Способ определения популяций лимфоцитов на мазках

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии. Целью является повышения точности способа за счет выявления на одном мазке субпопуляций лимфоцитов и Т-лимфоцитов. Цель достигается тем, что мазок красят средой одновременно на выявление активности кислой фосфотазы и неспецифической эстеразы. Дифференциация клеток проводится по характеру распределения в клетках гранул кислой фосфотазы и кислой неспецифической эстеразы. Способ позволяет выявить Т-супрессоры и Т-киллеры, 0-лимфоциты, В-активированные лимфоциты и В-лимфоциты.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з 6 01 N 1/28

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ н (21) 4808926/14 (22) 02.04.90 (46) 07.08.93. Бюл. М 29 (71) Межотраслевой научно-инженерный центр по физике живого и микроволновой резонансной терапии пВидгук" (72) А,С,Яновская и Н.Н,Тарадий (56) Хейлоу Ф.Г,Дж, Гематологическая цитохимия, — M.:Måäèöèíà, 1983, 162 — 164, 172174. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОПУЛЯЦИЙ

ЛИМФОЦИТОВ НА МАЗКАХ

Изобретение относится -к медицине, а именно к иммунологии, и может быть. использовано в лабораторных исследованиях с целью определения иммунологического статуса организма.

Способ осуществляют следующим образом, Мазок крови из пальца, предварительно обработанного спиртом, в течение 3 мин фиксируют в пазах нейтрального формалина, промывают дистиллированной водой и сушат.

Готовят инкубационную среду следующего состава.

10 мг санафтилацетата натрия растворяют в нескольких каплях ацетона. Таким же образом готовят раствор 20 мг нафтол-ASфосфата. Полученные растворы субстратов последовательно вводят в общий ацетатный буферный раствор в количестве 40 мл, для приготовления которого 2,7 r уксуснокислого натрия предварительно растворяют в 100 мл дистиллированной воды и доводят рН

„„Ы2„„1832184 А1 (57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии. Целью является повышения точности способа за счет выявления на одном мазке субпопуляций лимфоцитов и Т-лимфоцитов. Цель достигается тем, что мазок красят средой одновременно на выявление активности кислой фосфотазы и неспецифической эстеразы.

Дифференциация клеток проводится по характеру распределения в клетках гранул кислой фосфотазы и кислой неспецифической эстеразы. Способ позволяет выявить Т-супрессоры и Т-киллеры, О-лимфоциты, В-активированные лимфоциты и В-лимфоциты.

l раствора до 5-5,4, используя для этого 50 ную уксусную кислоту (раствор М 1).

4 г фуксина основного для фуксинсернистой кислоты растворяют в 100 мл 2N раствора HCI и получают в результате 4 -ный раствор парарозанилина. На дистиллированной воде готовят 4 -ный раствор натрия ©© азотистокислого. Растворы парарозанилина и натрия азотистокислого смешивают по

8 капель каждого и после прохождения реакции азосочетания (1:..1,5 мин при нормальных условиях) получают раствор N- 2. QO

Раствор hb 2 вводят в раствор М 1, пол- фь ученную таким образом инкубационную среду нагрееаютдо ЗусC и помещают е нее "р подготовленный мазок. Время инкубации в термостате 1-2 ч. В ходе инкубации степень окраски контролируют под микроскопом.

Окрашенный мазок промывают дистиллированной водой и докрашивают для выявления ядер клеток 1 -ным раствором метилового зеленого, отмытого хлороформом от фиолетовой фракции. Затем оконча1832184

Составитель Л.Стебаева

Техред М.Моргентал Корректор С.Пекарь

Редактор

Заказ 2607 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 тельно промывают, сушат и микроскопируют с иммерсионным маслом при окуляре 10" и обьективе 90. При этом в мазках крови одновременно выявляют активность неспецифической эстераэы в виде крупно или мелкогранулярной зернистости и кислой фосфатазы в виде темно-розовых пятен или средней и мелкогранулярной зернистости, ядра клеток окрашены в зеленый цвет.

Совместная окраска мазков на неспецифическую эстеразу и кислую фосфатазу позволяет установить, что при наличии в

Т-лимфоцитах крупногранулярной зернистости, характерной для Т-хелперов, актив, ность кислой фосфатазы выглядит в виде одного темно-розового пятна. Для темнорозовых пятна кислой фосфатазы мелкогранулярная зернистость характерна для

Т-супрессоров. Для Т-киллеров характерна крупногранулярная зернистость кислой фосфатазы в виде округлых или полигональных гранул и мелкогранулярная зернистость. В-лимфоциты не выявляют активность обоих ферментов. В-активированные лимфоциты имеют мелкогранулярно-диффузную окраску кислой фосфатазы и мелкогранулярную окраску, О-лимфоциты также имеют мелкогранулярную активность. Отличия В-активированных и О-лимфоцитов состоят в том, что первые имеют размер средних или больших лимфоцитов, а также меньшую плотность окраски ядра метиловым зеленым.

Следует указать, что правильность идентификации Т-супрессоров и Т-киллеров по активности кислой фосфатазы в сочетании с типом окраски на эстреэу соответствует тому, что в Т-супрессорах и Т-киллерах должна проявляется соответственно "очень высокая" и просто "высокая" активность кислой фосфатазы.

Предлагаемый способ позволяет на одном мазке и в один прием получить полную и достоверную информацию как о популяциях лимфоцитов, так и о субпопуляциях Т5 лимфоцитов, что делает его удобным и информативным при иммунологических исследованиях.

Формула изобретения

Способ определения популяций лимфо10 цитов на мазках крови путем инкубации в среде, содержащей нафтол-А$-фосфат, парарозанилин, натрий азотистокислый и ацетатный буфер, с последующим докрашиванием ядерным красителем и идентифика15 цией клеток по размеру и наличию окрашенных гранул и лизосом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения точности способа эа счет выявления субпопуляцией Т-лимфоцитов, среда дополни20 тельно содержит а-нафтилацетат натрия при следующих соотношениях компонентов, мас. :

Нафтол AS-фосфат 50,0;..50,5 а-Нафтилацетат натрия 25,0....25,5

Натрий азотистокислый

4 -ный 3,0...3,1

Парарозанилин 4 -ный 3 0...3,1

Ацетатный буфер рН 5,0-5,2 Остальное

30 и при наличии в клетке розовой лизосомы

5...7 мкм и темно-синих гранул определяют

Т-хелперы. а розовых лиэосом более одной и мел когрануля рной темно-синей зернистости-Т-супрессоры, при наличии розовых ли35 эосом 1.0...1.5 мк и темно-синей мелкогранулярной зернистости-Т-киллеры, а розовой и темно-синей мелко- и среднегранулярной зернистости-О-лимфоциты и

В-активированные лимфоциты, а при отсут40 ствии лиэосом и гранул в клетке- В-лимфоциты.