Способ получения биологически активных веществ из ламинарии
Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа получения биологически активных веществ из ламинарии. Цель изобретения - интенсификации переработки сырья для одновременного получения нескольких биологических активных веществ и повышение выхода водорастворимого полисахаридного комплекса. Сущность: последовательное экстрагирование измельченных слоевищ Zaminaria saccharina u z. digitata с целью получения по единой технологии продукта: маннита, водорастворимого полисахарида комплекса, ламинарана, фукоидана и альгината натрия. Положительный эффект заключается в одновременном получении нескольких продуктов, обладающих сильно выраженным слабительным действием, а также альгината натрия, обладающего радионуклидсвязывающим действием, а также в повышении выхода водорастворимого полисахаридного комплекса до 12,6%. 36 табл.
Изобретение относится к методам одновременного получения маннита, водорастворимого полисахаридного комплекса, ламинарана, фукоидана, альгината натрия из беломорских водорослей рода Laminaria и может быть использовано в медицине, фармации, микробиологии, в производствах, связанных с радиоактивными металлами.
Известен способ получения полисахаридов из морской капусты Laminaria saccharina L. ) путем измельчения, промывки слоевищ морской капусты, экстракции горячей водой при 80oC методом настаивания или противоточной перколяции, отделения экстракта от сырья, упаривания экстракта до соотношения 1: 0,8-1: 1,2, прибавления к горячему экстракту 96%-ного этилового спирта в соотношении экстракт: этанол 1: 1. Затем образовавшуюся смесь отстаивают, отделяют нижний слой взвеси, центрифугируют и после отделения маточного раствора осадок промывают 96% этиловым спиртом. Промытый осадок сушат, измельчают. Выход готового продукта составляет 5,6% к загруженному сырью. Полученный комплекс полисахаридов оказывает слабительное действие и известен как лекарственный препарат "Ламинарид". Данный способ получения близок к заявляемому и выбран за прототип. Недостатками указанного способа являются: а) получение только одного продукта из водорослей (полисахаридов), при этом отходами производства являются ценные биологически активные вещества - маннит, ламинаран, фукоидан, альгинат натрия; б) низкий выход полисахаридов (5,6% к сырью); в) неполное осаждение полисахаридов этанолом за счет недостаточного количества этанола; г) потеря этанола при добавлении его к горячему концентрированному экстракту для осаждения полисахаридов. Целью изобретения является комплексная переработка беломорских водорослей с целью одновременного получения маннита, водорастворимого полисахаридного комплекса, ламинарана, фукоидана, альгината натрия, повышение выхода водорастворимого полисахаридного комплекса, расширение сырьевой базы, повышение биологической активности целевого продукта, расширение спектра биологического действия. Цель достигается тем, что способ одновременного получения маннита, водорастворимого полисахаридного комплекса, ламинарана, фукоидана, альгината натрия, обладающих слабительным, гиполипидемическим, радионуклидсвязывающим, гепатозащитным, противоязвенным действием, из беломорской ламинарии (естественной смеси двух видов ламинарии - Laminaria saccharina L. и Laminaria digitata L.) осуществляют путем измельчения сырья, последовательного экстрагирования 90-96%-ным этанолом, горячей водой и 1,5% раствором карбоната натрия; этанольное извлечение концентрируют и кристаллизуют из него маннит; из водного экстракта 96%-ным этанолом осаждают водорастворимый полисахаридный комплекс; при этом оставшийся спиртовый маточный раствор упаривают и 80% этанолом осаждают ламинаран и фукоидан, для разделения последних полученный осадок обрабатывают 0,4%-ным раствором соляной кислоты и добавляют 0,5 М раствор цетавлона для переведения кислых полисахаридов в осадок, экстракт обрабатывают этанолом (для высаждения ламинарана), а оставшийся осадок вновь растворяют в 0,4% растворе соляной кислоты и обрабатывают 70% этанолом (фукоидан); из карбонатного извлечения после предварительной обработки концентрированной серной кислотой, раствором двууглекислого