Способ получения полисахаридов ксантанового типа

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12 Р 19/00, 19/06

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) сс.сС=:..= ъ

1 с, 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 3995132/13 (22) 20.12.85 (31) 8419,622 (32) 21. 12.84 (33) FR (46) 30.08.93. Бюл. ¹ 32 (11) Рон-Пуленк Спесьялитэ Шимик (FR) (72) Вероник Лепрукс, Мишель Пейнье Патрик Крос, Женин Бешри и Ив Кеннель (FR) (56) Патент ЕПВ f Ь 58364, кл. С 12 P 19/06, 1982.

Изобрете ие относится к получению биополимеров, используемых в качестве сгущающих агентов при эксплуатации нефтяных месторождений, в частности, отноСится к способу получения полисахаридов ксантанового типа.

Цель изобретения заключается в устранении указанных недостатков и увеличении выхода полимера. Эта цель достигается способом культивирования микроорганизмов в водной питательной среде, содержащей углеводы, источник азота и факторы роста, в условиях аэрации и перемешивания культуральной среды, заключающимся в том, что используют эмульсию типа масло-в-воде, содержащую 1-30 масла.

Водная фаза среды может содержать s качестве углеводов глюкозу или сахарозу, в интервале от 10 до 100 г/л, но может достигать 150-200 г/л.

В качестве микроорганизмов — продуцентов полисахаридов используют например. природные бактерии вида

Xanthomonas campestris, „„5ЛЛÄÄ 1838417 АЗ (51) СПОСОБ ПОЛ ЧБ1 Ц1.1 ПОЛ .1ГАXAI t}1ДО В KCAHTAI! ОН О ГО T I1I IA (57) Изобретение относится к биотехногогии и касается способа получения полисахаридов ксантановсго типа, Природные бактерии вида Xanthomonas Campestris продуценты полисахаридов культивируют на питательной среде, содержащей углеводы, источник азота и факторы роста. Процесс ведут в эмульсии типа "масло-в-воде", содержащей 1-30 масла. Эмульсию стабилизируют добавлением ПАВ с HI R 6-11. 2 з.п. ф-лы, 2 табл..

В качестве масла можно использовать любое минеральное или растительное масло, не смешивающееся с водой, например, изопаргфины, деодорированный керосин, углеводороды с высокой температурой кипения, предпочтительно выше t50-200 С; рапсовое, соевое, кукурузное, подсолнечное, арахисовое и другие масла. Желательно, чтобы доля масляной фазы составляла менее 30 среди, предпочтительно 1-181 и еще более предпочтительно 3-16 .

Диспергированию и стабилизации масляной фазы в водной фазе благоприятствуют паверхностно-активные вещества, предпочтительно неионные, величина HLB которых предпочтительно ниже 11 и более предпочтительно составляет 6-11, причем зта величина может быть получена с помощью одного поверхностно-активного вещества или смеси поверхностно-активных веществ. Выбор и количество поверхностно-активного вещества, необходимого для получения непрерывной водной фазы, легко определяется специалистом в зависимости

1838417 от выбранного масла и его концентрации в среде, В качестве неионного поверхностно-активного вещества гложно использовать соединения, получаемые путем конденсации алкилеггоксида с алифатическим или ал кила рома тическим орган ическигл соединением. Соответствующими поверхностно-активными веществами, которые не ингибируют рост микроорганизмов, являются полиоксиэтиленированные ап- к и л ф е и о л ы, и олиоксиэтилинированные спирты, полиоксиэтилинированн ые жирные кислоты, полиоксиэтилинированные триглицериды, полиоксиэтилинированные сложные эфиры сорбитана и жирных кислот.

Поверхностно-активные вещества можно вводить полностью или частично, в зависимости от их сродства, в масляную, или воднуго фазу.

Для осуществления способа можно стерилизовать отдельно масляную фазу и водную фазу. После стериализации и охлаждения масляная фаза может быть смешана с содержащейся в ферментере водной фазой или каждая из фаз может быть введена непрерывно в ферментер при перемешивании. Немедленно образуется стабильная эмульсия. Посев и ферментация затем clpoводят известным способом при аэрации и перемешивании. В процессе ферментации рН-значение может поддерживаться при оптиглальногл значении за счет впрыскивания щелочного или аммиачного раствора.

