Способ получения диплоидных апомиктов табака душистого

 

Использование: биотехнология, цветоводство , мутагенез. Сущность изобретения: диплоидные апомикты табака душистого получают прямым путем при опылении материнских растений пыльцесмесью, содержащей облученную пыльцу табака душистого и i необлученную пыльцу петунии гибридной в соотношении 1:1.1 табл. СО С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК. Ы 1787385 А1 (51)5 А 01 Н 1/06

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

-Э 4 ()( (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИПЛОИДНЫХ

АПОМИКТОВ ТАБАКА ДУШИСТОГО (57) Использование: биотехнология, цветоводство, мутагенез. Сущность изобретения: диплоидные апомикты табака душистого получают прямым путем при опылении материнских растений пыльцесмесью, содер>кащей облученную пыльцу табака душистого и необлученную пыльцу петунии гибридной в соотношении 1:1. 1 табл. (21) 4885883/13 (22) 26.11,90 (46) 15.01.93. Бюл. М 2 (71) Киевский медицинский институт им. акад.А.А.Богомольца (72) С.В.Андрейченко (56) Тодуа В.А., Тавдумадзе К.P. Использование ионизирующих излучений для получения гаплоидов табака,//Апомиксис и селекция. - M. Наука, 1970. с, 283-291, Дарлингтон С.Д.. Ла Кур А,Ф. Хромосомы, Методы работы, - М,; Атомиздат, 1980, с.х 211.

Virk 0.$. Matromorphy in Nicotiana

rust(ca//Heredity, - 1977, ч. 39, и. 4, р, 287—

295.

Nitsch С, La culture fu pouen Isole sur

milieau synthetlgue//Compt. Rend. Acad.SCI. (Paris). Ser.D. - 1974, ч. 278, п.8, р. 1031.

Stettler R.F., Bawa К.$.//Silvae Genet., 1971, ч.20, и. 1-2, р. 15-25.

Изобретение относится к биологии. а именно к прикладной генетике, и может быть использовано в селекции и в цветоводстве для получения диплоидных апомиктов материнского происхождения у цветковых растений с целью их дальнейшего использования в качестве исходного материала для создания высокогомозиготных, или чистых линий, а также сортовыведения.

Важной задачей современной генетики и селекции цветковых растений и, в частности табака, является разработка быстрого, простого и эффективного метода получения высокогомозиготных растений, который заменил бы широко применяющийся в настоящее время метод продолжительного инбридинга в ряде поколений из-эа его значительной трудоемкости, В этой связи наиболее перспективен метод индуцированного диплоидного партеногенеза, позволяющий получать генетически устойчивые растения с удвоенным материнским гено- . 4 мом, которые не подвержены генетическо- Ы му расщеплению в дочерних поколениях. Q0 I

Диплоидные апомикты могут быть сразу;(Jl включены в процессе семенного размножения для производства чистых линий и сортовыведения. Однако, существующие в настоящее время способы получения апомиктов цветковых растений не позволяют одноэтапно получать диплоидные апомикты материнского происхождения.

Известен способ, согласно которому получение диплоидных апомиктов материнского происхождения у табака осущестгляется в два этапа. В начале в результате

1787385 самоопыления гамма-облученной в дозе 7

Гр пыльцой получают гаплоидные семена, а затем путем колхицинирования по методу переводят эти семена на диплоидный уровень, Метод имеет ряд существенных недостатков. Во-первых. это необходимость проведения скрининга полученного семенного потомства с целью выявления гаплоидных семян. Во-вторых, потребность в диплоиди. зации семян при помощи высокотоксичного ядохимиката колхицина, что сопряжено с опасностью в работе и трудозатратами на отработку методики колхицинирования, Известен способ прямого получения диплоидных апомиктов табака-путем опыления гамма-облученной в дозе 200 Гр пыльцой. Основным недостатком метода является возможность его применения только к табаку-махорке и очень низкий выход диплоидных апомиктных семян (2 семени на 10 опылений).

Известен способ получения диплоидных апомиктов табака с помощью культуры ткани при культивировании микроспор и по1 следующего перевода гаплоидных проростков на диплоидный уровень колхицинированием. Метод имеет ряд недостатков, которые связаны с большими денежными и временными затратами на получение гаплоидных проростков в искусственных условиях, необходимостью проведения скрининга потомства с целью идентификации гаплоидов среди анеуплоидов. Кроме того, сохраняется определенная опасность в работе из-за использования колхицина для целей диплоидизации. Полученные диплоидные апомикты имеют, однако, не материнское, а отцовское происхождение.

