Способ обнаружения цитоплазмы неliаnтнus ретiоlаris в клетках неliаnтнus annuus

 

Использование: в сельском хозяйстве при селекции и семеноводстве подсолнечника . Сущность изобретения состоит в том, что осуществляют гибридизацию тотальной ДНК из раздавленных тканей со специфическим зондом, сконструированным на основе EcoRI-EcoRI-фрагмента ДНК Helianthus annuus, размером 1200 н.п. 4 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 0 1/68

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕ НТУ (21) 4901294/13 (22) 09.01.91 (46) 23.02.93. Бюл. N. 7 (71) Всесоюзный селекционно-генетический институт (72) Ю.М,Сиволап и Л,Н,Споэито (73) Всесоюзный селекцион но-генетический институт (56)РгосеесИпцз of the 12 th international

sunflower conference, Novi Sad, Jugoslavla, J ul1, 25, to 29, 1988, чЛ 1, р.321-327.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции и семеноводству подсолнечника.

Цель изобретения — упрощение процедуры, уменьшение затрат и сокращение времени обнаружения цитоплаэмы Heliantus

petiolaris в сортах, гибридах и линиях

Helianthus аппюз, позволяющий сохранить проанализированные растения для дальнейшей селекционно-генетической работы.

В селекции подсолнечника широко используется скрещиввние культурного

Helianthus annuus и дикого Н.pet1olaris видов подсолнечника. Гибридизация производится с целью создания форм с цитоплазмитической мужской стерильностью.и передачи ряда хозяйственно-ценных признаков от дикого к культурному виду.

Для идентификации цитоплаэмы обычно необходимо выращивание растений и оценка морфологических признаков, в то время как такая информация часто необходима до посева растений.

Установлено, что цитоплаэма различных видов содержит митохондрии, характе„„. Ы„„1797625 АЗ (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЦИТОПЛАЗМЫ HELIANTHUS PETl0LARlS В КЛЕТКАХ

HELIANTHUS ANNUUS (57) Использование: в сельском хозяйстве при селекции и семеноводстве подсолнечника, Сущность изобретения состоит в том, что осуществляют гибридизацию тотальной

ДНК иэ раздавленных тканей со специфическим зондом, сконструированным на основе

EcoR1 EcoR1-фрагмента ДНК Hellanthus

annuus, размером 1200 н.п. 4 ил. ристики которых могут в известной мере различаться. Гак, митахондриальная ДНК культурного подсолнечника в отличие от

Н,petlolarls содержит специфическую плаз-. мидоподобную ДНК (Brown С,, Bussey H., DesRosiers L., 1986). Молекулярно-биологическая технология позволяет выделить зту

ДНК и ввести в состав бактериальной плазмиды для создания зонда — молекулярного маркера.

Молекулярная ДНК:ДНК гибридизация позволяет с высокой чувствительностью и надежностью выявить материал, содержащий плазмидоподобную митохондриальную ДНК Н.annuus. Dot — гибридизация делает возможным анализ большего количества образцов. Это имеет большое значение для семеноводства гибридного подсолнечника. В случае механического смешения семян закрепителей стерильности и мужски-стерильных форм предлагаемый метод позволяет оценить степень загрязнения материала, обозначить закрепители и стерильные формы и выСеять их отдельными рядами в оранжерее или в поле.

1797625

Таким образом, мы предлагаем биотехнологический способ для определения цитоплазмы Н.annuus и Н.petlolarls, который состоит в том, что кусочки растительной ткани раздавливаются на мембранных фильтрах с последующей щелочной денатурацией и гибридизацией со специфическим ДНКзондом. Детекция цитоплазмы на принадлежность к Н.annuus или Н.petlolarls осуществляется по наличию или отсутствию авторадиографического сигнала соответственно.

Пример. Для идентификации цитоплазмы H=petlolarls в сортах, гибридах и линиях Н,annuus использовали 6 — 8-дневные проростки. Для этого 20-40 мг тканей анализируемых растений (корни, проростки) раздавливали стеклянной палочкой на мембранном фильтре. Для лизиса клеток из раздавленных тканей и связывания с мембраной, освобождающейся из клеток денатурированной ДН К гомогенат ткани обрабатывали 10 минут раствором 0 5 M

NaOH. Фильтр промывали 50 мл трис-HCI, рН 7 5 и кипятили 5 мин, в 1,5, растворе . SDS для снижения неспецифического связывания и уменьшения фона. Остатки лизированных тканей удаляли механически ватой, смочен ной 1,5 $ раствором S D S.

Фильтры сушили на воздухе, а затем при

70 С в вакуумном шкафу.

Предгибридизацию фильтра проводили в запаянном полиэтиленовом пакете в

4xSSC, 0,5$ SDS; 10 х Денхардт (50 х раствор содержит 5 r фикола, 5 r поливинилпирролидона. 5 г БСА, 500 мл HzO) в течение 1-6 часов при 64 С. Для гибридизации фильтр инкубировали в минимальном объеме того же раствора с 3-5х10 импlмин зонда в

6 течение ночи при 64 С. Отмывку после гибридизации проводили в 4-5.сменах

0,2xSSC, 0,5 ЯО$ с последующим экспонированием фильтра на рентгеновской пленке в течение 16-72 часов и проявлением.

