Способ получения производных гризеолевой кислоты

 

Сущность изобретения: продукт формулы I, где R-алкил; R₁ -бензил или метил. Реагент 1: соответствующий диалкил-N⁶-цианогризеолат-N¹-оксид. Реагент 2: соединение R₁X . Условия реакции: в присутствии органического основания триалкиламина в амиде кислоты при комнатной температуре. Соединения проявляют способность ингибировать активность фосфодиэстеразы. Структура соединения формулы I (см.рис.) . 1 табл.

Изобретение относится к способу получения ряда новых производных гризеолевой кислоты.

Гризеоловая кислота является соединением нуклеозидного типа, имеющим основание аденина и две группы карбоновой кислоты. Она впервые была описана inter alia в спецификации Европейской патентной заявке N 293229А, но ее структура не была известна на этой стадии. Ее структура была впервые описана в патенте США N 4460765 (принадлежащем заявителям).

Некоторые производные гризеоловой кислоты были в последующем описаны в патентной заявке США N 664866, 1984 г, и там также описывается структура гризеоловой кислоты.

Другие производные гризеолевой кислоты, конкретно дигидродезоксигризеолевая кислота и ее соли и сложные эфиры описаны в патентной заявке США N 734868.

В соответствии с рекомендациями Международного объединения чистой и прикладной химии (IUPAC), соединения изобретения названы как производные гризеолевой кислоты (или дигидродезоксигризеолевой кислоты), принимая гризеоловую кислоту в качестве исходной структуры. Применяемая система нумерации представлена в патентной заявке США N 664866.

Гризеолевая кислота и производные гризеолевой кислоты из патентных заявок США N 664866 и N 734868, а также производные изобретения проявляют способность ингибировать активность фосфодиэстеразы, специфической к различным циклическим нуклеотидам, например, 3^l , 5^l-циклической аденозии монофосфат (cAMP)фосфодиэстеразы (PDE) или 3^l , 5^l-циклический гуанозин монофосфат (cGMP) PDE и может, таким образом, увеличивать уровень циклического нуклеотида, напримеp cAMP или cGMP, в клетках пациента, к которому применено такое соединение.

Хорошо известно, что cAMP, который очень широко распространен в тканях животных, функционирует в качестве второго носителя и занимает промежуточное положение по действию для большого числа гормонов; в результате это сАМР имеет различное очень важное физиологическое и биохимическое значение.

Кроме того, известно, что он воздействует на или принимает участие в: делении, пролиферации и дифференциации клеток; систолической системе, особенно миокардо, гематопозис; различные функции центральной нервной системы; иммунные реакции; и выделение инсулина и гистамина. Его концентрация в тканях, и следовательно, его действие на эти различные функции, зависят от баланса между энзимом, который синтезирует сАМР (то есть аденилат циклаза) и энзимом, который разлагает сАМР, cGMP, PDE. Ингибитор против сАМР PDE будет увеличивать уровень сАМР в клетках и, таким образом, может использоваться для различных терапевтических целей, например: в лечении сердечно-сосудистых заболеваний; как антиастатический агент; как мышечный редаксант; как психотропный или нейротропный агент; как антивоспалительный агент; в терапии рака; и для лечения диабетов.

Функции воздействия других циклических нуклеотидов, например сGMP к настоящему времени изучены в меньшей степени. Однако, как полагают, как и сАМР. Следовательно, ингибирование PDE, специфических к другим циклическим нуклеотидам будет приводить к терапевтическим воздействиям, подобных воздействиям за счет ингибирования сАМР PDE. Поскольку функции воздействия таких других циклических нуклеотидов находятся в стадии объяснения, возникает потребность ингибирования PDE, связанных с такими другими нуклеотидами, ингибиторы которых проявляют увеличенную специфичность и тем или иным PDE других нуклеотидов, а не к PDE сАМР; действительно, развитие таких ингибиторов может даже помочь или стимулировать исследование таких других циклических нуклеотидов.

В дополнение к гризеоловой кислоте и ее производным, другие соединения, как известно, ингибируют PDE сАМР и cGMP, и эти соединения включают папаверин, дипириадамо и некоторые соединения, которые относятся к составным основаниям нуклеиновых кислот, такие как терфилин или М В 22,948 /Kukovetz et al, naunun - schmiedeberg's et reh Pharmacol, 310, 129 (1979)/.

Заявитель открыл ряд соединений, которые относятся к гризеоловой кислоте и дигидродезоксигризеоловой кислоте и которые обладают активностью гризеоловой кислоты и дигидродезоксигризеоловой кислоты.

Некоторые из этих соединений неожиданно проявляют увеличенную активность против сGMP PDE, чем против сАМР PDE. Некоторые соединения настоящего изобретения, сохраняя целевую активность, являются более ценными как промежуточные в получении других соответствующих целевых соединений.

Целью настоящего изобретения является получение производных гризеоловой кислоты и солей и сложных эфиров этих соединений.

Кроме того, целью настоящего изобретение является получение производных гризеоловой кислоты, которые проявляют способность ингибировать активность PDE, которые разлагают циклические нуклеотиды, например, сАМР или сGMP PDE.

Целью изобретения является способ получения этих соединений формулы I где R - представляет собой алкил, R₁ - бензил или метил.

Соединения, которые могут быть получены предлагаемым способом, являются ценными промежуточными продуктами для получения производных гризеоловой кислоты, имеющих в качестве базового фрагмента гуаниновую группу. Производные гризеоловой кислоты с адениновым основанием являются мощными ингибиторами с ГМФ фосфодиэстеразы. Заменой аденинового основания в известных промежуточных соединениях хуаниновым основанием становится возможным получение производных гризеоловой кислоты с хуаниновым основанием. Такие соединения проявляют сильную активность в качестве ингибиторов сГМФ фосфодиэстеразы.

Соединения формулы I могут быть превращены в производные гризеоловой кислоты с заместителем во 2-положении обработкой в присутствии основания.

