптимальной концентрацией 8-оксихинолина является не менее

0,3 г/л.

Пример 8, Условия измерения те же, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию 4-аминоантипирина, Данные, измеренные для стандартной сыворотки 5 мМ, приведены в табл 8.

Из данных, приведенных в табл, 8, следует, что оптимальной концентрацией 4аминоантипирина является концентрация не менее 0,08 г/л, Пример 9. Условия эксперимента те

>ке, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию пероксидазы в реакционной смеси. Данные приведены в табл. 9.

Полученные данные показывают, что оптимальной концентрацией пероксидазы в реакционной смеси является не менее 0,3 ед/л.

Пример 10. Условия эксперимента те

>ке, что в и. 1, за исключением того, что все сыворотки параллельно измеряют и по способу прототипа, а при измерении по заявляемому способу используют концентрации холестеринэстеразы и холестериноксидазы те же, что в прототипе -- 1 ед/мл. При измерении по способу прототипа к 20 мкл образцов сывороток добавляли 2 мл смеси следующего состава:

0,1 M фосфатный буфер рН 6,7

8,6 мМ трибромгидроксибензойная кислота

1,6 мМ 4-аминоантипирин

3 мМ холевокислый натрий

0,1 % полиэтиленгликоль 6000

0,1 / трезит

1000 ед/л холестеринэстераза

1000 ед/л холестериноксидаза

2500 ед/л пероксидаза

Инкубировали при 30 С и через 2 минуты регистрировали фотометрически скорость образования пероксида водорода. В эксперименте использовались следующие контрольные сыворотки: фирмы "Boehringer

mannheim" Precilip Е1 (концентрация холестерина 8,5 мМ), фирмы "Labsystem" norma (концентрация холестерина 3,7 мМ), sepocont P (концентрация холестерина 4,7 мМ, фирмы "Hyland" паталогическая (концентрация холестерина 5,0 мМ). Результаты измерений приведены в таблице. 10.

Из приведенных в табл. 10 данных следует, что при измерении по способу-прототипу полученные результаты зависят от состава липопротеидных комплексов в сыворотках крови, а при измерении по заявляемому способу точность результатов во всех сыворотках одинакова, что свидетельствует о большей точности предложенного способа.

Формула изобретения

Способ определения холестерина, включающий инкубацию исследуемой пробы в среде, содержащей буфер, субстрат пероксидазы, соль желчных кислот, холестеринэстеразу, холестериноксидазу и пероксидазу и последующую спектрофотометрическую регистрацию скорости образования перекиси водорода, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, исследуемую пробу добавляют в водную среду инкубации, содержащую буфер с рН 6,5 — 8,0 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 5 г/л, холестериноксидазу не менее 10 ед/л, инкубируют не менее 2 мин при 25 — 55 С, затем аликвоту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету, содержащую буфер с рН 8,0 — 8,6 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 2 г/л, пероксидазу не менее 0,3 ед/л, холестериноксидазу не менее 0,5 ед/л, 4аминоантипирин в концентрации не менее

0,08 г/л и 8-оксихинолин в концентрации не менее 0,03 г/л.

1788466

Табпица1

ТаблицаЗ

Таблица4 пи холе- пМ

1! !!

I !

) ( !! !

, 10

178846б

Та блица 5

Таблицаб

Таблица7

Таблица8

1788466

Таблица9

Т а б л и ц а 10

Составитель Н.Угарова

Техред М.Моргентал Корректор Э. Лончакова

Редактор

Заказ 71 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101