Исходным материалом для получения зонда послужила плазмидоподобная ДНК названная PIT-плазмидой, выделенная из митохондрий, Н.annuus, линия Од-1076.

Плазмиду разрезали по сайту Sau 3A и лигировали по 8am Hl сайту с плаэмидой риС 18.

Клетки культуры NM 522 трансформировали продуктами рестрикции лигирования.

Селекцию клонов вели на LB-среде с ампициллином в присутствии х-gal u iptg. Рекомбинатнуа плазмиду разрезали рестриктазой EcoR 1. В качестве зонда ис пользовали большой фрагмент плаэмидоподобной ДНК, расположенной между сайтами рестрикции для Есор! (рис.1,2).

Рис. 1. Лигирование плазмид риС 18 и

PIT рестриктированных Bam Hl u Sau ЗА соответственно.

Рис.2. Рестрикция рекомбинантной плаэмиды, 1. маркер: риС 18, рестриктаза EcoR I— верхняя полоса; риС 18, рестриктаза Bgl I — две нижние полосы;

10 2. нерестриктированная рекомбинантная плазмида;

3. рекомбинантная плазмйда, рестриктаза EcoR l(a качестве зонда используется нижний фрагмент);.

15 4. рекомбинантная плазмида, рестрик таза Bgl!, 5. рекомбинантная плазмида, рестриктаза Рм I, Рис.3. Авторадиограмма гибридизации

20 тотальной ДНК из тканей H=annuus co специфическим зондом (клонированный фрагмент плаэмидоподобной ДНК из митохондриальной Н,annuus).

Верхний ряд — корни, нижний ряд — проростки

1. линия Од-543 (цитоплазма

H.annuus) .

/.

2. линия ЦМС Од-543 (цитоплазма

H. petloIarl s)

30 3. линия Од-1036 (цито плазма

H.annuus)

4. линия ЦМС Од — 1036 (цитоплаэма

H.petiolarls);

5. линия Од-69 (цитоплазма Н.annuus)

35 6. линия ЦМС Од-69 (цитоплазма

Н.petiole rls) j

7, линия Од-3369 (цитоплазма Н.аппоиз);

8. Линия ЦМС Од-3369 (цитоплазма

Н.petlolaris), 40 . Рис.4. Авторадиограмма гибридизации тотальной ДНК иэ корней H;annuus со специфическим зондом (фрагмент плазмидоподобной ДНК из цитоплазмы H;petiolarls). а,в,д.ж — ЦМС вЂ” растения линии 1036 с

45 цитоплазмой Н.petiolaris; б,г,е,з — фертильные растения линии

1036 с цитоплазмой Н.annuus, В процессе лигирования возможно образование двух типов рекомбинантных

50 плазмид рис. 1а, б. В качестве зонда испольэовали. фрагмент рекомбинантной плаэмиды, расположенный между EcoR I сайтами, как это показано на рис.1а.

Введение метки в зонд осуществляли ник-трансляцией с использованием 32РdNTH и ДНК-полимеразы 1 из Е.coll;

На рис.3 представлена авторадиограмма, полученная после гибридизации фильтра с меченым зондом. На фильтре была фиксирована ДНК из проростков и корней

1797625

3 е1 с

C «е м

Есаул

З щ И

5аи ЛА

Мч

Лиеирееоиие с РЕТ, рестриетире доийии по $аи.7А

Н.annuus с цитоплазмами Н.annuus u

Н.petlolarls. Позитивный сигнал свидетельствует о присутствии в цитоплазме анализируемого растения плазмидоподобной ДНК, а значит, принадлежности ее к Н.annuus, Негативный сигнал говорит о принадлежности цитоплазмы исследуемого растения к

Н. peti ola rl s.

На рис.4 представлена авторадиограмма, выполненная аналогично авторадиограмме, представленной на рис.З, для корней 40 анализирова нных растений, 20 из которых несли цитоплазму Н.petlolaris, а другие 20 — Н annuus.

Формула изобретения

Способ обнаружения цитоплазмы

Hellanthus petlolarls в клетках lellanthus

annuus, включающий фиксацию клеточного материала растений на мембранных фильтрах, проведение ДНК-гибридизации с фиксированным материалом, оценку

Таким образом, для определения цитоплазмы Н.annuus и Н,petlolaris разрабатана биотехнологическая система дифференцировки, основанная на Dot — гибридизации.

5 Молекулярная ДНК;ДНК гибридизация позволяет детектировэть соответствующую радиоактивному зонду плазмиду в составе тотального препарата. Особенностью метода является создание зонда — детектора

10 цитоплазмы Н.annuus и технология его использования для участков тканей растений, что позволяет их использование в дальнейшей селекционной или семеноводческой практике.

15 полученных результатов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа, на мембранных фильтрах фиксируют тотальную ДНК, а гибридизацию проводят с ДНКзондом, который представляет собойEcoRl-EccRl фрагмент митохондриальной

ДНК Helianthus annuus размером 1200 н.п.

1797625 г 3

Составитель Ю.Сиволап

Техред М.Моргентал Корректор А,Козориз

Редактор Т.Куркова

Заказ 665 Тираж . Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35; Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101