Способ выделения днк из молок осетровых рыб (его варианты)

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для промышленного получения натриевой соли ДНК для фармакологии. Сущность изобретения состоит в том, что молоки осетровых рыб гомогенизируют, депротеинизацию ДНК осуществляют непосредственно в гомогенате, смесь обрабатывают раствором хлористого натрия при 55-60°С, затем обрабатывают кизельгуром, концентрируют на электродиализной установке либо в мембранном аппарате и озвучивают. ДНК из раствора осаждают спиртом и высушивают в сушильном шкафу при температуре 40°С. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для промышленного получения натриевой соли ДНК для фармакологии.

Известен способ получения ДНК из молок осетровых рыб путем гомогенизации молок, промывания их физраствором, депротеинизации комплекса ДНК-белок протосубтилином; выделенным из Bacillus subdilis (авт.св. СССР N 780444, С 07 Н 21/04).

Известен также способ получения ДНК из молок осетровых рыб, заключающийся в том, что гомогенизацию молок проводят в стандартном цитратно-солевом буфере (ССЦ): 0,87% хлорида натрия, 0,54% цитрата натрия, центрифугируют, депротеинизацию проводят путем прогревания натрия (конечная концентрация 0,61% ). Затем к суспензии добавляют NaCl и цитрат натрия до конечных концентраций 14,6% и 24% соответственно, и прогревают в течение 1-5 ч при 60^оС. Для отделения белков раствор после охлаждения пропускают через колонку с кизельгуром, получая на выходе колонки раствор ДНК (Хим.фарм. журнал, 1982, N 7, стр. 835-838).

Известен также способ получения ДНК из молок осетровых рыб, заключающийся в том, что молоки гомогенизируют в стандартном цитратно-солевом буфере клеточные ядра собирают центрифугированием, гомогенизируют и проводят депротеинизацию раствором додецилсульфата натрия при температуре около 55^оС. Охлажденную смесь интенсивно перемешивают с кизельгуром (15,5%) и отфильтровывают. Целевую ДНК высаживают спиртом в соотношении 1:1. Высокополимерную ДНК растворяют и озвучивают на магнитострикторе, фильтруют и стерильно разливают по флаконам, получая субстанцию 0,6% в 1/10 растворе ССЦ (авт.св. СССР N 1410494, C 07 H 21/04, 1986).

Предлагаемый способ заключается в том, что молоки осетровых рыб гомогенизируют в стандартном растворе цитратно-солевого буфера (ССЦ), имеющего состав: хлорид натрия 0,87% натрия цитрат 0,54% Гомогенат прогревают при температуре 55-60^оС в присутствии додецилсульфата натрия (конечная концентрация 0,6% ) в течение 1,5 ч. К смеси затем добавляют раствор хлористого натрия до конечной концентрации 14,6% и прогревают 1,5 ч при 55-60^оС. Полученную смесь обрабатывают кизельгуром и фильтруют. Полученный раствор ДНК пропускают через камеры электродиализной и/или ультрафильтрационной установок.

Полученный раствор обрабатывают ультразвуком, фильтруют, при необходимости концентрируют, осаждают спиртом, осадок промывают 96% спиртом, высушивают в сушильном шкафу при температуре 40^оС. Заявленный способ позволяет получить сухой порошок ДНК. При этом выделенная ДНК имеет следующую характеристику: Молекуляр- (3,0-5,0)10⁵ Дальтон ная масса Гипорхромный не менее 37% эффект Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. 1,2 кг свежезамороженных молок осетра измельчают и гомогенизируют в 2 л цитратно-солевого раствора, состоящего из 0,15 М хлористого натрия и 0,0021 М цитрата натрия, при комнатной температуре. Полученный гомогенат заливают в реактор, где находится 34 л цитратно-солевого раствора. Затем добавляют 4 л 6%-ного раствора додецилсульфата натрия в 45%-ном растворе ректификата этилового спирта (240 г в 4 л 45% спирта). Полученную реакционную массу нагревают в течение 1-1,5 ч до 60-62^оС и выдерживают при этой температуре 1,5 ч при перемешивании якорной мешалкой. После чего, в раствор добавляют 40 л 5 м раствора хлористого натрия и перемешивают в течение 1,5 ч. Затем полученную реакционную массу охлаждают до 12-16^оС, перемешивают с кизельгуром в соотношении 10: 1 высокооборотной мешалкой и фильтруют на нутч-фильтре.

Полученный фильтрат высокополимерной ДНК порциями в количестве 2,5 л подвергают электродиализному концентрированию в многокамерном аппарате-электродиализаторе, фильтр-прессного типа, состоящего из чередующихся мембран типа МА-40 и МК-40 с промежуточными рамками из паронита и сепараторами-турбулизаторами. Катодом служит пластина из нержавеющей стали марки Х18Н10Т с рабочей поверхностью 4 дм², анодом платинированный титан с той же поверхностью. Электродиализатор состоял из 7 камер "обессоливания" и 8 камер "концентрирования", а также двух электродных камер. Рабочая поверхность каждой мембраны 4 дм².