Наиболее близким по технической сущности из известных способов получения диплоидных материнских апомиктов является способ.

Согласно этому способу получение дигаплоидов производится поэтапно. Сначала получают гаплоиды в результате опыления растений смесью пыльцы, состоящей из собственной, облученной в дозе 1000 Гр, и чужеродной, взятой с растений другого вида этого же рода,"которые проявляли перекрестную межвидовую несовместимость в пестике с опыляемым растением, причем объединение геномов в гибриде не препятствовало эмбриональному развитию, Цель достигалась применением в опылении сме-си пыльцы, где отношение облученного и необлученного компонентов было 4:1. Метод был успешно апробирован только на

Облучение собственной пыльцы душистого табака в дозе 1000 Гр при мощности

0 2 Гр.с лишало ее оплодотворяющей способности, что гарантировало отсутствие образования жизнеспособных семян вследствие самооплодотворения. Использование способа позволяет избежать применение колхицина, а также временных и трудовых затрат на перевод гаплоидных растений на дигаплоидный уровень и дает ряд дополнительных преимуществ, которые будут раскрыты ниже.

Способ осуществляют следующим образом. тополях, После получения семенного потомства и проведения скрининга на присутствие гаплоидов выявленные гаплоиды обрабатывали колхицином и получали диплоиды.

Настоящий метод не требует использования техники культуры ткани и позволяет получать апомикты непосредственно в опылении. Однако настоящий способ обладает недостатками, которые лимитируют его повсеместное применение, поскольку он не является прямым и не позволяет сразу получать диплоидные апомикты уже в опылении, что обусловливает необходимость последующего использования в работе опасного ядохимиката колхицина.

Целью изобретения является одноэтапное, или прямое, получение диплоидных семян материнского происхождения у цветковых растений, например, табака душистого, в результате проведения опыления пыльцесмесью из собственной облученной и чужеродной несовместимой, но жизнеспособной пыльцы.

Укаэанная цель достигается тем, что в известном способе получения материнских апомиктов, включающем сбор пыльцы с пыльников, ее высушивание в KOMHBTHblx условиях, облучение гамма радиацией Со в дозе 1000 Гр/с и смешивании с предварительно высушенной таким же образом, но необлученной пыльцой петунии гибридной в равных соотношениях. Отличительным признаком заявляемого способа является режим проведения опыления пыльцесмесью, в которой компоненты берутся в равных соотношениях, а необлученная пыльца в данной системе опыления проявляла как пестичную, так и зиготическую несовместимость. Последнее сказывалось на полной невозможности образования семян посредством амфимиксиса иэ-за расщепления геномов у гибридов и постепенной элеминации хромосом, что приводило к ран45 ней гибели гибридных зародышей, 1787385

Собирают пыльники табака и петунии душистого, Кастрированные цветки табака перед началом антезиса, т.е. перед самым размещали под изоляторами, которые снираскрытием, помещают в чашки Петри на 30 мали лишь спустя 10 дней после опыления, ч при температуре 26 С. Путем быстрого lfl3 собранных плодов вытрушивали семена ручного перемещения чашек Петри в раз- 5 и помещали их в бумажные пакетики. После ные стороны производят отделение пыльцы хранения в течение 1 мес семена проращиот пыльниковой ткани, после чего высушен- вали в чашках Петри на влажной фильтроную пыльцу переносят в закрытые бюксы и вальной бумаге при температуре 25ОC. хранят при -20 С. Проросшие семена переносили затем в усПыльцу табака душистого перед опыле- 10 ловия почвенной культуры в горшки, набинием облучают в закрытых бюксах при тем- тые землей, и все размещали в теплице. пературе 20 С гамма-лучами Со и ри о о