Также можно осуществлять периодически или непрерывно введение необходимой для роста среды.

В конце ферментации и B зависимости от области применения, эмульсию можно использовать такой, какая есть, илгл водную фазу можно отделить от масляной фазы за счет дестабилизации эмульсии известным образом, а сусло можно испольэовать в неочищенном виде, или можно осадить из него полисахарид добавлением низшего спирта, например, изопропанола, с добавлениегл при необходимости. Осажденный полисахарид отделяют, вымывают адсорбировавшееся на волокнах масло, затем высушивают и в известных случаях размельчают. Таким образом получают готовый для использования порошок.

Согласно другому варианту способа, полученную после ферментации эмульсию концентрируют путем удаления води до получения эмульсии. содержащей 8-60 j, и предпочтительно 15-60 вес.26 полисахарида в расчете на вес эмульсии. В этом случае количество используемого для осуществления ферментации масла должно быть рассчитано в зависимости от содержания сухоro вещес ва в конце ферментации.

Предпочтительно, количество масла в конечной эмульсии не должно превышать 45 j всей среды.

Воду удаляют, например, выпариванием или отгî iKQA, в известных случаях, при парциональном давлении. Часть масляной

"0 фазы гложет удаляться в виде азеотропной смеси с водой. 1Ложно проводить ультрафильтрацию, используя известные методы и оборудование, при условии выбора пористой гидрофильной мембраны, поры которой до"5 статочно малы для предупреждения происхождения биополимера через мембрану.

Ультрэфильтрация обеспечивает сохра- . ггение эмульсий в непрерывной водной фазе. Концентрация за счет ультрафильтрации

20 имеет еще то преимущество, что сохраняет содержание tl8opl.aH11÷åcêèõ солей в водной фазе при значениях, близких к таковым, имеющимся в начальном сусле, каково бы ни было содержание полимера.

В виде BapHBIITB, можно когщентрировать эмульсиго сначала путем ультрафильтрации, и затем с помощью другой операции, например, выпариванием или дистилляцией.

80 К полученным эмульсиям можно добавлять при необходимости бактерициды, ферменты или любую другую добавку, предназначенную для особого использования, при условии, что эта добавка не вредит

85 ста бил ь ности эмул ьсии.

Эмульсии масло-а-воде, согласно иэо, бретениго, могут применяться во всех областях, где требуются вязкообразные водные среды, например, в строительстве при изго40 товлении красок, в косметической промышленности, фитосанитарии, нефтяной промышленности и т.д, Они обладают тем преимуществом, что их можно использовать непосредственно для приготовления водных

"5 разбавленных растворов беэ необходимости прохождения фазы инверсии. Они очень хорошо дисперируются в воде, скорость их растворения по крайней мере равна таковой исходного сусла. Они хорошо прокачивают50 ся и стабильны в очень широкогл концентрационном иvòåðoanå. Мх вязкость существенно ниже таковой водного раствора, содержащего эквивалентное количество биополимера, так, что можно иметь прокачи55 ваемые или текучие эмульсии с повышенными концентрациями полисахаридов в водной фазе, Следующие примеры даны в качестве иллюстративных и не ограничивают обьема изобретения.

1838417

Во всех этих примерах поступают следующим образом: питательный водный раствор загружают в ферментер и стериализуют; масло, содержащее, если этом имеет место, поверхностно-активное (поверхностно-активные) вещества (а) стериализуют и выливают при перемешивании в водный; содержащийся в ферментере водный раствор при комнатной температуре; среду засевают предкультурой

Xphthomonas campestrls на питательном бульойе МУ, с концентрацией сахарозы 10 г/л, Пример 1. В ферментер емкостью 20 л помещают 210 г предкультуры, 14 л стери-

BhbHoA эмульсии масло в воде, содержащей па объему 6,25 масляной фазы и 93,75% водной фазы.

