Способ получения синтетической вакцины против ящура

 

Использование: ветеринария, получение вакцин против ящура. Сущность изобретения: Осуществляют взаимодействие парциальной последовательности вируса ящура VPi (135-154) серотипа О с якорным соединением - мембранным липопротеионом. Якорное соединение выбирают из группы R.S, - или смеси R,S - и, R.R диастереомеров N - пэльмитоил-5-{2,3-(биспальмитоилокси(-пропил -цистеинил-серил-сери на или его сукци-нимидного эфира. 1 з.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ! ВЕДОМСТВО СССР ! (ГОСПАТЕНТ СССР) ОП И САН И Е И ЗОБ РЕТЕ Н ИЯ К ПАТЕНТУ а

1 (21) 4613910/13 :,(22) 21.04.89

- (46) 23.08.93. Бюл. N 31 (31) P 3813821,2

1(32) 22.04.88 (33) DE (71) Хехст АГ (0Е)

j{72) Карл-Хайнц Висмюллер, Гюнтер Хесс и

Тюнтер Юнг (DE)

j(56) EP N. 0204480, кл, С07 К/00, 1986, 1(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИНТЕТИЧЕ;СКОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЯЩУРА

Изобретение касается способа получе:ния вакцины против ящура.

Несмотря на наличие различных средств для прививки, ящур в животновод, стве приводит к большим потерям. Одной из ,причин заболевания ящуром в настоящее

- время является ненадежность классических, прививочных средств (вакцин), которые со)держат умерщвленные или же инактивированные вирусы ящура (МК$-вирусы), 1 Инактивирование вирусов иногда происхо.. дит неполностью что может служить причи: ной "пост-вакцинной" вспышки ящура, Этой опасности нет у синтетических ; MKS — вакцин, так как в них будут применяться только частичные последовательно:.сти определенных вирусных протеинов, : которые не обладают функциями интактных вирусов.

Было найдено, что при применении мембранных якорных соединений и опреде. ленных парциальных последовательностей

„„!Ж „„1836102 АЗ (я)з А 61 К 39/135, С 07 К 15/16 (57) Использование: ветеринария, получение вакцин против ящура. Сущность изобретения; Осуществляют взаимодействие парциальной последовательности вируса ящура VP< (135-154) серотипа О с якорным соединением — мембранным липопротеионом. Якорное соединение выбирают из группы R,S, — или смеси R,S — и, R.R диастереомеров N — пальмитоил — Я вЂ” {2,3-(биспальмитоилокси(-пропил)-цистеинил-серил-сери на или его сукцинимидного эфира. 1 з.п.ф-лы.

»

MKS — вируса могут быть получены особенно активные MKS — вакцины, В немецкой выложенной заявке ДЕ 35 45 150 AL в качестве одной из многих возможностей применения мембранно-якорных коньюгатов активных веществ упоминается и получение синтетических вакцин, однако, при этом не следует QO ожидать, что коньюгаты мембранных якор- (Д ных соединений и парциальных последова- 0 тельностей MKS — вируса {коньюгаты мембранноякорных и активных веществ) будут показывать необыкновенную эффективность при применении относительно. небольших количеств вакцины.

Далее оказалось, что указанные вакцины неожиданным образом отличаются тем„ что они уже после одноразового примене .

3 ния обеспечивают достаточную вакцинацию. По сравнению с обычными (традиционными) вакцинами их преимущество к тому же заключается в том, что они могут сохраняться практически неограниченное время без охлаждения. l836102

Следовательно, цель изобретения — это синтетическая вакцина от ящура, отличающаяся тем, что вакцина состоит из коньюгата по крайней мере одного мембранно-якорного соединения и по крайней мере одной парциальной последовательности протеина вируса ящура.

Мембранные якорные соединения — это соединения, которые включены в биологические или искусственные мембраны, 10

Наиболее предпочтительными мембранно-якорными коньюгатами активных веществ будут те, у которых мембранноякорное соединение и активное вещество, то-есть парциальная последовательность

MKS — вируса, ковалентно связаны друг с другом.

В качестве наиболее пригодных являются такие мембранно-якорные коньюгаты активного вещества, у которых 20 мембранно-якорное соединение липопротеин, Эти липопентапептиды могут быть представлены также как мембранные якорные соединения в сокращенной форме (липоди-, липотри- или липотетрапептиды).

Наиболее предпочтительными являются N— пальмитоил — S — (2,3/биспальмитоилокси/ пропил — цистеинил — серин — серин (Ра пз Суз — Ser— - Ser (N — пальмитоил-S (2,3-/биспаль- 30 митоилокси/ — пропил) — цистеинилсерил-глицин и N — пальмитоил — S-(2,3—

/биспальмитоилокси/ пропил) цистеинил — алан ил-Д вЂ” изоглутамин.

В качестве парциальных последовательностей MKS-вируса, которые связаны с мембранными якорными соединениями, могут быть представлены самые различные парциэльные последовательности парциальная последовательность — (134-154)

40 — (135 — 1 54) — (134 — 158) — (134-160) — (141 — 160) 45 — (200 — 213) — (200 — 210) — (161 — l30) причем могут применяться последовательности всех известных серотипов и субти- 50 пав.