Таким образом, удалось вырастить полмощности дозы 0,2 Гр/с в дозе 1000 Гр. ноценные растения, фенотипически иденПосле облучения производят смешивание тичные материнским. Как видно из таблицы, равных частей облученной пыльцы табака 15 проведение опыления пыльцесмесью (1;1), душистого с необлученной пыльцой пету- которая состояла из равных количеств слании гибридной. Полученной смесью опыля-, гающих ее компонентов, позволяет полют растения табака душистого, причем учить стабильное плодообразование, предварительную кастрацию растений про- сопровождающееся появлением семян раз- водят за 1-2 дня доопыления, когда на них 20 ных типов — нормальных с зародышем и одевают изоляторы, Облучение и опыление эндоспермом; фенотипически нормальных, проводят в утренние часы. Для удобства но пустых из-за деградации эмбриональных применения способа возможно также вре- тканей, а также полностью разрушенных семенное хранение облученной пыльцы сро- мян, Кроме того, встречались и абортивные комдодвухсутоквхолодильникепри-20 С. 25 семена с остатками зародыша или зндосПосле проведения опыления на растения перма. В среднем в опылении образовываснова одевают изоляторы, которые затем лось до 8 нормальных диплоидных семян, снимают через 10 дней, Полученные в опы- имеющих апомиктное происхождение, лениях семена оставляют храниться в,ком- Сравнительно низкий показатель всхо>кенатных условиях в бумажных пакетиках 30 сти семян указывает на присутствие в сесроком на 1 мес. После этого семена прора- менном потомстве после опыления щивают на влажной фильтровальной бумаге высокого процента пустых семян с деградив чашках Петри при 25 С. Проросшие семе- ровавшими зародышевыми тканями. на переносят в горшки с почвой, т.е. непос- Пример 2. Сбор пыльцы петунии редственно в условия почвенной культуры. 35 гибридной и табака душистого проводили

Сущность заявляемого способа можно по методике, описанной в примере 1. Высупроиллюстрировать таблицей, в которой шенную пыльцутабака облучали в закрытых раскрыто влияние режима опыления и со- бюксах пои температуре 20 С гамма-радиастава пыльцесмеси на образование дипло- цией Со в дозе 1000 Гр при мощности о идных апомиктов табака душистого. 40. 0,2 Гр/с. Затем сразу готовили пыльцесПример 1. С растений табака души- месь (4:1) путем смешивания 4 ч. облученстого и петунии гибридной собирали пыль- ной пыльцы табака с 1 ч пыльцы петунии ники перед началом антезиса и помещали в гибридной. Этой пыльцесмесью проводили чашки Петри в условиях комнатной темпе- опыление предварительно кастрированных ратуры и 60 Д-ной влажности воздуха на 30 45 за 1 — 2 дня до опыления цветков табака дуч. После этого с помощью ручного переме- шистого, помещенных под изоляторы. Пощения чашек Петри из стороны в сторону сле появления плодов изоляторьг убирали, обеспечивали отсоединение пыльцы от Собранные семена выдерживали в течение пыльниковой ткани и ее концентрирование месяца в бумажных пакетиках с целью маку края чашки, что облегчало сбор пыльцы и 50 симальной активации их прорастающей ее перенос с помощью скальпеля в бюксы. способности, Проращивание семян провоПыльцу табака душистого облучали гам- дили на влажной фильтровальной бумаге в ма-радиацией Со вдоэе1000Грпримощ- чашках Петри при температуре 25 С. Проности дозы 0,2 Гр/с в течение 83 мин 10 с, а росшие семена переносили в условия поэатем смешивали уже облученную пыльцу с 55 чвенной культуры в горшки с землей и таким равным количеством необлученной нор- образом получали зрелое растение. Как видмальной пыльцы петунии гибридной. Смесь но из таблицы, в данном варианте опыления хорошо перемешивали. а затем использова- наблюдается некоторое снижение плодоли для опыления предварительно кастриро- образования до 95 Д, которое сочетается с ванных за 1-2 дня до этого цветков табака резким падением показателя семяобразо1787385

10

25

50

55 вания в 6 раз по сравнению с получаемым в опылениях пыльцесмесью типа (1:1). В плодах в основном преобладали разрушенные, пустые и абортивные семена, хотя было получено и значительное количество нормальных семян, способных к прорастанию и давших начало диплоидным апомиктным растениям. По этой причине всхожесть семян снизилась до 3%.

Пример 3. Сбор пыльцы петунии и табака, а также облучение пыльцы табака проводили по методике, описанной в примере 1, Для опыления готовили пыльцесмесь из 2 ч. облученной в дозе 1000 Гр пыльцы табака и одной части пыльцы петунии. Опыление, a также проращивание полученных семян проводили по методике, описанной в примере 1. Проросшие семена йереносили в горшки с почвой, которые устанавливали в теплице, что обеспечивало в дальнейшем по. учение сдвоенных растений, являющихся исключительно диплоидными апомиктами. Как видно из таблицы, плодообразование в опылениях достигало

98% и опровождалось появлением в некоторых случаях до 30 семян в плоде. В то же время в семенном потомстве преобладали пустые и абортивные семена, способные лишь к спорадическому кратковременному прорастанию без последующего развития проростка в растение. Всего в опылениях было получено до 70 полноценных семян, что определило средний показатель выхода диплоидных апомиктов в пределах 2 на опыление.