Состав вод IOA фазы, г/л: декстраза - - 61 дрожжевой экстракт 7

КагНР04 2,35 (ЙН4)зР04 . 22

MgS04 7Н20 . 0,35

Состав масляной фазы: деароматизированный алифатически& углеводород 70 мас.% (Exsol Ä100, выпускаемый фирмой Esso

Chemic этоксилированные нонилфенолы . 30 мас. % (смесь 67/33 Cemulsol

NP4 и Cemulsol NP17 продажные марки фирмы SFOS; показатель HLB: 11

Условия ферментации температура 28 С рН, регулируемое при 7, добавлением раствора гидроксида натрия перемешивание 400 об/мин аэрация 0-17 ч 0,24 об. скорость в мин.

17-23 ч 0,48 -"23-90 ч 0,98 -"Ферментацию осуществляют да полного исчезновения сахара. продолжительность: 90 ч

Эволюция популяции и удельное сопротивление среды с течением времени указаны в табл.1.

Количество полученного действующего начала составляет 425 г (30,3 г/кг), или выход по отношению к сахару составляет 56%, Вязкость эмульсии в конце ферментации составляет 8,1 Па с (вязкость по Брукфильду при 20 С вЂ” игла N 4-30 t(мин).

П р и и е р 2. Повторяют пример 1 с .начальной средой, состоящей на 29% по обьему из углеводорода Exsot D100 и 71% водной фазы, имеющей следующий состав,.г/л:

30 декстроза. 64

5 дрожжевой экстракт 9,24; . Йа2НРО4 3.08 (ЙН)зРО4 3,08

М9304 7H20 0,35

Поверхностно-активный агент не дабав10 ляется.

Рабочие условия идентичны таковым примера 1, за исключением аэрации. которая постоянно составляет 0,98 об.скорость в мин. Ферментация длится 85 ч до стадии,.

15 при которой нет больше никакого сахара.

Эволюция популяции и удельное сопротивление среды даны в табл,1. Получают 330 г действующего начала, или выход составляет 51,3% по отношению к сахару, Вязкость

20 конечной эмульсии составляет 10,2 Па с (те жЕ условия, что и в примере 1). . Пример 3. Начальная эмульсия масло в воде получается из 14,125 л водной фазы и 0,875 л масляной фазы.

25 Состав водной фазы. г/л: сахароза.. 85 растворимый кукурузный экстракт (CSL) - 25,5

М930 7Н20 .. 0,28

Масляная фаза содержит 70 вес. рапсового масла и 30% этоксилированного нонилфенола (Cemulsol NP4).

Показатель Н В: 9

35 Среду засевают как в примере 1.

Условия ферментации: температура 28 С рН, регулируемое при 7, путем добавления раствора гидроксида натрия

40 перемешивание 0-17 ч 390 об/мин

17-24 ч 500 аб/мин

24-84 ч 600 аб/мин аэрация 0-17 ч 0.92 аб. скорость в мин, °

45 17-84 ч 1,4 -"средняя сила рассеяния (: 6,09 Кй/)м .

По истечении 84 ч получают 51 г ксантановой смолы на кг среды. Выход в расчете на израсходованную сахарозу: 64, 50 Консистенция К (по закону Освальда) среды составляет 37 Па с и показатель псевдопластичности "и"=0.195.

По сравнению с этим. водное сусло, содержащее 48,5 r/êã полимера, имеет конси55 стенцию К=70 Па с и показатель "и"=0,24, Продолжают ферментацию да 113 часов. Получают 66 r/êr полимера. Выход в расчете на израсходованную сахарозу 83 .

1838417

80ч

Таблица 1

Изменение популяции и удельного сопротивления среды во време»»и

Л рима р ы 4 и 5; Реализуют две ферментации в эмульсии масло в воде. содержащей 0,875 л масляной фазы и 14,125 л водной фазы, Состав среды следующий, %: сахароза 8 растворимый кукурузный экстракт (СЯ1) 4

Mg S04 7Н20 0,05 . масло 3 5 поверхностно-активный вещества 1,5

Масля»лая фаза образована рапсовым маслом и нативными жирными атоксилированными спиртами (Cemulsol AS5) (для примера 4, алифатическими углеводородами (Exsol 080) и этоксилированнМми нонилфенолами (смесь 50/50 Cemulsol NP4Cemulsol NP17 для примера 5).