Соединения изобретения имеют ряд асимметричных атомов углерода в своих молекулах и могут, следовательно, существовать в виде различных стереоизомеров.

Изобретение включает как индивидуальные изомеры, так и смеси этих изомеров. Гризеоловая кислота, будучи натуральным продуктом, является единственным изомером, в котором оба 2^l и 7^l атома углерода находятся в R - конфигурации; соединения, полученные из гризеоловой кислоты, могут сохранить такую же конфигурацию или могут иметь инвертированную конфигурацию у одного или более асимметричных атомов углерода.

Как указывалось, гризеоловая кислота представляет собой известное соединение, раскрытое, например, в описании Европейского патента N 29.329 или в описании патента США N 4 460 765. Дигидродезоксигризеоловая кислота раскрыта в опубликованном Европейском патенте N 0162715, опубликованном после установления приоритета. Как гризеоловая кислота, так и дигидродезоксигризеоловая кислота могут быть получены путем культивирования подходящих микроорганизмов, относящихся к виду Streptomyces особенно Streptomyces griscoaurantianes SANK 64479 (депонированных 9-го октября 1979 г в ферментационном исследовательском Институте, Агентство промышленной науки и технологии, Япония, откуда они могут быть предоставлены в распоряжение потребителя под каталожным номером FERM-P5223 и 22-го октября 1980 г. в Сельскохозяйственной исследовательской службе, Пеория, США, откуда они могут поставляться под каталожным номером NRRh 12314). Все подробности, касающиеся характеристики Streptomyces griscoaurantiaues SANK 63479 приведены в публикации Европейского патента N 29329А и в описании патента США N 4 460 765.

Соединения общей формулы I где R и R₁ имеют указанные значения, получают обработкой соединения формулы II где R - имеет приведенное значение, бензилгалогенидом в присутствии органического основания - триалкиламина в амиде кислоты в качестве растворителя, при комнатной температуре в течение времени 4-2,5 ч.

Время, требуемое для проведения такой реакции, может изменяться в широком диапазоне в зависимости от многих факторов, главным образом, от природы реагентов и температуры реакции; однако, обычно достаточно проводить реакцию в течении 1-20 ч.

После завершения реакции целевой продукт можно выделять из реакционной смеси обычными способами. Так, например, реакционную смесь при необходимости промывают водой, а затем растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток можно очистить различными способами, такими как перекристаллизация и различные хроматографические методики, например, на хроматографической колонке или с помощью препаративной тонкослойной хроматографии для получения целевого соединения.

Как указывалось ранее, соединения общей формулы I являются промежуточными продуктами для получения биологически-активных производных гризеоловой кислоты, для которых возможны различные терапевтические применения, например, при лечении сердечно-сосудистых заболеваний; в качестве противоастматических агентов; в качестве релаксантов гладкой мускулатуры; в качестве психотропных или невротропных агентов; в качестве противовоспалительных агентов при лечении рака и при лечении диабетов.

Получение различных соединений настоящего изобретения иллюстрируется далее в примерах. Получение некоторых исходных материалов иллюстрируется в последующих препаративных примерах.

П р и м е р 1. 1(а) Диметил-1^l -деаденино-1⁶ -ацетокси-4^l , 5^l-дигидро-О² ', О⁷' диацетилгризеолат .

2 мл концентрированной серной кислоты добавляют к раствору 500 мг диметил-6-дезамино-6-окси-4^l , 5' -дигидро-O²', O⁷' -диацетилгризеолата (полученного как описано в Приготовлении 2) в 100 мл смеси 4:1 по объему уксусной кислоты и уксусного ангидрида, и полученную смесь выстаивают при комнатной температуре в течение 14 ч в атмосфере азота.

К реакционной смеси добавляют 15 г ацетата натрия, и полученный растворитель выпаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в насыщенном водном растворе бикарбоната натрия, и полученный раствор трижды экстрагируют метилен - хлоридом. Метиленхлоридные экстракты объединяют и сушат над безводным сульфатом магния. Затем растворитель выпаривают при пониженном давлении. Остаток очищают на хроматографической колонке с силикагелем, элкируя смесью циклогексан: этилацетат 2:1. В результате выпаривания растворителя на второй фракции после элюирования получают 292 мг указанного в заграфии соединения.

ЯМР спектр (CDCl₃) м.д.: 2,44-1H, дублет дублетом, y=6,4 и 14,7 Гц/; 2,65 /1H, дублет дублетов, y= 14,7 и 3,0 Гц/; 4,98 /1H дублет дублетов, y=2,5 и 6,4 Гц/; 5,02 /1H, дублет дублетов, y= 2,9 и 4,0 Гц/; 5,15 /1H, дублет дублетов, y=4,0 и 2,5 Гц/; 5,72 /1H, синглет/; 6,29 /1H, дублет, y=2,9 Гц/ Масс-спектр (м/е): 474 3M+M3) .

Масс-спектр (далее используется сокращение: масс-спектр с бомбардировкой быстрыми электронами: FAB Масс-спектр) с бомбардировкой быстрыми электронами м/е): 431 (М⁺); 1(в) Диметил-1^l -деаденино-1^l -ацетокси-4^l ,5^l -дигидро-О² ',О⁷' -диацетилгризеолат.

Первую фракцию, выделенную при хроматографировании на колонке, как описано в примере 1(а), концентрируют, выпаривая при пониженном давлении, до получения 33 мг указанного в заглавии соединения.

ЯМР спектр (CDCl₃) м.д.: 2,67 /1H, дублет дублетов, y=7,4 и 15,1 Гц/; 2,98 /1H, дублет дублетов, y= 15,1 и 2,9 Гц/; 4,94-4,99 /2H, мультиплет/; 5,05-5,07 /1H, мультиплет/; 5,61 /1H-синглет/; 6,38 /1H, дублет, y=4,9 Гц/.

Масс-спектр (м/с): 474 (M+M3).

FAB масс-спектр (м/е): 431 (M+).