Пример 4. Сбор пыльцы петунии и табака, а также облучение и-tnbqbt табака проводили по методике примера 1. Пыльцесмесь типа(1:2) для опыления готовили из одной части облученной в дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр/с пыльцы табака и 2 ч. пыльцы петунии гибридной, Опыление кастрированйых растений табака душистого. а также сбор и проращивание семян полученных в опылениях, проводили по методике, описанной в примере 1. Проросшие семена затем доводили до стадии зрелого растения путем переноСа в почвенную культуру в горшки с землей, размещенные в теплице. Как видно из таблицы, изменение соотношения компонентов пыльцесмеси в сторону необлученного несовместимого компонента привело к снижению плодообраэования до

80%; а также к заметному падению количественного содержания семян в плодах в среднем до 4 на плод. Низкий уровень семяобразования, однако, сочетался с общей высокой всхожестью семян, которая отражала присутствие в семенном потомстве большого процента полноценных семян, Это обеспечило сравнительно высокий показатель выхода диплоидных апомиктов в опылении, в среднем равный 1, Пример 5, Сбор пыльцы петунии и табака, а также гамма-облучение пыльцы табака проводили по методике, описанной в примере 1. Для опыления готовили пыльцесмесь типа (1:4), состоящую из 1 ч. обученной . в дозе 1000 Гр при мощности дозы 0,2 Гр/с пыльцы табака и 4 ч. пыльцы петунии гибридной, Опыление растений табака, а также сбор и проращивание полученных в опылении семян проводили по методике, описанной в примере 1. Проросшие семена высаживали в горшки с почвой, которые затем выставляли в теплицу, Как видно из таблицы, опыление пыльцесмесью типа (1:4) обусловило снижение плодообразования до

67% при одновременном уменьшении среднего количества семян в плодах до 2. Как оказалось, все семена были пустыми или сильно абортивными, что не позволило получить ни проростков, ни зрелых растений.

Пример 6, Сбор пыльцы табака проводили по методике, описанной в примере

1. После этого ее облучали гамма-радиацией

Со в дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр/с в закрытых бюксах при температуре 20 С.

Опыление кастрированных растений табака собственной облученной пыльцой проводили в утренние часы. Семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге в чашках

Петри при температуре 26 С, Как видно из таблицы для этого варианта опылений (тип пыльцесмеси 1:О), жизнеспособных семян в опылениях получено не было.

Пример 7, Сбор пыльцы петунии гибридной проводили путем помещения пыльников перед их раскрытием в чашки

Петри на 30 ч при температуре 26 С. С помощью ручного перемещения в чашках Петри вытрушивали пыльцу из раскрывшихся пыльников, а затем уже скальпелем ее переносили в закрытые бюксы, Опыляли такой пыльцой кастрированные цветки табака душистого. Как оказалось (см.табл„тип пыльцесмеси 0:1) в опылениях не было получено ни плодов, ни семян, что указывает на блокирование роста пыльцевых трубок петунии в пестике табака.из-за существования межродовой инконгруиции, обусловленной различиями в длинах пестиков у петунии и табака.

Таким образом, использование заявляемого способа получения диплоидных апомиктов у цветковых растений f10 сравнению с прототипом обеспечивает получение диплоидных апомиктов в выращенном растительном потомстве, Только использование смеси пыльцы типа (1:1) из собственной гам1787385

10 ма-облученной в дозе 1000 Гр при мощности

0,2 Гр/с пыльцы табака и необлучен ной нормальной пыльцы петунии гибридной, для которой характерно проявление межродовой инконгруиции в пестике табака, обеспечивает достижение намеченной цели, а изменение пропорции компонентов пыльцесмеси влечет резкое снижение эффективности способа, что было продемонстрировано примерами. Появление диплоидных апомиктов табака обеспечивается тем, что пыльцевые трубки гамма-облученной в дозе 1000 Гр пыльцы табака в процессе самоопыления проникают не во все семяпочки, В этом случае создаются предпосылки для индукции партеногенеза в некоторых интактных семяпочках растущей сзади пыльцой петунии, В случае же осуществления межродового амфимиксиса образование полноценных семян невозможно из-за появления межродовой зиготической несовместимости геномов, ведущей к деструктивным процессам и гибели эмбриоидов. В этой связи появление жизнеспособных семян в опылениях может иметь место только благодаря их партеногенетическому происхождению. Изменение соотношения компонентов в пыльцесмеси в сторону увеличения облученной пыльцы