Реакционную массу высокополимерной ДНК насосом прокачивают через камеры "обессоливания" электродиализатора с линейной скоростью 2,3 см/с, одновременно через камеры "концентрирования" насосом прокачивают 0,5%-ный раствор хлористого натрия, а через электродные камеры водопроводную воду. При температуре 15-20^оС через электродиализатор пропускают постоянный ток, сила которого соответствует плотности тока 1,5 А/дм². В ходе электродиализа поддерживают рН раствора в интервале 6,5-7,5 добавлением разбавленной соляной кислоты (1:3). Поддержание температуры в процессе электродиализа осуществляют подачей захоложенной воды в змеевики промежуточных емкостей. В процессе электродиализного концентрирования получают 1,2 л высокополимерной ДНК. Продолжительность процесса составляет 4,0 часа, удельная производительность аппарата 1,0 л/м² ч, а энергоемкость процесса 216,0 Вт ч/л. При этом выход по току составляет 70,0% Сконцентрированный раствор высокополимерной ДНК заливают в модуль магнитостриктора и подвергают ультразвуковой обработке в течение 45 мин. после чего фильтруют через миллипоровый фильтр и концентрируют в 3 раза на установке "БИОКОН". Концентрат высаживают спиртом в соотношении 1:2. Осадок собирают центрифугированием, промывают 96% спиртом и высушивают в сушильном шкафу при температуре 40^оС. Получают сухой порошок натриевой соли ДНК.

П р и м е р 2. 1,2 кг свежезамороженных молок осетра измельчают и гомогенизируют в 2 л цитратно-солевого раствора, состоящего из 0,15 М натрия хлорида и 0,0021 М натрия цитрата при комнатной температуре. Полученный гомогенат заливают в реактор, где уже находится 34 л цитратно-солевого раствора. Затем добавляют 4 л 6%-ного раствора натрия додецилсульфата в 45% растворе ректификата этилового спирта (240 г в 4 л 45% спирта). Полученную массу нагревают за 1-1,5 ч до 60-65^оС и перемешивают якорной мешалкой в течение 1,5 ч. Затем добавляют 40 л 5 М раствора NaCl и перемешивают в течение 1,5 ч. Затем полученную массу охлаждают до 12-16^оС, перемешивают с кизельгуром в соотношении 10:1, на высокооборотной мешалке (миксер) и фильтруют на нутч-фильтре фильтрующий материал: бельтинг, фильтровальная бумага, бязь.

Полученный таким образом фильтрат высокополимерной ДНК порциями в количестве 2,0 л подвергают ультрафильтрационному концентрированию в мембранном аппарате плоскорамного типа. Рабочая поверхность мембран составляет 12 дм². Концентрирование раствора ДНК осуществляют при температуре 20-24^оС, линейной скорости раствора 2 см/с и давлении 3,0 кг/см². Поддержание температуры в процессе ультрафильтрации осуществляют подачей захоложенной воды в змеевик промежуточной емкости. В процессе концентрирования получают 0,4 л раствора высоко- полимерной ДНК. Продолжительность процесса составляет 24 мин, а удельная производительность аппарата 40 л/м²ч. Сконцентрированный раствор высокополимерной ДНК заливают в модуль магнитостриктора и озвучивают в течение 45 мин, после чего фильтруют через миллипоровый фильтр. Фильтрат обрабатывают спиртом, а выпавший осадок собирают центрифугированием, промывают 96%-ным спиртом и высушивают в сушильном шкафу при температуре 40^оС.

Сухой порошок ДНК растворяют и анализируют. Молекулярную массу ДНК определяли с помощью гельэлектрофореза в 1%-ной агарозе. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить препарат ДНК, пригодный для целевой фармакологии и медицины.

Формула изобретения

1. Способ выделения ДНК из молок осетровых рыб путем гомогенизации замороженных молок в цитратно-солевом растворе, разбавления гомогената цитратно-солевым раствором, перемешивания гомогената с раствором 6%-ного додецилсульфата, инкубации при 60^oС в течение 1,5 ч с последующим добавлением к реакционной смеси 5М раствора хлористого натрия, инкубации и перемешивания смеси в течение 1,5 ч, охлаждения, сорбции белка на кизельгуре, фильтрации и обработки фильтрата, содержащего целевой продукт, 98%-ным этиловым спиртом, отличающийся тем, что реакционную смесь перемешивают с кизельгуром в соотношении 10 1, фильтруют, подвергают электродиализу при 15-20^oС, плотности тока 1,5 А/дм², затем обрабатывают ультразвуком, фильтруют через миллипоровый фильтр, фильтрат осаждают спиртом в соотношении 1:2, а осадок, содержащий целевой продукт, собирают центрифугированием и после обработки спиртом сушат при 40^oС.

2. Способ выделения ДНК из молок осетровых рыб путем гомогенизации замороженных молок в цитратно-солевом растворе, разбавления гомогената цитратно-солевым раствором, перемешивания гомогената с раствором 6%-ного додецилсульфата в течение 1,5 ч с последующим добавлением к реакционной смеси 5 М раствора хлористого натрия, инкубации и перемешивания смеси в течение 1,5 ч, охлаждения, сорбции на кизельгуре, фильтрации и обработки фильтрата, содержащего целевой продукт, 98%-ным этиловым спиртом, отличающийся тем, что реакционную смесь перемешивают с кизельгуром в соотношении 10:1, фильтруют, а фильтрат подвергают ультрафильтрационному концентрированию в мембранном аппарате плоскорамного типа при 20-24^oС, давлении 3 кг/см², диализат обрабатывают ультразвуком, фильтруют через миллипоровый фильтр, фильтрат обрабатывают спиртом, а осадок, содержащий целевой продукт, собирают центрифугированием и после обработки спиртом сушат при 40^oС.

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 6-2001

(73) Патентообладатель:ООО "Научно-производственное фармацевтическое предприятие "ПОЛИДАН" (RU)

Договор № 11437 зарегистрирован 27.10.2000

Извещение опубликовано: 27.02.2001        

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 25.05.2007

Извещение опубликовано: 10.09.2008        БИ: 25/2008

---