натрия получают альгинат натрия. Согласно заявляемому способу сначала проводят сушку сырья при 50oC, после чего освобождают его от механических примесей. Затем сырье измельчают до размера частиц 3 мм и экстрагируют 90-96%-ным этанолом в соотношении сырье: этанол 1: 6 в аппарате Cокслета при температуре кипения экстрагента в течение 3 ч. Профильтрованный спиртовый экстракт упаривают до сгущенного остатка, кристаллизуют, выпавшие кристаллы маннита очищают перекристаллизацией. Далее, после удаления остатков спирта из водорослей, последние экстрагируют двукратно водой в соотношении 1:10 при температуре 80oC в течение 30 мин, водные экстракты объединяют, фильтруют, упаривают под вакуумом при остаточном давлении 0,3 атм и температуре 70oC до плотности 1,05-1,06 г/см3; водорастворимый полисахаридный комплекс осаждают 96% этанолом из охлажденного экстракта в соотношении экстракт:этанол 1:2, комплекс фильтруют, трехкратно очищают 96% этанолом, сушат. Оставшийся после осаждения водорастворимого полисахаридного комплекса спиртовый маточный раствор упаривают до 1/10 первоначального объема, после чего сгущенный экстракт обрабатывают 80% этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3. Полученный осадок (ламинаран и фукоидан) центрифугируют. Для разделения ламинарана и фукоидана отцентрифугированный осадок обрабатывают 0,4% раствором соляной кислоты при соотношении осадок:раствор соляной кислоты 1:5 при комнатной температуре в течение 2,0 ч; затем к полученному раствору добавляют 0,5 М раствор цетавлона для переведения кислых полисахаридов в осадок. Осадок отделяют, а надосадочную жидкость обрабатывают 80% этанолом (для высаждения ламинарана) в соотношении надосадочная жидкость:этанол 1:3. Полученный ламинаран фильтруют, очищают 96% этанолом, сушат. Осадок, образованный после добавления цетавлона, растворяют в 0,4% растворе соляной кислоты в соотношении осадок:раствор соляной кислоты 1:10 и обрабатывают 70% этанолом в соотношении раствор: этанол 1:3, выпадает осадок фукоидана, который фильтруют, очищают, сушат. После этого оставшийся жом водорослей экстрагируют 1,5% раствором карбоната натрия в соотношении 1:20 при температуре 50oC в течение 1 ч; водно-щелочной экстракт фильтруют, фильтрат обрабатывают концентрированной серной кислотой, выпавший при этом осадок отделяют, обрабатывают 1,5%-ным раствором карбоната натрия и получают альгинат натрия осаждением 96% этанолом в соотношении раствор:этанол 1:5. Альгинат натрия фильтруют, сушат. Преимущества заявляемого способа заключаются в комплексной переработке ламинарии: одновременном получении из беломорской ламинари пяти продуктов: маннита, водорастворимого полисахаридного комплекса, ламинарана, фукоидана, альгината натрия. Все целевые продукты обладают биологическим действием. Описано слабительное действие только для полисахаридного комплекса из ламинарии. Разработанная нами технологическая схема позволяет получить целевые продукты с выраженным слабительным действием, превосходящим действие официального препарата "Ламинарид": маннит проявляет слабительное действие, превосходящее "Ламинарид" на 41,1%, водорастворимый полисахаридный комплекс - на 5,2-60,0% (в зависимости от используемых методик испытаний и видов животных), ламинаран и фукоидан - на 20,5%, альгинат натрия - на 141,1%. Кроме того, водорастворимый полисахаридный комплекс обладает выраженным радионуклидсвязывающим, гиполипидемическим, гепатозащитным и противоязвенным действием, превосходящим или повторяющим аналогичное действие официальных препаратов. Альгинат натрия также проявляет выраженное радионуклидсвязывающее и гипохолестеринемическое действие. Все виды биологического действия для всех целевых продуктов, кроме слабительного действия полисахаридного комплекса, нами установлены впервые. Сочетание слабительного и радиопротекторного действия для альгината натрия и водорастворимого полисахаридного комплекса способствует быстрому выведению этими продуктами радионуклидов из организма. Кроме того, заявляемый способ обеспечивает получение целевых продуктов с высоким выходом (в пересчете на сухое исходное сырье): маннит - 7,85%; водорастворимый