Способ получения средства для диагностики группы крови

 

Использование: медицина, диагностика . Цель: повышение стабильности средства . Сущность изобретения: диагностическое . средство состоит из реагентов а нти-А, анти-В, анти-АВ и, факультативно, анти-D, анти-С и анти-Е, которые фиксированы в полостях, образованных на поверхностно обработанном алюминиевом листе. Средство получают помещением капель указанных реагентов в полости поверхностно обработанного алюминиевого листа и фиксацией их на листе вакуумной сушкой в два этапа. 1 табл,

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s G 01 и 33/86

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕ Н 1У (21) 3987366/14 (22) 22.11.85 (46) 23.07.93. Бюл. М 27 (31).4358/84 (32) 23.11.84 (33) HU (71) Хуман Жидан Олтоаньагтермеле Еш Кутато Интезет (HU) (72) Иожеф Жидаи, Розалия Банкути. Иштван Машек, Гизелла Весели и Иожеф Сокол (HU) (56) Eldon К. Danish Medical Bulletin, 1955, v.2, М2, р.33 — 44, Изобретение относится к способам получения средства для быстрой диагностики группы крови.

Цель изобретения — повышение стабильности средства.

Получаемое по предлагаемому. способу средство для быстрой диагностики группы крови содержит анти-А, анти-В, анти-АВ и факультативно анти-О, анти-С и анти-Е реагенты, которые зафиксированы в полостях, образованных на поверхностно обработанном листе алюминия. Способ получения средства для быстрой диагностики состоит

s том, что помещают реагенты анти-А, анти- .

В, анти-АВ и факультативно анти-а, анти-С и анти-Е в полости поверхностно обработанного алюминиевого листа и фиксируют реагенты на алюминиевом листе двухзтапной вакуумной сушкой.

В качестве носителя средства для быстрой диагностики в соответствии с изобретением используется алюминиевый лист толщиной 0,25 — 0,5 мм, В листе прессовани- . ем фо рмуются полости диаметром 10-30 мм

„; Я2,, 1830143 АЗ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ

ДИАГНОСТИКИ КРУПП КРОВИ (57) Использование: медицина, диагностика. Цель: повышение стабильности средства, Сущность изобретения: диагностическое . средство состоит из реагентов анти-А, анти-В, анти-AB и, факультативно, анти-Р, анти-С и анти-Е. которые фиксированы в полостях, образованных на поверхностно обработанном алюминиевом листе. Средство получают помещением капель укаэанных реагентов в полости поверхностно обработанного алюминиевого листа и фиксацией их на листе вакуумной сушкой в два этапа. 1 табл. и глубиной 0,3-0,6 мм. Число формуемых полостей зависит от требуемого количества реагентов, которые необходимо поместить на носитель; требуется еще одна дополни- Я тельная полость для контрольной пробы.

Лист носителя, выпрессованный и обрезанный до соответствующих размеров, подвергается поверхностной обработке в ванне двуокиси калия с последующим обильным прополаскиванием теплой и холодной во- О дой и затем спиртом. ° аааЪ

Для получения. средства для быстрой фь диагностики в соответствии с изобретением (Ъ используются реагенты анти-А, анти-В, и анти-АВ, принадлежащие к главным группам крови, а также реагенты анти-D, анти-С, анти-Е и т.д., принадлежащие к резус-системе.

Реагенты, принадлежащие к главным группам крови, приготовляются таким образом, что сыворотка или плазма, очищенная от фибриногена соответственно крови. принадлежащей к группам крови А(анти-B), (анти-А) и О (анти-АВ), имеющим очень высокую способность поглощать кислород(начинаю1830143 щим агглютинацию через 2-5 с и создающим 4-перекрестную агглютинацию в течение 3 мин), смешиваются в соответствии с группами крови в асептических условиях, инактивируются термообработкой, фиксируются, адьювируются и фильтруются в стерильное состояние, Инактивация осуществляется тепловой обработкой, длящейся в течение примерно

30 мин при 50-60 С. Прошедшие тепловую обработку реагенты могут фиксироваться, например, азидом натрия. Может быть добавлен в качестве адъювирующего агента лиофилизирующий добавочный (вспомогательный) материал, например сахароза, в количестве около 3 .

Реагенты, принадлежащие к резус-системе, приготовляются соответственно из сыворотки или плазмы крови анти-В, анти-С, анти-Е и т.д. аналогично реагентам, принадле>кащим к главным группам крови; однако к реагентам добавляются также адьювирующие агенты, способствующие агглютинации. например фиколль, глицин и метилцеллюлоза.