1(c) Диметил-1^l -деаденино-1^l -ацетокси-4 ,5 -дигидро-О²', О⁷'-дибензоилгризеолат.

Концентрированную серную кислоту (2 мл) добавляют при охлаждении на льду к раствору 400 мг диметил/6-дезамино-6-окси-4^l ,5^l -дигидро-О² ',О⁷'- дибензоилгризеолата), полученного по способу, аналогичному описанным в примерах получения 1-3, 5 и 7, однако, используя в примере получения 2-бензоилхлорид вместо уксусного ангидрида, растворенного в 80 мл смеси 4:1 по объему уксусной кислоты и уксусного ангидрида, и полученной смеси дают выстаиваться при комнатной температуре в течение 14 ч. Затем реакционную смесь смешивают с 15 мг ацетата натрия и концентрируют, выпаривая при пониженном давлении. Остаток растворяют в смеси метиленхлорида и насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и трижды экстрагируют метиленхлоридом. Метиленхлоридные экстракты объединяют и сушат над безводным сульфатом магния, а затем растворитель выпаривают при пониженном давлении. Остаток очищают на хроматографической колонке с силикагелем, элюируют смесью 2:1 циклогексана и этилацетата, а фракции, содержащие указанное в заглавии соединение, концентрируют, выпаривая при пониженном давлении до полученной 243 г указанного в заглавии соединения.

Спектр ЯМР (CDCl₃) м.д.: 2,50-2,60 /1H, мультиплет/; 2,96-3,04 /1H, мультиплет/; 5,06-5,16 /2H, мультиплет/; 5,48-5,52 /1H, мультиплет/; 5,88 /1H, синглет/, 6,50-6,58 /1H, мультиплет/.

Б.Ф. C₂₇H₂₆O₁₂.

П р и м е р 2. Диметилгризеолат-N^l -оксид.

8,14 г диметилгризеолата (полученного как описано в Приготовлении 1) суспендируют в метаноле. Добавляют 6,90 г метахлорпербензойной кислоты, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем растворитель отгоняют при пониженной давлении. Когда растворитель уже почти отогнав, добавляют 300 мл диэтилового эфира и комки в растворе измельчают шпателем до полного исчезновения. Полученную смесь фильтруют, затем полученный остаток промывают 100 мл диэтилового эфира и сушат до получения 7,81 г белого порошкообразного вещества. Этот порошок растворяют при нагревании в 200 мл метанола и 300 мл метиленхлорида насколько возможно тщательно, а затем растворитель отгоняют при пониженном давлении с аспиратором для снижения объема оставшегося раствора приблизительно до 50 мл. Полученные кристаллы отфильтровывают до получения 6,31 г указанного в заглавии соединения в виде белых порошкообразных к кристаллов.

Спектр ЯМР (CD₃)₂ SO/, м.д.: 3,63 /3H, синглет/, 3,78 /3H, синглет/, 4,60 /1H, дублет, y=5,0 Гц/, 4,67 /1H, синглет/, 4,15 /1H, дублет, y=2,2 Гц/, 5,90 /1H, дублет дублетов, y= 2,2 и 5,0 Гц/, 6,53 /1H, синглет/, 8,53 /1H, синглет/, 8,72 /1H, синглет/.

П р и м е р 3. Диметил-1^l -деаденино-1^l-/2-амино-/1,2,4/оксадиазоло [3,2-i] пурин-7-ил/гризеолата гидробромид.

8,46 г диметилгризеолат-N^l -оксида (полученного по способу примера 2) суспендируют в 400 мл метанола. Добавляют 2,52 г цианогенбромида, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 ч, а затем перемешивают еще час после добавления дополнительно 630 мг цианогенбромида. Растворитель отгоняют при пониженном давлении до получения объема около 100 мл оставшегося раствора. Добавляют 100 мл этилацетата и перегонку при пониженном давлении продолжают до тех пор пока объем жидкости не достигает 100 мл. К оставшемуся раствору постепенно добавляют 1000 мл этилацетата при перемешивании. Суспензию, содержащую кристаллы, помещают в холодильник на ночь. Кристаллы отфильтровывают до получения 9,77 г указанного в заглавии соединения.

Спектр ЯМР /(CD₃)₂SO/ , м.д.:
3,67 /3H, синглет/, 3,73 /3H, синглет/, 4,67 /1H, дублет, y=5,0 Гц/, 4,66 /1H, синглет/, 5,26 /1H, дублет, y=2,2 Гц/, 5,84 /1H, дублет дублетов, y= 2,2 и 5,0 Гц/, 6,76 /1H, синглет/, 9,07 /1H, синглет/, 10,23 /1H, синглет/.

П р и м е р 4. Диметил-N⁶-цианогризеолат-N^l-оксид.

9,77 г гидробромида диметил-1^l -деаденино-1^l-/2-амино/1,2,4/оксадиазоло [3,2-i] пурин-7-ил/гризеолата (полученного по способу примера 3) растворяют в 50 мл метанола. К полученной смеси добавляют 50 мл 20, % (объем/объем) аммиака в метаноле и смесь оставляют выстаиваться при комнатной температуре в течение 60 мин, затем добавляют 200 мл этилацетата к реакционной смеси, и растворитель отгоняют при пониженном давлении с аспиратором. Когда объем жидкости достигает 200 мл, добавляют этилацетат, а затем его отгоняют при пониженном давлении. Когда объем жидкости достигает 200 мл, полученную смесь помещают в холодильник на ночь. Полученные при этом кристаллы отфильтровывают до получения 8,53 г указанного в заглавии соединения в виде желтовато-белых тонких кристаллов.

Спектр ЯМР /(CD₃/₂ SO/ , м.д.:
3,67 /3H, синглет/, 3,74 /3H, синглет/, 4,63 /1H, дублет, y=5,0 Гц/, 6,66 /1H, синглет/, 5,16 /1H, дублет, y=2% Гц/, 5,93 /1H, дублет дублетов, y= 2,2 и 5,0 Гц/, 6,50 /1H, синглет/, 8,33 /1H, синглет/, 8,49 /1H, синглет/.