полисахаридный комплекс - 12,60%; ламинаран - 4,53%; фукоидан - 2,14%; альгинат натрия - 12,41%. Предлагаемый способ может быть использован в условиях промышленной переработки ламинарии. В данном способе используется естественная смесь двух видов сырья, произрастающих в морском бассейне Белого моря: Laminaria saccharina L. и Laminaria digitata L. Полученные целевые продукты были подвергнуты качественному и количественному анализу (табл. 1,2,3,4,5,6,7,8,9). I. Маннит. Идентификацию полученного маннита проводили методом бумажной хроматографии. Количественное содержание маннита определяли методом обратной йодометрии в присутствии индикатора крахмала. Титрование проводили до появления зеленой окраски раствора. Содержание маннита составило 99,56%. Таким образом, коэффициент распределения (Rf), температура плавления, удельное вращение, зольность полученного маннита, соответствующие аналогичным показателям стандартного маннита, а также высокое количественное содержание маннита свидетельствуют о высокой чистоте полученного продукта. II. Водорастворимый полисахаридный комплекс. Идентификацию полисахаридов проводили с помощью цветных реакций, хроматографически. Результаты анализа водорастворимого полисахаридного комплекса, приведенные в табл.3,4, аналогичны для препарата "Ламинарид", что свидетельствует о соответствии полученного полисахаридного комплекса препарату "Ламинарид". Количественное содержание полисахаридов определяли по сумме восстанавливающих сахаров по реакции с пикриновой кислотой, спектрофотометрически. Содержание восстанавливающих сахаров составило 76,55% в водорастворимом полисахаридном комплексе. В препарате "Ламинарид" содержание восстанавливающих сахаров достигало 25,64%, т.е. содержание суммы редуцирующих сахаров в образце, полученном по заявляемому способу, в 3 раза превышает этот показатель по сравнению со способом, принятым за прототип. Таким образом, в результате анализа водорастворимого полисахаридного комплекса идентифицированы полисахариды, установлено высокое содержание редуцирующих сахаров и показано соответствие полученного водорастворимого полисахаридного комплекса официальному препарату "Ламинарид". III. Ламинаран. Полученные показатели (таблица 5) согласуются с известными литературными данными. Моносахаридный состав полученного ламинарана определяли с помощью гидролиза 2 н. серной кислотой при 100oС в течение 6 ч с последующей нейтрализацией гидролизата карбонатом бария методом бумажной хроматографии. Результаты представлены в табл.6. Полученный ламинаран подвергали ферментативному расщеплению с помощью 1,3-







Изучение слабительного действия путем определения суточной массы кала после перорального введения альгината натрия в дозе 200 мг/кг в опытах на 36 белых крысах показало, что масса кала в опытах с альгинатом натрия составила 4,1



Гипохолестеринемическое действие альгината натрия изучалось на 30 белых крысах с гиперхолестеринемией, вызванной однократным внутрибрюшинным введением тритона в дозе 50 мг/кг. Установлено, что пероральное введение животным с гиперхолестеринемией альгината натрия в дозе 200 мг/кг обусловило снижение в сыворотке крови общего холестерина до 1,96



Изучение радионуклидсвязывающей активности (РНСА) альгината натрия проводилось по разработанной в Киевском государственном институте усовершенствования врачей методике, которая защищена авт.св. N 274598. В качестве индикатора использовали стронций-85. Эталоном сравнения служил цитрусовый пектин. Результаты испытаний представлены в табл.32. Полученные результаты позволяют заключить, что альгинат натрия обладает радионуклидсвязывающей активностью, превышающей такую активность эталано - цитрусовго пектина - на 45,36%. Результаты изучения слабительного, гипохолестеринемического, радионуклидсвязывающего действия альгината натрия, а также его низкая токсичность позволяет оценить его как перспективное лечебное средство. 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВОДОРАСТВОРИМОГО ПОЛИСАХАРИДНОГО КОМПЛЕКСА
а) ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ
В опытах на 36 белых крысах массой 180-240 г методом Кербера при пероральном введении установлено для водорастворимого полисахаридного комплекса LD50>3500 мг/кг. В опытах на 36 белых мышах массой 20-40 г методом Кербера при внутрибрюшинном введении для данного комплекса установлено LD50>1000 мг/кг. Согласно классификации токсических веществ исследованное вещество следует отнести к группе малотоксичных веществ. б) СЛАБИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ
Слабительное действие изучаемого вещества изучалось на белых крысах и собаках описанными методами. В одном случае (опыты на 18 крысах) о слабительной активности веществ судили по величине пассажа (в мм) по кишечнику с использованием метки. Метка делалась путем введения крысам зондом в желудок 5% взвести активированного угля. За 20 мин до перорального введения исследуемых веществ в дозе 200 мг/кг в объеме 2 мл водного раствора. Животных забивали через 2 ч декапитированием и замеряли степень продвижения активированного угля (метки). В других опытах (опыты на 18 крысах и 12 собаках) о слабительном действии исследуемых веществ судили по величине дефекации животных (количестве и консистенции кала), помещенных в специальные для этих целей клетки. В этом случае животным перорально вводились исследуемое вещество в дозе 200 мг/кг в объеме 2 мл крысам или 300 мл собакам водного раствора с последующим (через 24 ч) взвешиванием фекалий (в г) и описанием их консистенции. В контрольных опытах в соответствующих количествах вводился физиологический раствор. Установлено, что при введении водорастворимого комплекса крысам пассаж по кишечнику достигал 42,5



0,7г против 3,8 0,5 г в контрольных опытах (Р<0,05) и 9,5
0,7 г в опытах с официнальным слабительным препаратом ламинарид (Р>0,05), а дефекация у собак соответственно - 182,5
8,4 г против 85,0
3,4 г (Р<0,001) и 114,0
3,9 г (Р<0,001). Таким образом, под влиянием водорастворимого полисахаридного комплекса слабительный эффект усиливался в зависимости от методики опыта и вида животных на 114,7 - 523,5% по сравнению с контрольными опытами, превосходя на 5,2-60,0% действие официнального слабительного препарата ламинарида.
Гепатозащитное действие водорастворимого комплекса изучалось в опытах на белых крысах с дистрофическим поражением печени, вызванным трехразовым пероральным введением через день четыреххлористого углерода по 0,3 мл на 100 г массы тела в 50% масляном растворе. Исследуемый комплекс в дозе 200 мг/кг вводился перорально в 2 мл водного раствора в течение 12 дней, из которых в последние 6 дней одновременно вводился четыреххлористый углерод. В качестве веществ сравнения использовались официнальный препарат ламинарид (в дозе 200 мг/кг) - прототип по строению и способу получения и официнальный гепатозащитный препарат силибор (в терапевтической дозе - 10 мг/кг) - прототип по действию. В сыворотке крови определялись активность аланинаминотрансферазы (АлТ) с помощью набора реактивов Bachringer Mannheim (ФРГ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) с помощью набора реактивов "Лахема" (ЧССР), и общего билирубина по Йендрашку в модификации Л.Т. Лукьянова. Кроме того, в ткани печени определяли содержание триглицеридов по Готтфрицу и Розенбергу в модификации Н. А. Сентебовой и Н.Б. Самецкой. Как видно из табл.33, гепатозащитное действие исследованного комплекса превосходило влияние ламинарида и мало отличалось по эффективности от официнального гепатозащитного протектора силибора, обусловливая нормализацию нарушенных в условиях экспериментальной дистрофии печени показателей аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, триглицеридов и общего билирубина в крови и триглицеридов в тканях печени. Эти результаты свидетельствуют, что выделенный из беломорских водорослей водорастворимый полисахаридный комплекс обладает отчетливыми гепатозащитными свойствами, приближающимися по своей выраженности к действию официнального препарата силибора. г) ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ
Гиполипидемическое действие водорастворимого полисахаридного комплекса исследовалось в опытах на белых крысых с моделью гиперлипидемии, вызванной ежедневным, в течение 4-х дней, пероральным введением 2 мл смеси спиртового и масляного растворов вытамина D2 из расчета 80000 ЕД на 100 г массы тела и холестерина по 200 мг/кг. Параллельно животным в желудок с помощью зонда вводился исследуемый комплекс из расчета 200 мг/кг в 2 мл водного раствора. В качестве веществ сравнения использовались официнальный препарат ламинарид (в дозе 200 мг/кг) - прототип по строению и способу получения и официнальный противоатеросклеротический препарат полиспонин (в терапевтической дозе - 10 мг/кг) - прототип по действию. В сыворотке крови декапитированных крыс определяли общий холестерин по Ильку и триглицериды с помощью набора реактивов фирмы "Лахема" (ЧССР). В тканях аорты животных определяли содержание холестерина по Т.Н. Ловягиной и Э.Б. Баньковской. Результаты опытов, представленные в табл.34, свидетельствуют о том, что водорастворимый полисахаридный комплекс наиболее заметно понижает уровень триглицеридов в крови, слабее - снижает в крови уровень холестерина и не оказывает существенного влияния на содержание холестерина в тканях аорты. Подобное же влияние, но более слабое в отношении триглицеридов присуще ламинариду. Гипохолестеринемическая активность водорастворимого полисахаридного комплекса была несколько выше официнального противоатеросклеротического препарата полиспонина. В отличие от последнего гипохолестеринемическое действие комплекса сочеталось со значительным гипотриглицеридемическим влиянием. Это позволяет считать, что исследованный комплекс из беломорских водорослей по своей гиполипидемической эффективности превосходит действие официнального препарата полиспонина. г) ПРОТИВОЯЗВЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ
Исследование противоязвенного действия водорастворимого полисахаридного комплекса в сопоставлении с действием препарата "Ламинарид" проводилось на 30 белых крысах массой 185-210 г, у которых язвы желудка вызывались путем сочетания голодания и введения гистамина согласно рекомендациям руководства. Для этого в первые сутки животные полностью голодали, получая лишь воду. На вторые и третьи сутки полное голодание, сочетающееся с подкожным введением утром и вечером гистамина по 0,4 мл 0,1% раствора (из расчета 0,2 мг на 100 г массы). Все эти животные были разбиты на три группы по 10 крыс в каждой. Одна группа крыс в течение вышеуказанных трех суток получала перорально один раз в сутки по 0,5 г водорастворимого полисахаридного комплекса с 5 мл воды. Вторая группа крыс в аналогичных условиях по 0,5 г препарата ламинарид с 5 мл воды. Третья группа крыс была контрольной. На четвертые сутки все животные забивались декапитацией. После вскрытия проводилось микроскопическое исследование слизистой желудка с помощью лупы. У животных обнаруживались главным образом на малой кривизне желудка и в привратнике геморрагические эрозии и язвы, количество которых было различным у разных групп животных. Характерно, что у крыс, получавших водорастворимый комплекс и препарат ламинарид, в полости желудка обнаруживалось большое количество слизи. Результаты опытов представлены в таблице 35. Как видно из представленных данных, количество язв и эрозий было существенно ниже у животных, получавших исследуемое вещество, по сравнению с контрольными животными. Причем эффективность действия водорастворимого комплекса из водорослей и препарата ламинарид оказалось одинаковым. Таким образом, следует сделать вывод о наличии у водорастворимого комплекса из беломорских водорослей, равно как и у препарата ламинарид, выраженной противоязвенной активности, что, по видимому, связано с их обволакивающими и адсорбирующими свойствами. е) РАДИОНУКЛИДСВЯЗЫВАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ
Изучение радионуклидсвязывающей активности (РНСА) водорастворимого комплекса (ВК) типа "Ламинарид" из беломорских водорослей проводилось по разработанной в Киевском государственном институте усовершенствования врачей методике, которая защищена авт.св. N 274598. В качестве индикатора использовали стронций-85. Эталоном сравнения служил цитрусовый пектин. Результаты испытаний представлены в табл.36. Полученные результаты позволяют заключить, что образец ВК типа "Ламинарид", выделенный из беломорских водорослей, обладает высокой радионуклидсвязывающей активностью, превосходящей такую активность эталона - цитрусового пектина - на 280,78%. Анализ результатов исследований фармакологической активности водорастворимого полисахаридного комплекса из беломорских водорослей позволяет прийти к заключению о полифункциональности в действии данного объекта и его высокой эффективности: ему свойственно слабительное, радионуклидсвязывающее, гепатозащитное, гиполипидемическое и противоязвенное влияние, обычно превосходящее по своей силе соответствующие прототипы по строению (ламинарид) и по действию (силибор, полиспонин, цитрусовый пектин). Таким образом, заявляемый способ обеспечивает следующий положительный эффект:
1. Обеспечивается комплексная переработка смеси ламинарий Белого моря, при которой получаются одновременно 5 продуктов: маннит, водорастворимый полисахаридный комплекс, ламинаран, фукоидан, альгинат натрия. В то время как известный способ позволяет получить только полисахаридный комплекс "Ламинарид", а другие биологически активные вещества остаются в отходах производства;
2. Повышение выхода водорастворимого полисахаридного комплекса: в заявляемом способе выход - 12,60%, в известном способе - 5,6%, т.е. выход полисахаридного комплекса в заявляемом способе в 2,25 раза выше, чем в известном. Кроме того, заявляемый способ обеспечивает высокие выходы и других веществ: маннит 7,85% , ламинаран 4,53% , фукоидан 2,14%, альгинат натрия 12,41%. 3. Расширение сырьевой базы. Впервые в качестве источника сырья используется естественная смесь двух видов ламинарий (Laminaria saccharinа и Lam. digitata L. ), образующих заросли в бассейне Белого моря. Кроме того, заявляемый способ позволит применительно к условиям Архангельского опытного водорослевого комбината переработать беломорскую ламинарию, имеющую ежегодные многотоннажные сырьевые запасы. 4. Повышение биологической активности. Водорастворимый полисахаридный комплекс типа "Ламинарид", полученный по заявляемому способу оказывает слабительное действие, превосходящее такое действие эталонного официнального препарата "Ламинарид" на 5,2-60,0% (в зависимоси от методики опыта и вида животных). 5. Расширение спектра биологического действия. Впервые установлено:
а) Слабительное действие маннита, которое превышает действие "Ламинарида" 41,1%;
слабительное действие ламинарана и фукоидана, превосходящее действие официнального слабительного препарата "Ламинарид" - на 20,5%;
слабительное действие альгината натрия, превосходящее действие "Ламинарида" - на 141,1%;
б) радионуклидсвязывающее действие альгината натрия, которое превосходит такое действие эталона - цитрусового пектина - на 45,36%;
радионуклидсвязывающее действие водорастворимого полисахаридного комплекса, которое превосходит аналогичное действие эталона - цитрусового пектина - на 280,78%;
в) гипохолестеринемическое действие альгината натрия, который вызывает значительное снижение общего холестерина в крови, по-существу обеспечивая нормализацию его содержания у животных с гиперхолестеринемией;
гиполипидемическое действие водорастворимого полисахаридного комплекса, который наиболее заметно понижает уровень триглицеридов в крови, слабее - снижает уровень холестерина в крови. Причем гипохолестеринемическая и противоатеросклеротическая активности водорастворимого полисахаридного комплекса были выше аналогичного действия препарата "Ламинарид" и официнального противоатеросклеротического препарата полиспонин;
г) гепатозащитное действие водорастворимого полисахаридного комплекса, превышающее аналогичное действие "Ламинарида" и приближающееся по своей выраженности к действию официнального гепатозащитного протектора силибора;
д) противоязвенное действие водорастворимого полисахаридного комплекса. При наличии широкого спектра биологического действия исследуемые целевые продукты оказались практически нетоксичными, что позволило их рекомендовать как эффективные полифункциональные средства. При этом особенно благоприятным является сочетание слабительного и радионуклидсвязывающего действия, которое способствует быстрому связыванию и выведению радионуклидов.
Формула изобретения
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11