/(2:1) и (4:1)/ приводит к снижению вероятности проникновения пыльцевых трубок петунии гибридной в область семяэачатков, что, в свою очередь, влечет уменьшение потока веществ-индукторов партеногенеза в семяпочки. Последнее негативно сказывается на эффективности опыления и выходе диплоидных апомиктов. В тоже время изменение соотношения компонентов в пыльцесмеси в сторону уменьшения облученной пыльцы /(1;2) и (1:4)/ также обусловливало снижение концентрации пыльцевых трубок петунии гибридной вблизи отдельного семязачатка, что было вызвано как ослаблением менторного эффекта со стороны облученной пыльцы табака, так и увеличением количества интактных семяпочек вследствие уменьшения стерилиэую щего эффекта облученной пыльцы на зародышевые мешки.

Использование заявляемого способа позволит получить специалистам-селекционерам целый ряд преимуществ flo сравнению с прототипом: во-первых это разработка режима опыления, обеспечивающего одноэтапное получение диплоидных материнских апомиктов непосредственно в процессе опыления пыльцесмесью, состоящей из равных частей собственной облученной в дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр/с пыльцы табака и пыльцы петунии гибрид30 характерно проявление межродовой инконгруиции в комбинации с душистым табаком, 35

45 соотношения наблюдается резкое сниже55 ние эффективности опылений пыльцесмеся10

25 ной, растения другого рода семейства пасленовых. Во-вторых, это полный отказ от применения в экспериментальной работе ядохимиката колхицина. В-третьих — это использование жесткого традиционного режима культивирования семян, который обеспечивает стопроцентный выход диплоидных апомиктов в выращенном растительном потомстве. В-четвертых, это значительная экономия времени из-за отсутствия необходимости в проведении цитологического скрининга семян и выращенных растений в отношении плоидности генома. В-пятых, это существенное уменьшение денежных расходов ввиду полного отказа от использования техники культуры ткани, а следовательно, дорогостоящего оборудования и реактивов. В-шестых, это значительное в 30-50 раэ повышение выхода апомиктных семян в опылениях, Предлагаемый способ при сравнении его с и рототипом позволяет добиться значи- . тельного уменьшения абортивных семян в опылениях при одновременном увеличении числа нормальных семян, которые имеют партеногенетическое происхождение и обладают высокой всхожестью, Выбор в качестве второго компонента пыльцесмеси пыльцы петунии гибридной, доля которой а также зиготической несовместимости родительских геномов, позволяет избежать появления в потомстве семян гибридного происхождения, Последнее условие обеспечивает 100 g, выход диплоидных апомиктов душистого табака в растительном потомстве, выращенном в условиях традиционного высевания семян в почву, Способ гарантирует появление диплоидных апомиктов материнского происхождения в семенном потомстве после опыления.

Заявляемый способ воспроизводим, не требует от селекционера специального обучения, может использоваться в теплице и в открытом грунте, Применение способа наиболее целесообразно производить опылением пыльцесмесью, состоящей из равных частей гамма-облученной в дозе 1000 Гр при мощности дозы 0,2 Гр/с пыльцой табака душистого и нормальной пыльцы петунии гибридной, поскольку за пределами этого ми с целью получения диплоидных апомиктов.

Стоимость полученных заявляемым способом семян понижается более чем в 50 раз по сравнению с прототипом.

1787385

Формула изобретения ченную пыльцу таксономически близких растений, отличающийся тем, что, с целью прямого получения диплоидных семян, опыление проводят пыльцесмесью, содержащей облученную пыльцу табака душистого и необлученную пыльцу петунии гибридной в соотношении 1:1.

Способ получения диплоидных апомиктов табака душистого, включающий сбор пыльцы, облучение ее гамма-радиацией в дозе 1000 Гр и опыление пыльцесмесью, содержащей облученную пыльцу и необлуСостав пыльцесмеси по со- Общее коотношению компонентов личество

ПлодообВсхоКоличество семян в плоде, Выход

П риразование, 7ь от облученная, необлученв дозе 1000 Гр ная пыльца пыльца табака- петунии

ijyui гибр опылений числа шт опылений нии

44+16

5+3

7+5

0,1 +0,1

1,4= -0,5

1,0"=0,4

4+ 3

2+2

5 4

Составитель С, Андрейченко

Техред М.Моргентал Корректор Л. Филь

Редактор

Заказ 537 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент". r, Ужгород, ул.Гагарина, 101

3

5

1:1

4:1

2:1

1:2

1:4

1:0 .

0,1

48

46

41

98

86

68

96

0 жесть се- диплоидмян, ных апомиктов в

1 опыле