П р и м е р 5. Диметил-N^l-бензилокси-N⁶-цианогризеолат.

8,53 г диметил-N⁶-цианогризеолат-N^l-оксида (полученного по способу примера 4) растворяют в 100 мл диметилформамида. Добавляют 10 мл бензилбромида и 10 мл триэтиламина, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Растворитель отгоняют при пониженном давлении. Добавляют к остатку 30 мл этанола и 30 мл толуола, а затем их отгоняют. Эту процедуру повторяют 4 раза. Полученное таким образом маслянистое вещество смешивают с 500 мл диэтилового эфира и обрабатывают ультразвуком при перемешивании шпателем до получения порошкообразного вещества бледно-желтого цвета. Это вещество отфильтровывают и растворяют в 300 мл воды и 500 мл этилацетата. Органический слой, который выделяется, промывают порциями (по 100 мл каждая) насыщенного водного раствора натрийхлорида, 0,2 и водным раствором соляной кислоты и 10 (мас./об)% водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором натрийхлорида в указанном порядке, а затем сушат над безводным сульфатом магния. После обработки раствора активированным углем, растворитель отгоняют при пониженном давлении до получения 8,8 г указанного в заглавии соединения в виде желтого карамелеподобного вещества.

Спектр ЯМР /(CD₃)₂ SO/ м.д.:
3,68 /3H, синглет/, 3,76 /3H, синглет/, 4,61 /1H, дублет y=5,0 Гц/, 4,67 /1H, синглет/, 5,26 /1H, дублет, y=2,2 Гц/, 5,37 /2H, синглет/, 5,83 /1H, дублет дублетов, y=2,2 и 5,0 Гц/, 6,57 /1H, синглет/, 7,2-7,8 /5H, мультиплет/, 8,56 /1H, синглет/, 8,81 /1B, синглет/.

П р и м е р 6. Диметил-N⁶-циано-N^l-метоксигризеолат.

8,3 г триэтиламила и 3,9 г метилиодида добавляют к 40 мл диметилформамида, содержащего 4,5 г диметил-N6-цианогризеолат-N^l -оксида (полученного по способу примера 4) при охлаждении на льду. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4,5 ч. Затем растворитель отгоняют и к остатку добавляют 100 мл диэтилового эфира до получения порошка при измельчении смеси шпателем. Нерастворимый продукт отфильтровывают, промывают 30 мл диэтилового эфира и растворяют в смеси 80 мл этилацетата и 20 мл воды, а затем полученный раствор экстрагируют повторно этилацетатом. Этилацетатный слой сушат над безводным сульфатом магния. После того как отфильтровывают осушающий агент растворитель отгоняют до получения 3 г указанного в заглавии соединения.

Спектр ЯМР /(CD₃)₂ SO/ м.д.:
3,60 3,73 (вместе 3Н, каждый синглет/ 4,14 /3H, синглет/, 4,58 /1H, дублет, y= 5,0 Гц/, 4,64 /1H, синглет/, 5,21 /1H, дублет, y=2,2 Гц/, 5,83 /1H, дублет дублетов, y= 2,2 и 5,0 Гц/, 6,55 /1H, cинглет/, 8,53 и 8,93 /вместе 1Н, каждый синглет/.

Приготовление 1.

Диметиловый эфир гризеоловой кислоты.

Растворяют 700 мг гризеоловой кислоты в 100 мл диметилформамида и охлаждают раствор льдом. Добавляют раствор 1,0-1,2 ммоль диазометана в 1 мл диэтилового эфира при перемешивании к первому раствору, пока не появится желтое окрашивание, указывающее на образование диазометана. Затем смесь выдерживают в течение 10 мин. Добавляют уксусную кислоту, чтобы разложить избыток диазометана, затем удаляют растворители выпариванием при пониженном давлении, получая остаток. Этот остаток растворяют в метаноле, а нерастворенные вещества отфильтровывают, фильтрат выпаривают при пониженном давлении, получая остаток, который подвергают перекристаллизации из воды, что дает 540 мг указанного в заголовке вещества.

УФ-спектр поглощения (в метаноле), _макс., нм: 258 (3=15600).

ЯМР-спектр (в дейтеродиметилсульфоксиде), м.д.: 4,60 /1H, д, y=6,0 Гц/, 4,66 /1H, c/, 5,12 /1H, д, y=3,0 Гц/, 6,06 /1H, дд, y=3,0 и 6,0 Гц/, 6,53 /1H, c/, 8,33 /1H, c/, 8,37 /1H, c/.

Приготовление 2.

Диметиловый эфир 6-дезамино-6-гидрокси-О²', О⁷' -диацетил-4^l-бром-5^l -гидрогризеоловой кислоты.

Смесь 500 мг диметилового эфира О²', О⁷' -диацетил-6-дезамино-6-гидроксигризеоловой кислоты (приготовлен как описано в Приготовлении 1) и 10 мл уксусной кислоты, содержащей 1 г бромистоводородной кислоты, помещают в запаянный сосуд и растворяют, используя волны ультразвука, в течение 30 мин. Затем раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 64 ч. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, получая остаток, к которому добавляют ацетон и толуол. Затем растворители отгоняют. Эти операции повторяют 3 раза. Смесь образовавшегося остатка и 30 мл этилацетата обрабатывают волнами ультразвука и фильтруют, получая нерастворимый материал. Этот материал растворяют в смеси 30 мл этилацетата и 30 мл водного раствора бикарбоната натрия, содержащего 1,5 г соли и разделяют слои. Слой органической фазы промывают насыщенным водным раствором хлористого натрия (20 мл) и сушат над безводным сульфатом магния. Раствор очищают хроматографически на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента хлористый метилен, содержащий 3 об.% метанола. Из основной фракции выпаривают при пониженном давлении растворитель и остаток растворяют в бензоле. При леофильной сушке бензольного раствора получают 60 мг указанного в заготовке соединения в виде белого порошка.

