Штамм-реассортант аренавирусов ласса и мопейя для получения иммунобиологических препаратов

 

Использование: медицинская вирусология , в частности разработка лечебно-профилактических препаратов. Сущность изобретения: штамм МЛ-29 получают при смешанном культивировании вирусов Ласса и Мопейя в культуре клеток с последующим клонированием. Он характеризуется следующими свойствами: размер вирионов 120-130 нм, геном - сегментированная одноцепочечная РНК. Под агаровым покрытием штамм образует мелкие бляшки (до 0,8 мм), содержит L-PHK вируса Мопейя и S-PHK вируса Ласса, является высокопатогенным для новорожденных белых беспородных мышей и слабопатогенным для мышей линии СВА, защищает мышей от летальной дозы вируса Ласса. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов, депонент - ГКВ V 907. 1 .

СОКЭЗ СОВЕТСКИХ.

СО ЦИАЛ И СТИЧ Е С КИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 7/00 с Ы.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

О

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) I

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4899495/13 (22) 03.01.91 (46) 30.11.92 ° Бюл. 44 (71) Белорусский научно-.исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (72) А.Д.Васючков, Ф.M.Ôèäàðîâ и И.С.Лукашевич (56) Tomori О., Johnson К., Acta virol 1987. 31. р. 146-151, Gonzalez P.Í. Buchmeier М.J. Ис.

Cormick J.В. et al. Compans R.W. Bishop DHL (wads) 4. Segmented negative

strond viruses Academic, N.J.р.2О1- :208. (54) ШТАММ-РЕАССОРТАНТ АРЕНАВИРУСОВ

ЛАССА И МОПЕЙЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Использование: медицинская вируИзобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к разработке лечебно-профилактических препаратов.

Вирус Ласса является этиологическим агентом одноименной геморрагичес" кой лихорадки. Ежегодно регистрируется 200-400 тыс. случаев этой инфекции, которая протекает с тяжелыми.: клиническими проявлениями и нередко заканчивается летальным исходом.

Этот вирус является высококонта- гиозным и высокопатогенным для человека и приматов. Хорошо размножается в культурах клеток почек зеленых мар- тышек. Под агаровым покрытием образусология, в частности разработка лечебно-профилактических препаратов.

Сущность изобретения: штамм МЛ-29 получают при смешанном культивировании вирусов Ласса и Мопейя в культуре клеток с последующим клонированием.

Он характеризуется следующими свойствами: размер вирионов 120-130 нм, геном - сегментированная одноцепочечная РНК. Под агаровым покрытием штамм образует мелкие бляшки (до 0,8 мм), содержит 1.-PHV вируса Мопейя и S-PHK вируса Ласса, является высокопатогенным для новорожденных белых беспородных мышей и слабопатогенным для мышей линии СВА, защищает мышей от летальной дозы вируса Ласса. Штамм де- Я понирован в Государственной коллекции вирусов, депонент - IKB Г 907.

1 табл. ет бляшки со средним диаметром

1,8 мм. .Вирус Мопейя (ранее - Мозамбик) серологически и биохимически блиэкородственный вирусу Ласса, но в отли чие от последнего не вызывает забо левания у человека и приматов. В культуре клеток образует бляшки диаметром до 1,5 мм. В опытах на мышах линии CDA показана высокая степень патогенности и летальности при инфицировании как вирусом Ласса, так и вирусом Мопейя. Кроме того, к вирусу

Мопейя высокочувствительны новорожденные белые беспородные мыши, чего не наблюдается для вируса Ласса.

1778176!

1звестно использование реассортантов различных вирусов в производстве иммунобиологических препаратов.

Цепью изобретения является получение реассортантного штамма аренавирусов Ласса и Мопейя. для получения иммунобиологических препаратов.

Это достигается при помощи смешанного культивирования вирусов Ласса и Мопейй в культуре клеток Vего с последующим клонированием.

Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов, депонент ГКВ

" 907 °

Характеристика штамма.

Название вируса, штамма: вирусы

Ласса, Мопейя, реассортантный штамм

МЛ-29.

Выделен: 1989 r., Минск, в результате смешанного культивирования вирусов Ласса и Мопейя в культуре клеток

Чего с последующим клонированием.

Место в универсальной системе: семейство APЕНАВИРИДЕ.

Кем выделен: СССР, Белорусский

Н!1!!Э!1, Васючков А.Д., фидаров Ф.М., Лукашевич И.С. физико-химические свойства: размер 120-130 нм, РНК-одноцепочечная.

Генетические признаки: геном сегментированный.

Прочие свойства: хорошо репродуцируется в культурах клеток почек зеленой мартышки,. вызывает образование бляшек под агаровым покрытием в культуре клеток Vего на 6-7 сут. Размер бляшек.,до 0,8 мм. Высокопатогенен для сосунков белых беспородных мышей.

Антигенные свойства: в тестах флуоресцирующих антител, иммуноферментного анализа отмечается специфическое взаимодействие с иммунными поликлональными сыворотками к штаммам Джо- .- зия, Сьерра-Леоне, Мопейя. В МФА и

ИФМ в два раза активнее с гомологичной сывороткой, чем другие штаммы.

