Способ получения атоксигенных вариантов возбудителя сибирской язвы

 

Использование: микробиология, сибирская язва, возбудитель, атоксигенность, отбор , селекция. Сущность изобретения: в плотную питательную среду вводят в концентрации 15-25% коммерческую лечебную антитоксическую сыворотку, засевают 105- 10 спор культуры, ингибируют при 37°С в атмосфере 6-25% углекислого газа в течение 18-24 ч и колонии атоксигенных клонов отсевают иглой на свежую среду. Способ обеспечивает атоксигенность всех полученных вариантов В. anthrans. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1807079 А1 (Я)5 С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4791684/13 (22) 14,02,90 (46) 07,04.93. Бюл, М 13 (71) Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (72) А, И. Шелохович. А. В. Липницкий и С. М. Лихолетов (56) Патент США N. 4328209, кл. А 61 К 39/106, 1982, Infect. ImnIunol., 1983, v. 39, р. 371-376, Изобретение относится к медицине, а более конкретно к микробиологии и иммунологии.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа. Эта цель достигается тем, что в среду для выращивания В.

anthracis.ââîäÿò в концентрации 15 — 20% коммерческую лечебную антисибиреязвенную сыворотку, содержащую антитоксические антитела, которые в специальных условиях ингибируют рост токсигенных клеток, но не ингибируют рост вариантов, не имеющих плазмиды токсигенности, т.е. атоксигенн ых.

Этот неизвестный ранее для В.

anthracts эффект проявляется в первые 18—

24 ч инкубации, при последующем выращивании Тох — клетки прорастают.

Дальнейшее упрощение и ускорение способа достигается за счет отказа от необходимости исследовать выросшие колонии на отсутствие (наличие) токсинопродукции по (56) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АТОКСИГЕННЫХ ВАРИАНТОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ (57) Использование; микробиология, сибирская язва, возбудитель, атоксигенность, отбор, селекция. Сущность изобретения: в плотную питательную среду вводят в концентрации 15-25% коммерческую лечебную антитоксическую сыворотку. засевают 10—

10 спор культуры, ингибируют при 37 С в

7 атмосфере 6 — 25% углекислого газа в течение 18-24 ч и колонии атоксигенных клонов отсевают иглой на свежую среду, Способ обеспечивает атоксигенность всех полученных вариантов В. anthrans. 4 табл. вышеперечисленным тестам, применяемым

t в известном способе. и

Описанные принцип и система выявления атоксигенных вариантов в полной мере осуществимы на бескапсульных штаммах В. д

anthracis. Поэтому при необходимости пол- 0С1 учения атоксигенных вариантов иэ популяции капсульных штаммов необходимо предварительное выделение из них бескапсул ь н ых клонов.

О

Испытуемую культуру засевают на пол- К.) усинтетическукг среду известного состава . (Haittt:s et ai., 19бб1 с добавлением агарозы.

Данная среда обеспечивает получение изо( лированных колоний атоксигенных вариантов В. anthracis. Посевы инкубируют в течение 18 — 24 ч. при 37 С в атмосфере 625% СО2. Посевной материал наносят на

5 плотную среду в дозе, не меньшей 10 -10 клеток.

Сочетание указанных приемов позволиt ло достичь укаэанной цели и обеспечить

1807079 атоксигенность всех получаемых вариантов

B. anthracis.

Пример 1. Получение атоксигенных вариантов из популяции бескапсульных вакцинных LuтàMмов В, апйrас s СТИ и

Стерне.

Готовится среда следующего состава (Haines B, W., Klein F. à. Lincoln R. Е, Quantitative assay for crude anthrav toxins //J.

Bacteriol. — 1965, — v. 89 — N 1, — P. 74-83), мг/л:

CaClz 2 НгО 7,36

Mg S04 7 НгО 9,9

MnS04 Hz0 0,9

КНгР04 680,0

КгН Р04 872.0 йаНСОз 9900,0

Тиамин НС! 0,5

Аденин-сульфат 2,0

Урацил 1,4

Л-триптофан 52,0

Л-цистеин 1,0 . Л-глицин 15,0

Казаминовые кислоты 3600,0

Глюкоза 2000,0 .Агароэа До 2 /

Дистиллированная вода До 1 л рН среды 8,5

Непосредственно в день работы в расплавленную и охлажденную до 45 С среду вносят коммерческую лечебную антисибиреязвенную сыворотку до 20 /О, бикарбонат и глюкозу; среду разливают в чашки Петри.

Инокулум В. anthracis для посева на среду готовят в концентрации 10 клеток на 1 мл, Засевают на пластинки среды пипеткой по

0,1 мл или петлей из агаровой колонии 1 — 2 сут возраста, Общее количество клеток внесенных на пластинку агара должно быть не менее 10 .

