Олигодезоксирибонуклеотид в качестве универсального праймера для определения первичной структуры днк по методу сенгера
Изобретение касается нуклеотидов, в частности олигодёзоксирибонуклеотида формулы tf-dfG G Т G С G G G С С Т СТ Т С G С Т)-3 в качестве универсального праймера для определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера. Цель изобретения - создание нового праймера, позволяющего увеличить разрешающую способность структурных гелей и упростить определение первичной структуры ДНК по методу Сенгера. Синтез нового нуклеотида ведут на трехколоночном полуавтоматическом синтезаторе, сконструированном на основе управляемого блока ВЭЖХ Altex и 6-ходовых кранов фосфитным методом. В качестве носителя берут Счлохром С80, содержащий аминопропильную группу (размер частиц 100-200 мкм, диаметр пор 400-600 А), а качестве мономерных компонентов используют и N-замещенные 3 -{М,Г -диизопропиламид)метилфосфиты нуклеозидов. Для защиты берут диметокситритильную группу, для блокирования экзоциклических аминогрупп цитидина и аденозина - бензоильную группу. На носитель сажают первое звено, а последовательность операций при присоединении каждого мономерного звена ведут известным путем с последующим снятием защитных групп известными приемами и определением структуры секвенированием по методу МзксамэТилберга. Новый нуклеотид комплементарен (+}-цепи фагов М13 тр, Сайт отжига праймера расположен на расстоянии 120 нуклеотидов от области полилинкера. Разрешающая способность обычного геля с применением данного праймера выше, чем с применением известного, и сравнима с разрешающей способностью градиентного геля с использованием известного праймера . Это позволяет вести чтение с одного простого геля на клон на 100-130 нуклеотидов больше и упрощает определение первичной структуры ДН К по методу Сенгера за счет исключения применения специальных методов. 1 ил., 2 табл. JWOTB Vs-,.. .raS XI
СОЮЗ СОВЕТСКИХ сОциАлистических
РЕСПУБЛИК
„„SU „„1700004 А1
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Изобретение относится к новому хими- 5-d (G G Т G С G G G С С Т С Т Т С G С Т)-3, ческому соединению, конкретно к олигодезоксирибонуклеотиду формулы (1) (21) 4720034/04 (22) 12.05.89 (46) 23,12.91. Бюл. М 47 (71) Институт биоорганической химии им. М,М.Øeìàêèía (72) А.М.Бородин, И.П,Чернов, Т.Л.Ажикина, B.М.Ростапшов и А.В.Данилкович (53) 547.455 (088.8) (56) Oukworth МЛ ., Gait M.l., Goelet Р, et а1, Rapid synthesis of oligonucleotldes Vi.
Efficient Synthesis of peptadecadeoxyrlbonucleotides by an improved solid
phase phosphotriester roUte. — Nucl. Acid
Res., 1981, v. 9, р. 1691 — 1706.
Sanger F., Nlcklen S., Coulson А,R. DNA
Sequencing with chain terminatlng inhibitors.—
Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1977, ч. 74, р. 5463-5467. (54) ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИД В
КАЧЕСТВЕ УНИВЕРСАЛЬНОГО ПРАЙМЕРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ
СТРУКТУРЫ ДНК ПО МЕТОДУ СЕНГЕРА (57) Изобретение касается нуклеотидов, е частности ол игодезоксирибонуклеотида формулы Ь -d(G G Т G С G G G С С Т CT Т С
G С T)-3 в качестве универсального праймера для определения первичной структуры
ДНК по методу Сенгера. Цель иэобретения— создание нового праймера, позволяющего увеличить разрешающую способность структурных гелей и упростить определение первичной структуры ДНК по методу
Сенгера. Синтез нового нуклеотида ведут на трехколоночном полуавтоматическом синтезаторе, сконструированном на основе управляемого блока ВЭЖХ "Altex" и 6-ходовых кранов фосфитным методом. В качестве носителя берут Силохром С80, содержащий аминопропильную группу (размер частиц
100 — 200 мкм, диаметр пор 400 — 600 А), в качестве мономерных компонентов ис-: пользуют 5 -0 и N-эамещенные 3 -(N,N-диизопропиламид)метилфосфиты нуклеозидов.