ЯМР-спектр (в дейтеродиметилсульфоксиде), м. д.: 2,98 /1H, д, y=15,6 Гц/, 3,47 /1H, д, y=15,6 Гц/, 5,35 /1H, д, y=4,2 Гц/, 5,57 /1H, синглет/, 6,32 /1H, д, y=6,6 и 4,2 Гц/, 6,53 /1H, д, y=6,6 Гц/, 8,17 /1H, c/, 8,47 /1H, c/.

Примеры 7-17 приведены с целью иллюстрации использования соединения формулы I в качестве промежуточных продуктов.

П р и м е р 7. 2-Амино-6-бензилоксигризеоловая кислота.

100 мл 0,2 н. водного раствора гидроокиси натрия добавляют к 400 мл метана, содержащего 8,8 г диметил-N^l-бензилокси-N⁶-цианогризеолата (полученного по способу примера 16) при перемешивании. Реакционный раствор подщелачивают до рН 12-12,5, добавляя 1 н. водный раствор гидроокиси натрия, а затем его оставляют выстаиваться при комнатной температуре в течение 60 мин. Растворитель отгоняют до тех пор, пока оставшийся объем жидкости не достигает около 100 мл. Полученный раствор смешивают с 50 мл воды и 150 мл этанола и нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 2 ч. Растворитель отгоняют снова при пониженном давлении до объема жидкости около 100 мл. Добавляют 100 мл 2 н. водного раствора гидроокиси натрия, и полученный раствор оставляют выстаиваться при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляют к раствору 200 мл этилацетата и подкисляют до рН=0,5 концентрированной соляной кислотой при перемешивании.

Водные и органические соли разделяют, органический слой промывают 50 мл 0,1 н. водного раствора соляной кислоты, а затем соединяют с водным слоем и обрабатывают активированным углем. Доводят рН раствора до 2,3, добавляя твердый бикарбонат натрия при интенсивном перемешивании. Образовавшийся нерастворимый осадок помещают на ночь в холодильник. Полученное порошкообразное вещество отфильтровывают и сушат до получения 5,29 г указанного в заглавии соединения в виде желтовато-белого порошка.

Спектр ЯМР /(CD₃)₂ SO/, м.д.:
4,54 /1H, синглет/, 4,55 /1H дублет, I=5,0 Гц/, 5,06 /2H, синглет/, 5,08 /1H, дублет, I=2,2 Гц/, 5,83 /1H, дублет дублетов, I=2,2 и 5,0 Гц/, 6,27 /1H, синглет/, 7,2-7,6 /5H, мультиплет/, 7,79 /1H, синглет/.

П р и м е р 8. 2-Амино-N⁶-оксигризеоловая кислота.

200 мг 2-амино-N⁶-бензилоксигризеоловой кислоты нагревают с 20 мл метанола и 20 мл воды. Полученный раствор оставляют выстаиваться при комнатной температуре и охлаждении льдом. Добавляют 50 мг 10% (масса/масса палладия на угле, и полученную смесь перемешивают в потоке водорода. Так как реакционная смесь мутнеет за счет образования белого вещества за 30 мин, ее осветляют 5 мл 1 н водного раствора соляной кислоты, и полученный раствор перемешивают в течение 1,5 ч. Катализатор удаляют фильтрованием, метанол отгоняют при пониженном давлении и рН раствора устанавливают 2,2, добавляя насыщенный водный раствор бикарбоната натрия при перемешивании. Реакционную смесь оставляют выстаиваться на ледяной бане в течение 30 мин, а затем полученный желтоватый продукт отфильтровывают до получения 100 мг указанного в заглавии соединения.

Спектр ЯМР /(CD₃)₂ SO/ м.д.:
4,54 /1H, синглет/, 4,75 /1H, дублет, I=5,0 Гц/, 5,11 /1H, дублет, I= 2,2 Гц/, 5,95 /1H, дублет дублетов, I=2,2 и 5,0 Гц/, 6,31 /1H, синглет/, 7,83 /1H, синглет/.

П р и м е р 9. 2-Аминогризеоловая кислота.

100 мг 2-амино-N⁶-бензилоксигризеоловой кислоты растворяют в смеси 20 мл 1н. раствора соляной кислоты и 20 мл ацетона. Добавляют 1 мл никеля Ренея (W-2) и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2,5 ч.

Никель Ренея отфильтровывают и рН реакционной смеси устанавливают 2,3. Затем ее очищают на хроматографической колонке, используя RP-8 предварительно набитую колонку (Me r ск), элюируя 3% (объем/объем) водным раствором ацетонитрила. Оставшуюся фракцию лиофилизируют до получения 12 мг указанного в заглавии соединения в виде белого порошка.

Спектр ЯМР /(CD₃)₂ SO/ м.д.:
4,46 /1H, синглет/, 4,55 /1H, дублет, I=5,0 Гц/, 5,02 /1H, дублет, I= 2,2 Гц/, 5,87 /1H, дублет дублетов, I=2,2 и 5,0 Гц/, 6,28 /1H, синглет/, 7,90 /1H, синглет/.

Тонкослойная хроматография (отношение Rf к соответствующему значению для гризеоловой кислоты взято за 1,0).

Пластина силикагеля (Mer cк): 0,8 (проявляющий растворитель: вода; метанол; ацетонитрил =70:15:15 по объему).

Пластина RP - 8 для обращенной фазы: 0,79 (проявляющий растворитель: вода, содержащая 2% (объем/объем) ацетонитрила и 0,02% (объем/объем) уксусной кислоты).

П р и м е р 10. Дибензигидрид-2-амино-N⁶-бензилоксигидризеолат.

1,0 г 2 амино-N⁶-бензилоксигрезеоловой кислоты суспендируют в 100 мл ацетонитрила и 100 мл воды. Добавляют дифенилдиазометан до тех пор, пока больше не наблюдается исчезновения его красной окраски. Затем реакционную смесь перемешивают во время добавления 4 мл 1 н водного раствора соляной кислоты и добавляют дифенилдиазометан до тех пор, пока больше не наблюдается исчезновения его красной окраски.