Условия ферментации следующие:

Темпера- . Аэрация Переметура: 28 С шивание

0-17 ч 0,92 390 об/»ли» после 17 ч 1,39 500 об/мин после 41 ч 1,39 500 об/мин (пример 4)

600 о б/ми» (пример 5), Ферментация продолжается вплоть до полного исчезновения сахарозы:

Результаты Пример 4 Пример 5 продолжи-тельность - 68 ч действующее начало 47,4 r/êã 51 r/êã выход в расчете на саха розу 60% 64%

Пример ы 6-14..С помощью 1 мл предкультуры Xanthomonas campestris на . питательном бульоне МУ с 10 r/ë сахарозы засевают 100 мл эмульсионной среды масло . 5 . в воде, содержащейся в колбе Эрленмейера емкостью 500. мл.

Водная фаза, общая для всех примеров, идентична таковой примере 3.

Изменяют состав маслянo»1 фазы. Каж10 дая колба содержит 95 «ac,% водной фазы и 5 мас.% масляной фазы. Содержи»лое колб перемешивают с помощью ротацио»н»ой мешалки, вращающейся со скоростью 220 об/мин с амплитудой 5 см и инкубируют при

15 28ОС в течение 89 «. Результаты указаны в табл.2.

Формула и з о б р е r e»» t st

1. Способ получения полисахаридов ксантанового. типа, включающий культиви20 рова»»ие микроорганизмов-продуце»»тов полисахаридов t»a питательной среде, содержащей углеводы, источник азота и факторы роста, в условиях аэрации и перемешивание культуральной жидкости, 25 причем культивирова»»ие осуществляют в маслосодержащей эмульсии, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что. с целью повышения выхода . целевого продукта, испол»ьзу»от эмульсию типа масло в воде, содержащую 1-30%»ласла.

30 2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что в качестве»ликроорга»»»лз»»ов-продуцентов полисахаридов используют природные бактерии. вида Xanthomonas campestris.

3. Способ поп. 1 или 2, о тл и ч а ю щи35 и с я тем, что, с цель»о стабилизации эмульсии, Ь»»ее вводят поверх»»остно-активное вещество с lLB 6-11.

1838417

Таблица 2

Количество получаеного полимера и выход Ферментации в зависиности от композиции масляной Фазы

6" 7 à 9 10 . И 12 13 14

Пример

3,5 3,5

Природа и Репсовое состав маслата

Соевое

Вхвоl 080

3>5 3,5

3.5 3,5

3,5 3,5 ! 0 75 1 0 75

1,5

05 0,75 05 075

1,35

Cemulsol Т.

Cemulso1 ?lF5

Cemulsol А05

0,15

1,5

;ря

Вязкость (мПа сек) 6,35

Израсходованный сахар, г/л

Полимер, r/кг

Выход/израсход.сахар (ь)

Контроль - без масла.

«е Exsol DGO - алифатические углеводороды Esso Chemic

Isopar И: изопарафины - Ввао Chemic

Сешц1во1 11Р4, НР5, 11Р7 этоксилированные нонилфенолы - Фирмы SFOS . Сева1во1 РЗ, AN, Т: зтоксилированные олеоцетиловые слирты» фирмы GF00

1я1" Брукфильд, 20 С, игла Ю 4, 30 о6/мин.

Составитель А.Ульянова

Техред М.Моргентал Корректор СЯекарь

Редактор

Заказ 2906 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/б

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Isopsr П

Природа и Cemulsol Р4 состав rlAB (грамм)

Cemulsol И5

6,75

45,6

32,4

1,5

6,2 6 5

11700 7400

49,5 60 5

41,3 33,8

03 В9

6,55

47,2

4,4

36

6,3

54,5

35,9

5,75

63,3

41,2

6 5,9

f2900 12900

62,2 67,1

41,2 42,8

66 64