Для защиты 5 -0 берут диметокситритильную группу, для блокирования экзоциклических аминогрупп цитидина и аденоэина— бенэоильную группу. На носитель сажают первое звено, а последовательность операций при присоединении каждого мономерного звена ведут известным путем с последующим снятием защитных групп известными приемами и определением струк- з туры секвенированием по методу
Максама-Гилбер а. Новый нуклеотид комплементарен (+)-цепи фагов М13 mp. Сайт отжига праймера расположен на расстоянии
120 нуклеотидов от области полилинкера.
Разрешающая способность обычного геля с применением данного праймера выше, чем с применением известного, и сравнима с разрешающей способностью градиентного геля с использованием известного праймера. Это позволяет вести чтение с одного С простого геля на клон на 100--130 нуклеоти- С дов больше и упрощает бпределение пер- С) вичной структуры ДНК по методу Сенгера эа фь. счет исключения применения специальных методов. 1 ил., 2 табл, 1700004 которое может быть использовано для определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера, Целью изобретения является получение нового олигодезоксирибонуклеотида, позволяющего увеличить разрешающую способность структурных гелей и упростить способ определения первичной структуры
ДНК по методу Сенгера, Новый олигодезоксирибонуклеотид комплементарен (+)-цепи фагов M13 mp.
Сайт отжига праймера расположен на расстоянии 120 нуклеотидов от области пол илинкера (п рэймер — 120).
На чертеже приведена структурная формула.
Пример 1. Синтез олигодезоксирибонуклеотида формулы (1), Синтез олигодезоксирибонуклеотида проводят на трехколоночном полуавтоматическом синтезаторе, сконструированном на основе управляющего блока ВЭЖХ "Altex" и шестиходовых кранов фосфитным методом, В синтез берут 15 — 20 мг носителя с посадкой первого звена, В качестве мономерных компонентов используют 5 -О и
N-замещенные 3 -(N,N-диизопропиламид)метилфосфиты нуклеозидов. B качестве 5 -О-защитной группы применяют диметокситритильную группу. Для блокирования экзоциклических аминогрупп гетероциклических оснований цитидина и аденозина используют бензольную группу, для гуанозина — изобутирильную группу. В качестве твердофазного носителя применяют Силохром С80, содержащий аминопропильную группу (размер частиц 100 — 200 мкм, диаметр пор 400 — 600 А). Последова| тельность операций при присоединении, каждого мономерного звена следующая: промывка — ацетонитрил (2 мл, 0,5 мин); детритилирование — 0,2 M трифтороуксусная кислота в дихлорэтане (2 мл, 0,7 мин); промывка — ацетонитрил (3 мл, 0,8 мин); конденсация — 0,1 М раствор мономера/0,5
M раствор тетразола в ацетонитриле (1/1, v/v; 0,15 мл, 3 мин), добавление нуклеотидного компонента и тетразола проводят вручную с помощью шприца; купирование—
N-метилимидазол/пиридин/уксусный ангидрид/дихлорэтан (1/1/1 /1, v/ч, 0,5 мл, 0,5 мин); окисление — 1 -ный раствор йода в смеси уксусной кислоты с пиридином (1/9, v/v, 0,7 мл, 0,5 мин). После окончания синтеза проводят удаление защитных групп.
Сначала удаляется диметокситритильная группа обработкой 0,2 M раствором трифтороуксусной кислоты в дихлорэтане непосредственно в реакционной колонке. Затем полимер обрабатывают смесью тиофе5 -d(G T A A A A C G А C G G С C A G T) 3 (2)
40 проводят в растворе общим объемом 5 мкл, содержащем 2 — 3 пМ праймера, 3 пМ (a- P)-ATP (уд, активность 3000
Ки/мМ), 50 мМ трис-НС! (рН 8,3), 35 мМ
MgClz и 0,1 — 1 ед, активности полинуклеотидкиназы (37 С, 30 ми н.), После добавления 7 мкл (2 мкг) фага M13 mp 10 с клонированным фрагментом — интерферона быка и 1 мкл буфера; 50 мМ трис-НС!
50 (рН 8,3), 35 мМ MgCb. проводят отжиг при
55 С 15 мин. Фаг с отожженным праймером разносят в микротитровальную плашку (IlO
3 мкл) в лунки с обозначениями "G", "А", "Т", "С". Затем в каждую лунку добавляют по
2 мкл соответствующих смесей dNTP/ddNTP (табл. 1) и 1 мкл (1 ед.акт.) фрагмента Кленова
ДНК-полимеразы 1 Е и инкубируют при 37 С
15 мин. После добавления 1 мкл раствора со!!! (2,5 мМ каждого) инкубируют при 37 С
15 мин. Затем добавляют по 3 мкл буфера
35 нол/триэтиламин/диоксан (1/1/3, v/v) для удаления О-метильных защитных групп.