Полученную смесь перемешивают в течение 60 мин. Ацетон удаляют перегонкой при пониженном давлении и воду удаляют декантированием. Остаток растворяют в смеси 50 мл этилацетата и 50 мл воды, органический слой промывают 30 мл 5% масса/объем водяного раствора бикарбоната натрия и 30 мл насыщенного водного раствора натрийхлорида и затем сушат над безводным сульфатом магния. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, и остаток растворяют в 30 мл этилацетата, а полученный раствор выливают в 500 мл гексана при перемешивании. Полученное нерастворимое вещество собирают фильтрованием и очищают на предварительно набитой хроматографической колонке с силикагелем (Mer ск), элюируя метиленхлоридом, содержащим 2,5% объем/объем метанола. Из двух основных фракций собирают фракцию, которая выходит позднее, выпаривают досуха и лиофилизируют из бензола до получения 430 мг указанного в заглавии соединения в виде белого порошка.

Спектр ЯМР /CD₃/₂ SO/ м.д.:
4,63 /1H, дублет, I=5,0 Гц/, 4,99 /1H, синглет/, 5,07-/2H, синглет/, 5,31 /1H, дублет, дублет, I=2,2 Гц/, 5,97 /1H, дублет дублетов, I=2,2 и 5,0 Гц/, 6,33 /1H, синглет/, 6,75 /1H, синглет/, 6,81 /1H, синглет/, 7,74 /1H, синглет/.

П р и м е р 11. Дибензигидрил-2-оксигризеолат.

0,6 г дибензигидрил-2-аминогризелата растворяют 50 мл 90% (объем/объем) водой уксусной кислоты. После замены в контейнере воздуха на азот, к полученной смеси добавляют 1 н. раствор нитрата натрия при охлаждении льдом, и полученную смесь оставляют реагировать при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Растворитель отгоняют и остаток смешивают с водой, воду отгоняют снова. Оставшееся в осадке вещество суспендируют в воде и собирают фильтрованием. Остаток растворяют в 15 мл ацетона и рН раствора устанавливают 9-10, добавляя концентрированный водный аммиак. Полученный раствор оставляют выстаиваться при комнатной температуре в течение 20 мин, а затем ацетон отгоняют. Остаток смешивают с 50 мл этилацетата и 50 мл воды и тщательно перемешивают. Полученный осадок отфильтровывают и очищают на хроматографической колонке с силикагелем (элюируя 10% (объем/объем) этанолом и метиленхлориде) до получения 0,35 г указанного в заглавии соединения.

Выделенный этилацетатный слой промывают 10% (вес/объем) водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором натрийхлорида и сушат над безводным сульфатом магния. Осушающий агент удаляют фильтрованием и растворитель отгоняют. Полученный остаток очищают на хроматографической колонке, используя метиленхлорид, содержащий 10% (объем/объем) метанола в качестве элемента до получения 0,04 г указанного в заглавии соединения.

Спектр ЯМР /(CD₃)₂ SO/ м.д.:
4,59 /1H, дублет/, I=5,0 Гц/, 4,90 /1H, синглет/, 5,25 /1H, дублет, I= 2,2 Гц/, 6,06 /1H, дублет дублетов, I=2,2 и 5,0 Гц/, 6,30 /1H, синглет/, 6,67 и 6,73 (вместе 1Н, каждый синглет/, 7,0-7,5 - 20, мультиплет/, 7,93 /1H, синглет/.

П р и м е р 12. 2-Гидроксигризеоловая кислота.

В 3 мл анилоза растворяют 0,37 г дибензигидрилового эфира 2-гидроксигризеоловой кислоты. При охлаждении льдом добавляют 3 мл трифторуксусной кислоты, и смеси дают выдержку 10 мин при комнатной температуре.

Затем добавляют толуол и после этого растворитель отгоняют. Затем добавляют смесь ацетона и толуола, которую в последующем отгоняют. Эту методику повторяют дважды, и полученную смесь суспендируют в 2 мл ацетона, которую выливают в 100 мл гексана при перемешивании. Выпавшее в осадок вещество собирают путем фильтрации. Остаток растворяют в растворе бикарбоната натрия (10 г в 100 мл), и этот раствор подкисляют до значения рН 1,2 добавлением концентрированной хлористоводородной кислоты. Полученную смесь очищают хроматографически с использованием предварительно заполненной колонки RP-8 (фирма Мерк). При элюировании водой получают 0,17 г указанного в заголовке вещества.

ЯМР-спектр (в дейтеродиметилсульфоксида), м. д.: 4,46 /1H, синглет/, 4,47 /1H, дублет, I=5,0 Гц/, 5,05 /1H, д, I=2,2 Гц/, 5,89 /1H, дд* (пара дублетов), I=2,2 и 5,0 Гц/, 6,24 /1H, c/, 7,95 /1H, c/.

Анализ методом тонкослойной хроматографии (относительное значение Rf по сравнению с гризеоловой кислотой, взятой за 1:0/: на пластине RP-8 для обратной фазы /фирма Мерк/ Rf=1,32 (элюирующий растворитель: вода, содержащая 2 об.% ацетонитрила и 0,02 об.% уксусной кислоты).

П р и м е р 13. 6-Дизамино-2-6-дигидроксигризеоловая кислота.

Растворяют в 1 мл анизола 40 мг дибензигидрилового эфира-6-дезамино-2,6-дигидроксигрезеоловой кислоты. Добавляют 1 мл трифторуксусной кислоты при охлаждении льдом и смеси дают выдержаться в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Эти операции добавления и отгонки толуола, затем добавления и отгонки смеси ацетона и толуола повторяют дважды. Остаток суспендируют в 0,5 мл ацетона. После добавления 20 мл гексана, выпавшее в осадок вещество собирают посредством фильтрации. Остаток растворяют в водном растворе бикарбоната натрия (10 г / 100 мм). Раствор подкисляют до значения рН 0,6 добавлением концентрированной хлористоводородной кислоты. Полученный раствор очищают хроматографически с использованием предварительно заполненной колонки RP-8 (обратная фаза, типа Мерк). Элюируют водой, получая 25 мг указанного в заголовке вещества.