Наиболее пригодны синтетические вакцины, которые состоят из смеси пептидов различных серо-и/или субтипов ящурного вируса, которые смотря по обстоятельствам 55 ковалентно связаны с мембранными.соединениями.

Наиболее предпочтительны такие синтетические вакцины, которые состоят из смеси последовательностей VP 134-160 серотипов О,А,С,связанных с мембранным якорным соединением N-пальмитоил-S (2,3биспальмитоилокси/пропил)-цистеинил-се рил-серин, При применении последовательности

134 — 154 серотипа 0 и последовательности

134 — 155 серотипа А, поскольку они содержат С вЂ” терминальный лизин, они могут через я — аминогруппы ковалентно связываться с мембранными якорными соединениями, Наиболее пригодными показывают себя синтетические вакцины, изготовленные согласно изобретению, которые содержат парциальную последовательность MKS — вируса VP /1/ 135-154/.

Особенно предпочтительной является вакцина, состоящая из N — пальмитоил — S—(2,3- биспальмитоилокси/ — пропил) — цистеинил — серил — серил — VP 1/135-154/, то есть соединение ниже следующей формулы.

f35

Лг9 Тцг As АЫ -д р у 1

A× \/ А1а с=о б сн,-н-сй сн -сн сь

NQ Lgs

I 3 I с о с=о o= 154

Мембранные якорные соединения могут принципиально существовать как R, S.—, R, R — диастереомеры или как смесь диастереомеров. Однако, во всяком случае, было установлено, что вакцины, которые содержат Я, R — диастереомерное мембранное якорное соединение, показывают наиболее высокую эффективность.

Согласно изобретению предмет изобретения — это способ изготовления синтетической вакцины, отличающийся тем, что парциальные последовательности МК$— вируса посредством коньюгэционной реакции будут связаны с мембранным якорным соединением. Конъюгационной реакцией может быть конденсация, присоединение, замещение, окисление или образование дисульфидэ.

Предпочтительные конъюгационные методы отмечены в примере 1.

Пример 1. Коньюгация пептидов (протеинов с Равз CYS — Ser — Ser-0Su — или же PamaCys Ser — Ser-OH

1. Пептиды и протеины (2 ммоль пептид/протеин) растворяют в 0,5-1 мл 0MF, и вводят 8 моль (9,2 мг) твердого Рап зСуз—

1836102

er — Ser-Osu. Посредством легкого нагревасия и облучения ультразвуком получают гои огенную смесь в виде раствора и обавляют 4 ммоль органического основания (N-этилморфолин), После перемешива- 5 ния в течение 12 ч, добавляют 1-2 мл смеси

1 хлороформ: метанол (1:1), после чего происходит охлаждение в ледяной ванне в течение 2 ч.

Осадок промывают в 1 мл холодного 10 хлороформ: метанола (1;1), помещают в с чесь третбутанол (вода (3:1), (возможна обработка ультразвуком) и лиофилизуют.

2. Пептиды и протеины (2 ммоль пептид (ротеин) растворяют в 0,8 мл воды и сме- 15 ивают с 4 ммоль (4,5 мг) РатзСоз — Ser—

Ser-OH. Как правило осуществляется о новательная обработка ультразвуком до т х пор, пока не образуется эмульсия и не у тановится значение рН в пределах от 5,0 20 д 5,5, После добавления 5 мг ЕДС(1-(3-диметилам и но-пропил)-3-этил-карбодиимидг дрохлорид) растворяется в 100 мл НгО, з тем в течение 18 часов при комнатной т мпературе осуществляется перемешива- 25 нее и в заключение дважды осуществляется д ализ каждый с 1 л дистиллированной HzO.

Срдержание диализного продукта лиофилиз ют.

Пример 2. Разделение диастереоме- 30 р в от N-пальмитоил-S-(2,3-(бис-пальмитоил кси/пропил)-цистеин-третич, -бутилэфир (атзСуз-ОВ ut):

2 г РатзСуз-OB ut растворяют в 10 мл р створителя, дихлорметан (уксусный эфир) 35

21:1 (и помещают на колонну (длиной 120 см, диаметром 4 см) с M N-силигагелем 60, О, 63 — 0,2 мм (70 — 230 mesh ASTM, При скорости каплепадения 2 капли

/ ек собирают 350 фракций по 10 мл каждая 40 а иквоты каждой фракции проверяют хром тографией на силикагель — 60 — пластинах в ихлорметан /уксусном эфире(20;1), а такж на окрашивание с помощью хлор-ТДМ р актива на РаезСцз — OBut. 45

Фракции 280 — 315 содержат R. R-диа тереомеры. Фракции 316-335 — это смесь и R, К вЂ” uR, S, э фракции 336 — 354 Это R, S иастереомеры от РавзСуз-OBut.Ïîñëå в паривания растворителя на ротационном 50 и парителе и помещения остатка в теплый т етич. — бутанол и лиофилизации получают

6 ОмгR R —,370мгсмесиизR, R-uR S-u

5 0 мг R, S-РатзСуз-OBut.