На приготовленные листы в асептических условиях наносятся капли, содержащие па 0,03 — 0,05 мл реагентов. Помимо реагентов, принадлежащих резус-системе, добавляются также капли по 0,03 — 0,05 мл

1 Д -ного раствора папаина, активированного цистином и цистеином для определения ферментным методом, затем реагенты высушиваются HB носителе двухэтапной вакуумной сушкой, Эта сушка осуществляется в лиофилизирующем оборудовании (машина) или в установке вакуумной сушки. Первый этап сушки осуществляется при давлении

100-300 мм рт,ст„п редпочтител ь но и ри давлении 200 мм рт.ст., и при температуре

15 — 25ОС, предпочтительно при 20" С; второй этап сушки осуществляется при давлении

0,05-0.5 мм рт.ст., предпочтительно при давлении 0,1-0,05 мм рт.ст., и при температуре 30 — 50 С, предпочтительно г1ри 40ОС, Весь период сушки длится примерно 3 — 5 ч.

При использовании реагенты растворяются одной каплей водопроводной воды (каждый из них), а капля контрольного образца помещается в предназначенную для него полость. Определение группы крови может осуществляться с использованием образцов крови, взятых непосредственно из пальцевой подушечки и получающихся из коагулированной крови или иэ крови, содержащей препятствующий коагуляции агент.

Контрольный образец приводится в контакт с реагентами при помощи соответствующего приспособления, например, путем смешивания с полистироловыми гранулами вместе с диагностикой. Лист затем несколько раэ наклоняется. а затем помещается на горизонтальную поверхность и оценивается спустя 3 мин.

Преимущества средства для быстрой диагностики в соответствии с изобретением состоят в следующем. В сравнении с известным способом средство более стабильно (срок годности — минимум 3 года, по прото10 типу — 2 года максимально). Носителем является поверхностно обработанный алюминиевый лист, делающий обильной любую пропитку, специальное покрытие или изолирующий слой, Нанесение реаген"5 тов и определение группы крови облегчаются благодаря выполненными в листе полостям. Адгезия (прилипание) реагентов к поверхности алюминиевого листа стабильна; при использовании реагенты раствори20 мы водопроводной водой и растворение

- происходит немедленно.. Реакция очень хорошо заметна на алюминиевом листе. Сред- ство быстрой диагностики в соответствии с изобретением содержит также реагент ан25 ти-АВ, поэтому возможности ошибок уменьшены и определение группы крови может осуществляться безошибочно, Определение группы крови, реализуемое таким образом, эквивалентно определению группы

30 крови, осуществляемому в лабораторных условиях. Вследствие этого теплопроводность алюминиевого листа. содержание воды в реагентах могут быть сведены к минимуму сушкой в вакууме; поэтому диагностическое

35 средство может храниться даже при комнатной температуре без изменений его качества в течение сравнительно длительного, времени (от 2 до 5 лет), Пример. Получение реагентов, при40 надле>кащих к основным группам крови.

Сыворотки крови с титром не менее t,64 анти-А, анти-В или не менее I:32 анти-АВ соответственно, имеющие хорошую способность поглощения кислорода (начинает

45 свертывание через.2 — 5 с и создает 4-перекрестную агглютинацию через 3 мин), смешивают в соответствии с каждой из групп крови в асептических условиях, фиксируют добавлением 0,1 азида натрия и послв до50 бавления 3 ), сахарозы инактивируюттепловой обработкой при 56 С в течение 30 мин, а затем фильтруют через очищенный и стерилизующий фильтр. .Плазмы крови с титром не менее 1:128

55 анти-А, анти-В или не менее 1:64 анти-АВ соответственно. имеющие хорошую способность поглощения кислорода, смешиваются в соответствии с каждой из групп крови в антисептических условйях, фиксируются добавлением 0,17, азида натрия и освобожда1830 1.43 ются от фибриногена добавлением левулината кальция или дигидрата хлорида кальция, затем обрабатываются так же. как и сыв ротки.

Получение реагентов. принадлежащих резус-системе, Сыворотки крови с титром не менее

1, 128 анти-0, анти-С, анти-Е и т.д. фиксируют добавлением 0,1% азида натрия, смешивают. соответственно с каждой из групп крови в антисептических условиях и инактивируют при 560С в течение 60 мин. Затем нерегулярные агглютинины удаляют абсорбцией, добавляют 3% сахарозы, 2% глицина и, для ускорения свертывания, 0,3-0,5% фиколла, а также 0,01 — 0,02% метилцеллюлозы и фильтруют в стерильное состояние.

