Способ получения ингибитора калликреина плазмы крови

 

Объект относится к способам получения биологически активных соединений, действие которых направлено на блокирование процесса тромбообразования путем ингибирования калликреина плазмы крови, ключевого фермента активации контактной стадии внутреннего механизма свертывания крови. Целью изобретения является получение высокоспецифического ингибитора калликреина плазмы крови, источником для получения которого может служить: секрет слюнных желез, экстракты из медицинских пиявок, а также экстракты разрушенных клеток бактерии-симбионта Aeromonus hydrophila. Цель достигается тем, что перечисленные экстракты инкубируют с калликреином плазмы крови, иммобилизованным на твердом носителе, а затем целевой продукт элюируют буфером, диализуют против воды и лиофилизируют. 4 табл.

Изобретение относится к способам получения биологически активных соединений и может быть применено в гематологии, в медицинской промышленности, ветеринарии, в медицине и в лабораторной практике.

Ингибитор калликреина, выделяемый из медицинской пиявки, специфичен в отношении блокирования активности только калликреина плазмы крови.

Целью изобретения является выделение из секрета слюнных желез, из экстрактов, из медицинских пиявок или из бактерии Aeromonus hydrophile методом афинной хроматографии ингибитора калликреина плазмы крови, подавляющего амидазную и кининогеназную активность фермента, как следствие этого, ингибирующего активацию внутреннего механизма системы свертывания крови.

Цель достигается тем, что секрет слюнных желез или водные экстракты, получаемые из медицинских пиявок или из бактерии-симбионта пиявки, инкубируют с препаратом калликреина, иммобилизованном на твердом носителе, при перемешивании в течение 15 мин 48 ч при температуре 2-25^оС. Раствор удаляют центрифугированием, а твердый носитель многократно промывают физиологическим раствором до отрицательной реакции на белок. С твердого носителя ингибитор калликреина элюируют буфером, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют.

Из табл. 1 видно, что ингибитор калликреина, выделенный из секрета слюнных желез медицинской пиявки более, чем в 80 раз превышает активность исходного секрета, а ингибитор, выделенный из экстракта из медицинских пиявок более, чем в 200 раз превышает ингибирующую активность исходного экстракта в отношении подавления амидазной активности препарата калликреина плазмы крови.

Ингибитор калликреина подавляет не только амидазную, но и кининогеназную активность калликреина плазмы крови. Кининогеназную активность калликреина плазмы определяли по сокращению изолированного рога матки крысы, оценивая уменьшение количества брадикинина, выщепляемого из кининогена калликреином в присутствии анализируемых препаратов по сравнению с контрольными экспериментами, в которых вместо белковых препаратов использовали физиологический раствор. Рассчитывали степень ингибирования кининогеназной активности калликреина плазмы крови по количеству белка анализируемых препаратов, которое вызывает ингибирование образования 1 мг экв брадикинина (табл.2).

Поскольку известно, что калликреин плазмы крови является ключевым ферментом, обеспечивающим активацию внутреннего механизма свертывания крови, неудивительно, что выделенный из пиявки ингибитор калликреина блокирует активацию контрольной стадии свертывания крови, представляющую начальный этап внутреннего механизма активации этого процесса. Ингибитор калликреина замедляет время рекальцификации плазмы крови, активированной декстран-сульфатом (табл.3).

Ингибирование активации внутреннего механизма свертывания крови оценивали по количеству белка анализируемых препаратов, способных удлинять в два раза время свертывания плазмы, активированной декстран-сульфатом, по сравнению с контролем.

П р и м е р 1. 5 мл секрета слюнных желез медицинских пиявок инкубируют при перемешивании с 1 мл калликреин-сефарозы при 37^оС в течение 2 ч, осадок отделяют центрифугированием, промывают водой и элюируют фосфатным буфером рН 8,5. Диализуют против воды, лиофилизируют. Выход препарата 0,35 мг.

П р и м е р 2. 200 мл экстракта из медицинских пиявок инкубируют при перемешивании с 8 мл калликреина, иммобилизованного на сефарозе в течение 20 ч, осадок отделяют центрифугированием, промывают водой и элюируют ингибитор калликреина фосфатным буфером рН 8,5. Диализуют против воды и лиофилизируют. Выход препарата 0,50 мг.

В качестве источника для получения ингибитора калликреина из медицинской пиявки использовали также бактерию-симбионт, обитающую в кишечном канале медицинской пиявки Aeromonus hydrophila. Бактерию-симбион культивировали обычным способом на твердой или на жидкой среде, разрушали ультразвуком, лиофильно высушивали, экстрагировали физиологическим раствором и использовали для получения ингибитора калликреина.

В табл.4 представлены характеристики ингибитора калликреина, выделенного из экстракта из бактерии-симбионта медицинской пиявки.

Резкое увеличение активности препарата ингибитора калликреина, выделенного из бактериального экстракта, по сравнению с исходным экстрактом объясняется очень низким содержанием этого ингибитора в бактериальных клетках.

П р и м е р 3. Бактериальные клетки Aeromonas hydrophila, выращенные на твердой среде, суспендирют в дистиллированной воде и разрушают ультразвуком при 35 кГц в течение 1-2 мин. Твердый материал отделяют при продолжительном центрифугировании на холод при 25000 об/мин. Надосадочную жидкость используют для выделения ингибитора калликреина. 200 мл экстракта инкубируют в 30 мл калликреина, иммобилизованного на сефарозе, промывают водой до отрицательной реакции на белок, и элюируют ингибитор калликреина фосфатным буфером рН 8,5. Диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют. Из 4 л экстракта удается получить около 0,2 мг ингибитора калликреина.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА КАЛЛИКРЕИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ из медицинской пиявки, заключающийся в том, что из пиявки выделяют секрет слюнных желез, или измельченную ткань пиявки, или культуру клеток бактерии-симбионтов пиявки, полученное сырье инкубируют с препаратом калликреина, иммобилизованном на твердом носителе, центрифугируют, осадок дистиллированной водой или физиологическим раствором, а целевой продукт элюируют буферным раствором фосфата pH 8,5 и лиофилизируют.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2