Пример 3. Синтез N-пальмитоил-S- 55 (2 3-биспальмитоилокси)-пропил)-цистеин— и -серил-серил-VP (145-154) VP I пептидная и следовательность MKS — вируса серотипэ

О К синтезируют через синтез пептида в твердой фазе. Для этого используют Fmoc. аминокислоты и следующие защитные группы боковых цепей:лизин (Вос), гистидин (Fmoc), аргинин (Mtr) серин (tBul. аспарагиновая кислота (OtBu), тирозин (tBu).

Исходя из 1 г и-бензоилоксибензиловой спиртовой смолы и добавления F мос — Lys (Вос) — OH (0,47 ммоль/г), проводят следующие циклы синтеза, описанные ниже. Nактивация с 55 пиперидина в

N-метилпирролидоне (1х2 мин, 1х5 мин), преактивация Fmoc — А-А-ОН {1,5 ммоль) в

N-метилпирролидоне (6 мл) с диизопропилкарбодиимидом (1,5 ммоль) и 1-гидроксибензотриазолом (1,5 ммоль) с последующим соединением в течение 1,5 часов. После промывки N-этилморфолином {5 g, N-метилпирролидоне) преактивацию и соединение повторяют. Блокирование не замещенных аминогрупп проводят посредством ацетоангидрида (2,5 ммоль) и диизопропиламина (1,2 ммоль) в N-метилпирролидоне, После каждого этапа пептидная смола многократно промывается N-метилпирролидоном, дихлорметаном и снова N-метилпирролидоном.

После синтеза смолообразной MRS-вирус-последовательности часть пептида получают посредством расщепления трифторуксусной кислоты и проверяют с помощью HPl С, MS, аминокислотного анализа, а также анализа последовательности.

После того как 2 группы серина связывают в смолообразный пептид, осуществляется соединение трипальмитоил S-глицерилцистеина, После 4 часов производится добавление1 эквивалента N-метилморфолина, а после следующего часа осуществляется промывка липопептидной смолы. Липопептид отделяется от смолы с помощью 2 мл трифторуксусной кислоты (со 100 мл тиоанизола) в течение 4,5 часов. Фильтрат выпаривают, остаток растворяют в уксусной кислоте и вводят в охлажденный эфир. Выпадающий липопептид трехкратно промывают эфиром. Следующую очистку проводят с помощью перекристаллизации из трифторэтанол/ хлороформа в соотношении 1:3 с холодным ацетоном и несколькими каплями воды. Липопептид лиофилизую из трет.-бутанол /воды в соотношении 3:1.

Пример 4. Тест на эффективность.

Случайно выбранные морские свинки, имеющие вес от 450 до 500 г вакцинируют внутримышечно или подкожно. 0,5 мг лиофилизированной вакцины (N-пальмитоил-S-(2R, R/ — 1,2-(бис пал ьмитиоилокси)пропил)-цистеинил-серил-серил4(135 — 154) преобразовывают в эмульсию

B 500 мл смеси в соотношении 1:1 из 0,05 М фосфатного буфера и интралипида (R), 1836102

Привитые животные не показывают вторичного расстройства функций, в то время как все непривитые животные показывают полную картину ящурной инфекции, Формула изобретения

Составитель О. Комарова

Техред М.Моргентал Корректор Т. Вашкович

Редактор

Заказ 2992 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Смесь в течение 10, секунд подвергается обработке ультразвуком, Четыре животных заражают MKS-вирусом, в течение 21 дня после вакцинации им подкожно иньекцируются 500 единиц виру- 5 лентного OiK ГМД-вируса, вводимого в левую заднюю лапку. В качестве контрольных животных привлекают тех, у которых вместо вакцины было инъецировано мембранноякорное соединение или же фосфатный буфер. 10

У всех зараженных (привитых) животных был найден высокий титр нейтрализирующих антител, составляющий log>oSNso = 0,36.

Контрольные животные не имели титра антител (слепое значение 0,17). 15

Титр нейтрализующих антител определялся как логарифм разведения сыворотки, которое необходимо для того, чтобы нейтрализовать íà 50% клетки вируса в одном слое

ВНК вЂ” Baby Hamster Kodney — клеток, У 20 зараженных животных антитела могут быть обнаружены посредством антипептидной пробы ELISA (A4gz), что невозможно в случае незараженных животных.

1. Способ получения синтетической вакцийы против ящура, включающий ковалентное связывание парциальной последовательности вируса ящура VP1 серотипа 0 с якорным соединением, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве парциальной последовательности берут последовательность вируса ящура

VP)(135 — 154), а в качестве якорного соединения — мембранный липопротеин, выбранный из группы R,S, R,R -или смеси R,S — и ВЯ-диастереомеров N-пальмитоил-Я2,3-(биспальмитоилокси)-пропил цистеинил-серил-еерина или еге сукцинимидного эфира.

2, Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и-й с я тем, что. с целью повышения эффективности вакцины, мембранный липопротеин является R,R-диастереомером.