Чашки инкубируют при 37 С в атмосфере СОг (от 6 до 25 /) в течение 18-24 ч, Вырастающие колонии являются атоксигенными вариантами, их отсевают на свежую среду иглой. Колонии, вырастающие после

26 ч. инкубации, являются Тох -вариантами.

Атоксигенность полученных клонов по предлагаемому способу удостоверяется методами ин виво (заражение крыс линии Фишер или внутрикожной пробой на морских свинках с культуральной жидкостью исследуемых клонов) и ин витро (иммунодиффузия с антитоксической сывороткой и плаэмидный анализ), Пример 2. Получение атоксигенных вариантов из популяции капсульных вирулентных lllTGMMOB В, anthlac!s 88/1 и 44/1.

Взвесь спор (не менее 10 /мл) по 0,1 мл высевают на пластинки упомянутой среды, содержащей 20 /, нормальной лошадиной сыворотки. Посев инкубируют 1-2 сут в атмосфере 6-25/ СОг при 37 С. Среди выросших слизистых колоний (капсульные клоны) отбирают шероховатые колонии или секторы колоний (бескапсульные клоны). Последние высевают на данную среду с антисибиреяэвенной сывороткой (см. при- мер 1) и через 1 сут снимают атоксигенные клоны.

Пример 3. Получение атоксигенных вариантов В. anthracis СТИ и Стерне в присутствии разных концентраций иммунной сыворотки. Все этапы работы те >ке, что и в примере 1, за исключением того, что сыворотку вводят в концентрации 10, 15, 25, 30, Результаты отражены в табл. 1.

Таким образом, оптимальной концентрацией антисибиреязвенной сыворотки для получения Тох вариантов является 15 — 25/.

Пример 4. Г!олучение атоксигенных вариантов В. anthracis Сти и Стерне в зависимости от концентрации посевного материала, Все этапы опыта те >ке, что и в примере 1, за исключением того, что дозы посевного материала варьировали: 10, 10, 5 7

10 и 10 спор. Результаты отражены в табл. 2.

Таким образом, оптимальной для получения Тох вариантов является посевная доза 105-10 спор.

Пример 5. Получение атоксигенных вариантов В. anthracis Сти и Стерне в зависимости от концентрации СОг. Все этапы опыта те же, что и в примере 1, за исключением того, что посевы выращивали при разных концентрациях COz. Результаты отражены в +абл. 3, Из табл. 3 видно, что существенным фактором является наличие СОг в инкубаторе (при концентрации газа меньше чем 6 / наблюдается недифференцированный рост обоих типов колоний). Повышение концентрации газа более 6 / не влияет на результат.

Пример 6. Получение атоксигенных вариантов при различных сроках инкубации

Все этапы опыта те же, что и в примере

1, за исключением того, что посевы выращи50 вали 10, 18, 24 и 36 ч. Реэультать. отражены в табл. 4, Таким образом. оптимальный срок инкубации культур по предлагаемому способу

18 — 24 ч.

55 Суммируя вышеизложенное можно заключить, что предлагаемый способ позволяет получать атоксигенные варианты В, anthracis, Последние могут найти применение при генетических исследованиях (для изучения признака токсинообразования у

1807079

Таблица 1

Зависимость выхода Тох — вариантов от различных концентраций антисибиреязвенной сыворотки

Обозначения: + — наличие колоний Тох — вариантов — — отсутствие роста

x — совместный рост Тох и Tox — вариантов.

Таблица 2

Учет роста Тох — колоний пр разной посевной дозе

Обозначения те же, что и в табл, 1

+ — редко встречающиеся Тох -колонии.

Таблица 3

Зависимость выхода Tox — вариантов от различных концентраций COz

Обозначения те же, что и в табл. 1 микроба, для внедрения в бесплазмидные штаммы любых других плазмид с полезными свойствами), а сам способ может быть применен при исследовании соотношения

+ числа Тох (иммуногенных) и Тох (неимуногенных) клеток в популяциях культур В, anthracis, предназначенных для использования в качестве вакцин, Формула изобретения

Способ получения атоксигенных вариантов возбудителя сибирской язвы путем посева спор в питательную среду, инкубирования в условиях, обеспечивающих элиминацию плазмиды токсигенности, с последующим пересевом и скринингом колоний на плотной питательной среде. о т л и ч а ю5 шийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, для посева используют плотную питательную среду, включающую

15-25 лечебной антисибиреязвенной сыворотки, засевают спорами в концентрации

10 10 — 10 кл/см, а инкубируют при 37 С в атмосфере 6 — 25 углекислого газа в течение 18-24 ч.

1807079

Таблица 4

Учет роста колоний Тох -вариантов при различных сроках инкубации

В емя инк ба ии, ч

Штамм

10

36

Редактор Л.Волкова

Заказ 1360 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР . 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Стк

Сте не

Составитель А.Шелохович

Техред M.Моргентал Корректор Н,Гунько х х