Плазмы фиксируют аналогичным образом добавлением 0,1% азида натрия, освобождают их от фибриногенов добавлением дигидрата хлорида кальция или тромбина, а затем обрабатывают так же, как и сыворотки.

Способность к поглощению кислорода у реагента удовлетворительная, когда реакция начинается в пределах 1 мин. и увеличийается до максимальной в пределах 3 мин.

Для определения неполной гемагглютининности требуется также раствор с 1% папаина, который приготовляют при помощи фосфатного буфера 1 (15 моль) л, активированного добавлением гидрохлорида 1-цистина и 1-цистеина, и который содержит

0,0125% метилцеллюлозы. . Получение носителя, При использовании анти-.А, анти-В, анти-АВ и анти-D формуется пять полостей прессованием на.алюминиевом листе толщиной 0,25 — 0,5 мм. Глубина этих полостей составляет 0,3 — О,б мм. Четыре полости имеют диаметр 15 мм, а пятая полость должна быть больше и имеет диаметр, например, 30 мм. После прессования и вырезания листы выдерживаются в 20%-ном растворе гидроокиси калия при 90 С. в течение 3 мин. а затем обильно споласкиваются теплой и холодной водой и затем спиртом.

Получение диагностического средства.

0,03 мл реагентов анти-А, анти-В и анти-AB каплями помещают в три малых полости приготовленного и поверхностно обработанного листа. Четвертую малую полость оставляют пустой для образца крови.

В большую полость капают 0,3 мл реагента анти-В, а немного позже 0,05 мл активного раствора папаина. Реагент, принадлежащий к резус-системе, может быть также нанесен на другой лист.

После этого листы помещают в лиофилизирующую установку и начинают двухэтапную вакуумную сушку, На первом этапе вакуум неглубок (около 200 мм рт,ст.) и темпе5 ратура низка (20 С), на втором этапе вакуум глубок (0 1 — 0,05 мм рт.ст.) и температура выше (40 С).

Дополнительные примеры на средние и граничные значения даны в таблице.

10 При использовании этого способа вещество высушивают при сравнительно низкой температуре даже беэ замораживания, поэтому можно избежать изменений структуры белка и, как следствие, снижения активно15 сти из-за замораживания.

Приготовленное таким образом диагностическое средство упаковывают вместе с полистироловыми гранулами в мешочки иэ алюминиевой фольги и герметично закрыва20 ют.

Определение групп крови осуществляют при комнатной температуре. На алюминиевой пластине находятся. четыре углубления (выемки), из которых первые три

25 содержат реактивы (анти-AB. анти-B. антиА. тест-сыворотки), в четвертое капают каплю определяемой крови.

Тест-сыворотки растворяют, используя по капле (примерно 30 мкл) водопроводной

30 воды. Тест-сыворотки растворяются в несколько секунд.

Каплю определяемой крови (свернутой или лишенной возможности свертываться) помещают в четвертое углубление. Опреде35 ление также можно осуществлять с помощью получаемой иэ кончика пальца крови, когда кровь прямо из кончика пальца капает в углубление. Определяемую кровь с помощью палочек, которые упакованы наря40 ду с пластиной, тотчас переносят далее, конец палочки окунают в кровь и прилипшую к палочке кровь хорошо смешивают с тест-, сывороткой. Другой конец палочки используют для смешения крови со второй

45 тест-сывороткой. Таким образом, достаточно двух палочек для смещения крови с тремя тест-сыворотками, Пластину в течение Нескольких секунд неоднократно покачивают, затем ставят на

50 ровное место, Спустя 3 мин пластину покачивают туда и обратно под углом примерно

ЗО и результаты считывают невооруженным глазом, Формула изобретения

Способ получения средства для диагностики группы крови путем нанесения на носитель реагентов анти-А, анти-В и анти-о, отличающийся тем, что, с целью . повышсния стабильности средства, допол1830143

Составитель H. Гуляева

Редактор Л. Полионова Техред M,Mîðlåíòàë: Корректор Г, Кос м

Заказ 2493 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Грос нительно используют в качестве реагентов антисыворотки анти-.АВ, анти-С и анти-.Е, в качеетве носителя — алюминиевый лист, антисыворотки перед закреплением на носителе .обрабатывают азидом натрия, полученный реагент каждой антисыворбтки помещают по одной капле в полости алюминиевого листа и закрепляют сушкой в вакууме, которую проводят в два этапа, причем на первом этапе при 15-25 С и 100-300 мм

5 рт.ст., а на втором — при 30-50 С и 0,05-0,5 мм рт.ст.