ЯМР-спектр (в дейтеросульфоксиде), м.д.:
4,49 /1H, синглет/, 4,58 /1H, дублет, I=5,0 Гц/, 5,12 /1H, д, I=2,2 Гц/, 5,53 /1H, дд, I=2,2 и 5,0 Гц/, 6,41 /1H, C/ 7,91 /1H, c/.

Тонкослойная хроматография (значения Rf относительно гризеоловой кислоты, принятой за 1,0/: на пластине с силикагелем (фирмы Мерк) Rf 0,57 /элюирующий растворитель вода: метанол: ацетонитрил: 70:15:15 по объему/, на пластине RP-8 для обратной фазы (Мерк) Rf 1,65 (элюирующий растворитель - вода, содержащая 2 об.% ацетонитрила и 0,02 об.% уксусной кислоты/.

П р и м е р 14. Диметиловый эфир N⁶-бензилокси-2(N², N¹-диметиламинометилен)-аминогризеоловой кислоты.

528 мг диметилового эфира 2-амино-N⁶-бензилоксигризеоловой кислоты растворяют в 10 мл диметилформамида. Добавляют 0,24 мл диметилацетата диметилформамида, и смеси дают выдержку 2 ч при комнатной температуре. После исчезновения исходного вещества, что подтверждается методом тонкослойной хроматографии, растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток растворяют в 40 мл хлористого метилена и 40 мл воды, и органический слой промывают 20 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия. Все водные слои объединяют, и затем смешивают с 2 мл водного раствора бикарбоната натрия (3 г в 100 мл) и экстрагируют два раза 20 миллилитрами хлористого метилена. Органические слои объединяют, сушат безводным сульфатом магния, и растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток подвергают хроматографической очистке на колонке с силикагелем (фирма Мерк), элюируемой хлористым метиленом, содержащим 3 об.% метанола. После очистки полученное вещество подвергают лиофильной сушке из бензола. Получают 322 мг указанного в заголовке вещества в виде белого порошка.

ЯМР-спектр (в дейтеродиметилсульфоксиде), м.д.:
3,04 /3H, синглет/, 3,19 /3H, c/, 3,67 /3H, c/, 3,72 /3H, c/, 4,47 /1H, дублет, I=5,0 Гц/, 4,63 /1H, c/, 5,01 /2H, c/, 5,12 /1H, д, I=2,2 Гц/, 6,00 /1H, дд, I=2,2 и 5,0 Гц/, 6,38 /1H, c/, 7,2-7,6 /5H, мультиплет/, 7,83 /1H, c/, 8,50 /1H, c/.

П р и м е р 15. Диметиловый эфир 2-(N^l, N^l-диметиламинометилен)аминогризеоловой кислоты.

583 мг диметилового эфира N⁶ бензилокси-2-(N^l ,N^l-диметиламинометилен) аминогризеловой кислоты растворяют в 100 мл хлористоводородной кислоты (1-нормальный). Добавляют 10 мл никеля Ренея (марка W-2), суспендированного в воде, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин, поддерживая значение рН не ниже чем 1,0, анализируя кислотность рН-метром, никель Ренея (катализатор) удаляют посредством фильтрации, и фильтрат концентрируют посредством выпаривания при пониженном давлении. Когда ацетон почти полностью удаляют, образовавшуюся смесь перемешивают с 200 мл хлористого метилена и нейтрализуют водным раствором бикарбоната натрия. Оставшийся нерастворимый осадок удаляют путем фильтрации. После выделения органического слоя водный слой экстрагируют 3 раза, каждый раз по 50 мл хлористого метилена. Эти органические слои объединяют и высушивают над безводным сульфатом магния. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, и остаток подвергают очистке на хроматографической колонке (фирма Мерк), элюируемой хлористым метиленом, содержащим 5 об.% метанола. Полученное вещество очищают и подвергают лиофильной сушке из бензола. Получают 180 мг указанного в заголовке вещества в виде белого порошка.

ЯМР-спектр (в дейтеродиметилсульфоксиде), м.д.:
3,04 /3H, c/, 3,15 /3H, c/, 3,67 /3H, c/, 3,73 /3H, c/, 4,53 /1H, д, I= 5,0 Гц/, 4,64 /1H, c/, 5,13 /1H, д, I=2,2 Гц/, 6,06 /1H, дд, I=2,2 и 5,0 Гц/, 6,47 /1H, c/, 7,33 /1H, c/.

П р и м е р 16. Диметиловый эфир 6-дезамино-2(N^l, N^l-диметиламинометилен)-амино-6-гидроксигризеоловой кислоты.

477 мг диметилового эфира 2-(N^l ,N^l-диметиламинометилен)-аминогризеоловой кислоты растворяют в 50 мл водного раствора уксусной кислоты (80 об.% ).

При охлаждении льдом добавляют 1,34 г нитрата натрия, и смеси дают выдержку 17 ч при комнатной температуре. После исчезновения исходного вещества, что контролируется методом тонкослойной хроматографии, растворитель отгоняют при пониженном давлении.

Добавляют этанол и затем его отгоняют, причем эти операции добавления и отгонки повторяют до тех пор, пока не исчезнет запах уксусной кислоты. Остаток растворяют в смеси 50 мл хлористого метилена, 20 мл воды и 5 мл водного раствора бикарбоната натрия (5 г в 100 мл). Органический слой отделяют и экстрагируют 3 раза, порциями по 30 мл хлористого метилена, и экстракты объединяют.

Растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток очищают, используя хроматографическую колонку (фирмы Мерк), предварительно заполненную силикагелем и элюируемую хлористым метиленом, содержащим 10 об.% метанола. Основные фракции собирают и подвергают лиофильной сушке из бензола, получая 310 мг указанного в заголовке вещества в виде белого порошка.

Спектр УФ-поглощения (в метаноле), _макс, нм: кислотный - 292, нейтральный - 300, основной - 279.

П р и м е р 17. 2-Амино-6-дезамино-6-гидроксигризеоловая кислота.

130 мг диметилового эфира 6-дезамино-2 (N^l ,N^l-диметиламино-метилен) амино-6-гидроксигризеоловой кислоты растворяют в 20 мл концентрированного водного аммиака, и смеси дают выдержку при комнатной температуре в течение 3 ч. Раствор выпаривают насухо при пониженном давлении и остаток растворяют в 10 мл воды. Полученный раствор подкисляют до значения рН 2,3 и затем подвергают хроматографической очистке на предварительно заполненной колонке RP-8 (фирма Мерк), которую промывают водой и затем элюируют водой, содержащей 5 об.% ацетонитрила. Основные фракции собирают и подвергают лиофильной очистке, получая 67 мг указанного в заголовке соединения в виде белого порошка.

Спектр УФ-поглощения (в воде), _макс, нм: кислотный - 256, 273 (плечо), нейтральный - 253, 278 (плечо); основной 264.

ЯМР-спектр (в дейтеродиметилсульфоксиде), м. д.: 4,48 /1H, синглет/, 4,53 /1H, дублет, I=4,9 Гц/, 3,07 /1H, д, I=2,4 Гц, 5,79 /1H, дд, I=2,4 и 4,9 Гц/, 6,25 /1H, c/, 7,87 /1H, c/.

Тонкослойная хроматография (относительное значение Rf, для гризеоловой кислоты Rf принято за 1,0: для силикагеловой пластинки (фирма Мерк) - 0,80 (элюирующий растворитель - вода: интанол: ацетонитрил=70:15:15 по объему), для пластинки RP-8 с обратной фазой (фирма Мерк) - 1,44 (элюирующий растворитель - вода, содержащая 2 об.% ацетонитрила и 0,02 об.% уксусной кислоты).

П р и м е р 18. По методике примера 9, но используя 2-амино-N⁶-метоксигризеоловую кислоту вместо 2-амино-N⁶-бензилоксигризеоловой кислоты, получили тот же самый конечный продукт 2-аминогризеоловую кислоту, выход 30% в виде белого порошка.

Данные ЯМР аналогичны данным для соединения примера 9.

Данные биологической активности аналогичны данным соединения примера 9.

П р и м е р 19. Повторяли методику примера 5, но изменяя время реакции - 1 час и затем отдельно 5 ч - получили готовый продукт по активности с тем же самым выходом, что в примере 5.

Эксперименты на подавление активности фосфодиэстеразы (ФДЭ).

(А) Испытание на подавление активности сАМФ ФДЭ.

Это испытание проводилось по сути тем же методом, что у A.L.Pichard и W. I. Cheung (Journal of Biological Chemistry) 251, 5726-5737 (1976). Сырой ферментный раствор, полученный из мозга крыс, использовался в качестве источника сАМФ ФДЭ.

В качестве субстрата использовался сАМФ с маркой ¹⁴С. Он использовался в буферном растворе 0,2М трис-соляной кислоты /pH 8,0/ в количестве, достаточном, чтобы обеспечить окончательную концентрацию 0,14 М. Раствор субстрата смешивался с соответствующим количеством испытуемого соединения, растворенного в 2,0-3,0 мл диметилсульфоксида, и с 20 мл раствора змеиного яда и 40 мл сырого ферментного раствора. Для доведения общего объема до 100 мл добавлялось достаточное количество буфера, трис-соляной кислоты. Смесь реагировала при 30^оС 20 минут. Далее смесь реакции обрабатывалась смолой (тов. зн. Amberlite IRP-58) и определялся уровень остаточной радиоактивности аденозина в продукте. Эксперимент проводился при разных уровнях концентрации каждого активного соединения и рассчитывались величины 50% подавления (I₅₀).

(В) Испытание на подавление активности сГМФ ФДЭ
Повторялась та же процедура испытаний, как в (А), за исключением того, что вместо сАМФ в качестве субстрата использовался циклический гуанозин монофосфат (сГМФ). В отношении сГМФ ФДЭ также рассчитывалась I₅₀ величина.

(С) Испытуемые соединения
Соединение этого изобретения. Химическое наименование
А: 6-диамино-6-гидрокси-2-амино-2-дегидро-4^l , 5^l-дигидрогризеоловая кислота.

В: 6-дезамино-2,6-дигидроксигризеоловая кислота
С: 2-амино-6-дезамино-6-гидроксигризеоловая кислота
D: 2-амино-6-дезамино-6-гидроксигризеоловая кислота моноамид.

Соединения патента Канеко (представлены номера соединений патента Канеко, колонки 7-12).

NN соединений 36, 37, 40, 41, 58, 88, 133, 137, 142, 143, 144, 247 и 249.

(D) Результаты
Результаты суммированы в следующей таблице, в которой соотношения величин I₅₀ в сАМФ/сГМФ также рассчитаны и показаны округленными цифрами.

Из указанных результатов очевидно, что производные гризеоловой кислоты обладают гораздо большей активностью против сГМФ ФДЭ, чем против сАМФ ФДЭ по сравнению с производными гризеоловой кислоты упомянутого патента Канеко, что яснее видно из соотношений величины I₅₀, как показано в таблице.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ГРИЗЕОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ общей формулы

где R - C₁ - C₄-алкил;
R₁ - бензил или метилрадикал,
отличающийся тем, что соединение общей формулы

где R имеет указанное значение,
подвергают взаимодействию с соединением общей формулы
R₁X,
где X - галоид;
R₁ имеет указанные значения,
в присутствии органического основания - триалкиламина в амиде кислоты в качестве растворителя при комнатной температуре в течение 1 - 5 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2