Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к поверхностному антигену типичных штаммов возбудителя сапа рsеudомоnаs маllеi
Использование: биотехнология, иммунология . Сущность изобретения: штамм получен путем слияния клеток селезенки мышей BALB/c, иммунизированных суспензией убитых бактериальных клеток возбудителя сапа, с клетками мышиной миеломы РЗ-ХбЗ-Ад 8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(Н) 275Д и имеет авторское наименование ММ-Рт1. Титр антител в культуральной жидкости достигает 1280, в асцитной 107. Моноклональные антитела относятся к иммуноглобулинам класса G. 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ сОциАлистичесКих
РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 5/00
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 (21) 4865197/13 (22) 29.06,91 (46) 30.01.93. Бюл, ¹ 4 (71) Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова и
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (72) В.В.Свиридов, И,В,Синюкова, А,В,Линницкий, H Ï.Õðaïîâà, А.M.Áaðêoa и И,В.Новицкая (56) Авторское свидетельство СССР № 1529724, кл. С 12 N 5/00, 10.03.88. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕMbtX КЛЕТОК MUS MUSCULUS .- ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К
Изобретение относится к гибридомной технологии и касается получения моноклональных антител (МкАт) против антигена сапа, применяемых для определения типичных штаммов Ps.mallei в реакциях иммунофлюоресценции и непрямой гемагглютинации.
Для дифференцирования возбудителей, относящихся к роду Pseudomonas, используют набор тестов, основанный на сравнении биохимических и культуральных свойств микроорганизмов, Наряду с этим длительным и трудоемким методом применяют также более быстрые серологические методы дифференциации псевдомонад при помощи поликлональных антисывороток, Однако при применении таких антисывороток практически не удается дифференцировать между собой возбудителей сапа и мелиоидоза, что свидетельствует об их черезвычайно высоком антигенном сходстве.
„„5U „„1791451 А1
ПОВЕРХНОСТНОМУ АНТИГЕНУ ТИПИЧНЫХ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ САПА
PSEU0OMONAS MALLET (57) Использование: биотехнология, иммунология. Сущность изобретения: штамм получен путем слияния клеток селезенки мышей BALB/с, иммунизированных суспензией убитых бактериальных клеток возбудителя сапа, с клетками мышиной миеломы
РЗ-Х63-Ag 8.653. Штамм депонирован под номером BCKK(tt) 275Д и имеет авторское наименование MM-Pm1, Титр антител в культуральной жидкости достигает 1280, в асцитной 10 . Моноклональные антитела от7 носятся к иммуноглобулинам класса G 2 табл.
Актуальным представляется использование возможностей гибридомной технологии для получения МкАт, обладающих видовой специфичностью к данным возбудителям.
Цель изобретения — штамм гибридных культивируемых клеток Mus muscutus L., продуцирующий моноклональные антитела к возбудителю сапа.
Штамм гибридных культивируемых клеток Mus muscutus L. — продуцент моноклональных антител к антигену возбудителя сапа получен путем слияния клеток селезенки мышей BALB/C, предварительно иммунизированных суспенэией убитых бактериальных клеток возбудителя сапа, с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63-Ag
8.653 с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГа), селекции на гипоксантин-аминоптерин-тимидиновой среде {ГАТ) и последующего клонирования полученных гибридом методом предельных разведений.
1791451
Штамм депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР 05,07,88 под номером
ВСКК(П)275Д и имеет авторское наименование ММ-Pm 1.
Полученный штамм Mus musculus L, ВСКК(П)275Д имеет следующие характеристики, Условия культивирования штамма: температура 37 С, атмосфера с 5% С02 и 98% влажностью, среда ВРМИ640, содержащая .10% сыворотки плода.коровы, 10 мМ ГЭПЭС (N-2-гидроксиэтилпиперазин-2-этансульфоновая кислота), 2мМ L-глутамина, без антибиотиков или с добавлением пеницил лина и стрептомицина 100 ЕД/мл.
Характер роста — стационарная суспензия, Культура представляет собой взвесь одиночных клеток или легко разъединяю щихся при встряхивании рыхлых агрегатов по 6-14 и более клеток-. Оптимальная посевная доза — 1,5-2 х 10 клеток в 1 мл среды.
Для поддержания культуры в пролиферирующем состоянии клетки рассевают два раза в неделю через 2-4 дня с кратностью рассева 1:4 — 1:10, Максимальная плотность насыщения с сохранением жизнеспособности—
8х10 — 10 клеток в 1 мл. Клетки в культуре выглядят округлыми, прозрачными.