Снятие олигодезоксирибонуклеотида с полимера и удаление N-ацильных защитных групп проводят обработкой раствором аммиака (?8 — 30 ) при 60 С в течение 12 ч.
Носитель удаляют фильтрованием после охлаждения до 0 С. Фильтрат упаривают в вакуумном испарителе, растворяют в 200 мл воды. Очистку полностью деблокированного олигодезоксирибонуклеотида проводят в 20 -ном денатурирующем полиакриламидном геле с 7 M мочевиной в стеклянных пластинах (20-20 см). Электрофорез ведут при напряжении 600 В, В качестве электродного буфера используют 0,05
M трис-борат (рН 8,2), 1 мМ ЭДТА, После окончания электрофореза гель помещают на флуоресцентную пластину Silufol UV-254, зону, содержащую олигонуклеотид, идентифицируют под источником УФ-излучения.
Элюцию олигодезоксирибонуклеотида из вырезанной зоны полиакриламидного геля прозодят в 200 мкл 12%-ного раствора пархлората натрия при 37 С в течение 12 ч. Олигодезоксирибонуклеотид осаждают 9 объемами ацетона и растворяют в воде до концентрации 0,5 о.ед/мл, Структуру синтезированного олигонуклеотида подтверждают секвенированием по методу
Максама-Гилберта.
Пример 2. Использование олигсдезоксирибонуклеотида формулы (1) в качестве праймера.
Радиоактивное мечение олигодезоксирибонуклеотидов формулы (1) и известного формулы
1700004
Таблица 1
Таблица 2 для нанесения (деионизованный формамид, бромфеноловый голубой, ксиленцианол), прогревают при 80 С 30 мин и 2-3 мкл каждой реакционной смеси разделяют в денатурирующем полиакриламидном геле.
Продукты реакции по Сенгеру с использованием олигодеэоксирибонуклеотида формулы (1) разделяют в обычном полиакриламидном геле, с использованием олигодезоксирибонуклеотида формулы (2)— в обычном и градиентном полиакриламидном гелях. Применяют гели толщиной 0,4 мм. Состав обйчного денатурирующего полиакриламидного геля: акриламид 5 (19:1, акриламид:бис-акриламид), мочевина 50=,ь, Трис 130 мМ, борная кислота 40 мМ, ЭДТА
2,8 мМ, рН 8,8.
Состав градиентного денатурирующего геля . акриламид 5 (19:1, акриламид:бисакриламид), мочевина 50, градиент буфера (1;2,5): от верхней части геля — 65 мМ
Трис, 20 мМ борной кислоты, 1,4 мМ ЭДТА (pH 8,8) к нижней части геля — 325 MM Трис, 100 мМ борной кислоты, 7 мМ ЭДТА, 10 сахарозы (рН 8,8), Сравнительные характеристики результатов электрофореза приведены в табл, 2, Злектрофорез проводят при постоянном токе 30 мА с использованием металлической пластины для термастатирования.
Как видно иэ табл. 2, разрешающая спо5 собность обычного геля с применением праймера (1) значительно превышает разрешающую способность геля с применением праймера (2) и сравнима с разрешающей способностью градиентного геля с исполь10 зованием праймера (2).
Таким образом, использование изобретения позволяет увеличить разрешающую способность структурных гелей, что позволяет чтение с одного простого геля на клон
15 на 100-130 нуклеотидов больше и упростить способ определения первичной структуры
ДНК по методу Сенгера за счет исключения применения специальных методов.
20 Формула изобретения
Олигодеэоксирибонуклеотид формулы
5 -d (G G Т G С G G G С С Т С Т Т С G С Т)-3
25 в качестве универсального праймера для определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера, 1700004
HinclI
Smal Accl
Sst I XmaI XbaI Sal l Sphl
QATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC66GGATCCTCTAGA6TCGACCTGCAGGCATGCAAGCTТ
EcoRI KpnI BamHI PstI HindI1I
T6ACC6GCAGCAAAATG — 5 . (-20)
6Ж АСТ66СС6ТСБТ ТТТ АСААС6ТС6Т6АСТ666ААААССССТ66С6ТТАСССААСТТААТСЯСС
TCGCTTCTCCGK@GTGG -. б (-120)
TTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTССС
Составитель Г.Коннова
Техред М.Моргентал Корректор Н,Король
Редактор И.Шмакова
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101
Заказ 4441 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