Для получения асцитной жидкости мышей линии BALB/с сенсибилизируют путем внутрибрюшинного введения 0,5 мл пристана или вазелинового масла и через 7-14 дней после этого им вводят гибридные клетки в дозе 3 — 5 х 10 клеток на мышь.
В реакциях иммунофлюоресценции, непрямой гемагглютинации и иммунофермен тном анализе (ИФА) продуцируемые гибридомами антитела взаимодействуют с возбудителем сапа с абсолютной специфичностью, Моноклональные антитела относятся к классу иммуноглобулинов (Ig) G, Титр иммуноглобулинов и ИФА в культуральной жидкости — до 1280, в асцитной жидкости — до
10; титр МкАт в асцитной жидкости в не7, прямом иммунофлюоресцентном, анализе ,(НИФлА) — до 1-0". Стабильность антителопродукции сохраняется на протяжении 100120 пассажей в культуре и 10 — 15 пассажей на животных (срок наблюдения).
Проверка штамма на присутствие контаминирующих микроорганизмов, проведенная на культурах постоянно выращиваемых на среде без антибиотиков, показала отсутствие бактерий и грибов.
Штамм хранят в замороженном состоянии при температуре — 196 С, Среда криоконсервирования содержит; среды
RPMI-1640 — 73%, сыворотки плода коровы — 20%, диметилсульфоксида (ДМСО)—
7%. Ампулы содержащие 0,5 мл суспензии клеток (6х10 /мл) после выдерживания в те5 чение 30 минут при температуре 4 С и двух часов пои температуре -40 С погружают и хранят в жидком азоте. Жизнеспособность клеток проверяют после размораживания с помощью суправитального красителя—
10 ставляет 80-98%
Пример 1. Использование штамма
Mus muscuIus 1, ВСКК(П)275Д для получения моноклональных антител, 15 Моноклональные антитела к возбудите-
Для получения антител из культураль ной жидкости клетки штамма выращивают в стандартных условиях: при температуре
37 С, влажности 98%, C02 — 5%, в среде
25 культивирования. Затем производят постепенный рассев культуры, Клетки выдерживают для пролиферации без смены среды до
0,2% раствора трипанового синего, Она солю сапа получают из культуральной жидкости (среды), в которой клетки штамма выращивают вне организма и из асцитной жидкости мышей, которым клетки штамма вводят внутрибрюшинно. достижения максимальной плотности при которой клетки погибают. Культуральную жидкость осветляют центрифугированием и используют как источник антител.
Титр моноклональных антител опреДеляют с помощью твердофазного ИФА по общепринятой схеме. Для этого образцы культуральной жидкости титруют двукратным шагом с 1;10 до 1:5120 в лунках планшетов, сенсибилизированных водно-солевым экстрактом возбудителя сапа, В качестве отрицательного контроля используют надосадочную жидкость несекретирующей антитела миеломной клеточной линии Р3-Х63-Ag 8.653, в качестве положительного — сыворотку мышей, иммунизированных убитыми бактериальными клетками возбудителя; Результаты реакции учитывают визуально или с помощью вертикального спектрофотометра.
За титр антител принимают величину обратную наибольшему разведению исследуемого образца антител, давшему положительную реакцию. Титр моноклональных антител к антигену возбудителя сапа в культуральной жидкости гибридного штамма равен 640-1280.
Для получения асцитной жидкости, содержащей МкАт, мышам линии BALB/с вводят внутрибрюшинно 0,5 мл пристана или вазелинового масла, а спустя 7-14 дней также внутрибрюшинно вводят 3-5 млн. гибридных клеток штамма, выращенных "ин
1791451 витра". Асцит развивается в течение 7 — 28, Пример 2. Использование моноклодней. Клетки опухоли отделяют путем цент-. нальных антител, полученных на основе рифугирования.асцита и перевивают новой предложенного. штамма, для определения группе мышей, а жидкость используют как поверхностного антигена типичных штамисточник антител..Объем асцитной жидко- мов возбудителя сапа в ИФлА и реакции сти, полученный от одной мыши, составляет 5 непрямой гемагглютинации.
1 — 4 мл. Для выявления возбудителей сапа на
Определение титра антител в асцитной стекле с предварительно фиксированными жидкости проводят также, как и в культу- клетками исследуемых штаммов или мазкаральной. Асцитную жидкость разводят 10- ми-отпечатками органов наносят 5.— 10 миккратным шагом начиная с 1:10, делая 8 10 ролитров антител в разведении, в 2-5 раз последовательных разведений образцов в . меньшем титра, установленного при оценке лунках планшетов, сенсибилизированных их активности. Стекла выдерживают в течеантигеном. В качестве отрицательного кон- ние 30 минут при комнатной температуре и троля используют нормальную мышиную сы- несколько раз отмывают физиологическим воротку мышей линии BALB/с. Титр антител 15 раствором. После этого на стекла наносят асцитной жидкости составляет 10 — 10 .. препарат кроличьего антимышинного гло-
5 7
Для определения титра антител в имму- . булина, меченого ФИТЦ в рабочем разведенофлюоресцентном анализе делают 6 по- нии. Через 20-30 минут стекла отмывают следовательных разведений асцитной физиологическим раствором, споласкивают жидкости с 10-кратным шагом(1:10-1;10 ). 20 дистиллированной водой и высушивают.
Для разведения используют физиологиче- Препараты просматривают в люминесцентский раствор NaCI, содержащий 0,05Д тви- ном микроскопе при малом увеличении под на-20. Пробы антител в разведениях в масляной иммерсией, при.этом микробные объеме 10 микролитров наносят на пред- . клетки возбудителя сапа показываюттипичметное стекло-с предварительно фиксиро- 25 ное свечение. ванными на нем микробными клетками. Выявление возбудителя сапа возможно
Стекла выдерживают при комнатной темпе- . также при помощи реакции непрямой гематратуре в течение 30 минут, ополаскивают глютинации, Диагностикум сапной эритрофизиологическим раствором. Реакцию про- цитарный, приготовленный на ос ose являют препаратом кроличьего антимы- 30 моноклональных антител, позволяет обнашинного глобулина меченого ФИТЦ в руживать в РНГА 8х10 — 6х10 м.т./мл рабочем разведении (производство ИЭЬ Р,mallei, что несколько ниже чувствительноАМН СССР); Через 20.-30 минут инкубации сти стандартного группового эритроЦитар-" стекло отмывают физиологическим раство- ного препарата, приготовленного на основЕ ром, затем дистиллированной водой, высу- 35 поликлональных сывороток, однако имеет . шивают и просматривают под масляной преимущество перед последним по специиммерсией в люминесцентном микроскопе.. фичности (табл.2).
Положительной считается реакция имму- Штамм гибридныхкультивируемых кленофлюоресценции, оцениваемая на 2+и вы-" . ток мышйпродуцирует моноклональные ан- ше при 4-балльной системе оценки. Титр 40 титела, позволяющие получать антител в асцитной жидкости гибридного . высокоспецифичные результаты при опрештамма составляет в ИФлА 5х10 — 10 .. делении РюаИе! в реакциях ИФлА и вепряз . Специфичность маноклональных анти-. мой гемагглютинаций. Данные методы тел к поверхностному антигену типичных быстры и экономичны, поскольку при опре штаммов возбудителя сапа подтверждается 45 делении возбудителя сапа нет необходимоданными; приведенными.в табл,1. сти прибегать к используемому в настоящее
Моноклональные антитела, продуциру- время наборутестов, основанному на сравемые штаммом гибридных культивируемых нении биохимических и культуральных клеток мыши ВСКК(П)275Д, полученные из свойств микроорганизмов рода . культуральных и асцитных жидкостей, выса- 50 Pseudomonas. ливают растворог сульфата аммония при Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я
507;-ном насыщении, подвергают диализу ..: Штамм гибридных культивируемых клепротив фосфатно-солевого буфера с после- ток Mus muscufus L ВСКК(П) М 275Д вЂ” продующей лиофилизацией и хранят при тем- дуцент моноклональных антител к пературе 4 С в течение года без потери 55 поверхностному антигену типичных штамактивности. мов возбудителя сапа Pseudomonas mallei, 1791451
Таблица 1
Число положительных проб/общее количество и об
Музейные штаммы, изученные в ИФлА
И, тенсивность флуоресценции в положительных пробах
Возбудитель сапа — P. mallei (12 штаммов)
Возбудитель сапа (атипичные штаммы)
Возбудитель мелиоидоза—
Ps. рзеиботаИе! (58 штаммов)
Гетерологичные микроорга- . низмы
19 штаммов
12/12
О/3
1/58
О/19
Таблица 2. Составитель B. Свиридов
Редактор С. Кулакова Техред M.Ìoðãåíòaë Корректор С.Патрушева
Заказ 134 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101
П р и м е ч а н и е. В качестве гетерологичных видов микроорганизмов были использованы: P.aeruglnosa Н-1, Н-5, H-12; Р.putlda ВКМВ-1301; Р.stutzer1 4136; P.cepacla 3181, 8236, 8237; P.fluorescenc С-2234, 4125; P. pseudoalcallgenes ВКМВ-1300; Aегоmonas В-47. В-48;
$лурЫ 14600, $.paratyphl А-27 В-493; Sh.Sonnt 20; Е,coll0,2, 0-11.