По своим свойствам штамм МЛ-29 отличается от других штаммов сниженной патогенностью для мышей линии СВА и может быть использован при разработке аттенуированных лечебно-профилактических препаратов.

Примеры, иллюстрирующие способ получения реассортантного штамма МЛ-29 и анализ его свойств.

Пример 1. Клонирование вирусов Ласса и Мопейя.

ЭО

Щ

Клонирование вирусов Ласса и t1oпейя проводили в культуре клеток Чего пугем троекратного пассирования из бляшки в бляшку с последующим накоплением в этой же культуре клеток. Титры исходных вирусов были равны 6,06, 51у,. Культуру клеток Чего выращивали в виде монослойной культуры, используя среду Bt1E с добавлением 104 сыворотки эмбрионов коровы. Поддерживающая среда содержала 2 ; этой же сыворотки.

Пример 2. Получение урожая смешанной инфекции.

Культуру клеток Чего выращивали на дне инсулиновых флаконов и после образования монослоя инфицировали смесью, содержащей равные объемы равных инфекционных доз вирусов Ласса и Мопейя из расчета конечной множественности более 1 БОЕ/клетку для каждого вируса.

Адсорбция продолжалась 1,5 ч при

37 С, после чего монослой трижды отмывали раствором Хенкса и заливали средой поддержки. Зараженную таким образом культуру инкубировали 24 ч при 37 С. Затем клетки и культуральную жидкость однократно замораживали и оттаивали. После центрифугирования при 3000 oG/èèí надосадочную жидкость использовали в качестве исходного материала для последующего изучения.

Пример 3 Изоляция отдельных клонов.

Вируссодержащую культуральную жидкость, полученную в результате смешанной инфекции, титровали в.культуре клеток Vего по методу Tomori, John-:

son. В качестве покрытия использова-ли агарозу фирмы Bio Рай (Electroendos—

mo is, m> = 0,13) . Из агарового покрытия выкалывали бляшки, отстоящие друг от друга не менее чем на два сантиметра. Содержимое индивидуальной бляшки гомогенизировали в среде поддержки с помощью ультразвукового гомогенизатора Vir Tis и использовали для заражения клеток Чего с целью последующего клонирования и накопления.

Пример 4. Отбор реассортантов.

В качестве критериев отбора использовали вирусологические: фенотип бляшек и летальность для сосунков белых беспородных мышей линии СВА при внутримозговом заражении животных, молекулярно-биологические: использоСрок иммунизации, кол-во дней

Лоза анти гена, мл

Место введений

0,5 В/мышечно+неполный адью-, вант фрейнда

0,5 B/áðþøèнно

21

О, 5 П/кожно+полный адъювант

Фрейнда

0,5 В/брюшинно

Тотальный забор крови

70

5 17 вание плаэмид рЛТ/L L18 и рцС!L S7, содержащих индивидуальные участки reHoMHblx L- u S ñåãìåíòîâ вируса Ласса.

Пример 5. Использование точечной гибридизации.

Для постановки реакции точечной гибридизации использовали РНК, выделенных из клеток Чего, зараженных исходными родительскими штаммами, а также реассортантами. PHK из инфицированных клеток выделяли фенольно-детергентным методом и наносили на нитроцеллюлозные фильтры. PHK "прижигали" к фильтрам в течение 2 ч при .

80 С. Предварительную гибридизацию и саму процедуру гибридизации выполняли как описано Auperin et а1. Отмывку фильтров осуществляли по методу Endre

et a1., при этом температура отмывки для L-PHK составляла 24 С, а для

S-PHK - 56 С. Высушенные фильтры экспонировали с рентгеновской пленкой.

Пример б. Изучение антиген- ных свойств штамма МЛ-29.

Антигенную активность штамма МЛ-29 изучали с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител (НМФА). Используя НИФА, исследовали полученный штамм, а также сыворотку морской свинки, иммунизированной этим штаммом. В качестве положительных контролей применяли антигены вируса Ласса и Мопейя, антитела сыворотки морской свинки, иммунизированной культураль-. ными антигенами .из вирусов Ласса и

Мопейя.

НИФА между штаммом МЛ-29 и гомологической сывороткой, а также сыворотками, полученными к вирусам Ласса (штаммы Джозия и Сьерра-Леоне) и Мо78176 6 пейя, поз волял на Г>людат ь спе цифическую флуоресценцию в культуре клеток

Vего. Специфичность подтверждалась отсутствием свечения при взаимодействии неиммунных сывороток с вирусом и иммунных с незараженной культурой клеток. Титр антител в сыворотках составлял 1:256-1:512.

Специфическую антивирусную сыворотку получали путем гипериммунизации морских свинок вирусным антигеном, представляющим культуральную жидкость. Схема иммунизации представлена- в таблице.

Пример 7. Изучение протективных свойств штамма MJ1-29.

Для изучения протективных свойств штамма МЛ-29 использовали мышей ли20 нии СВА. Нивотных иммунизировали дважды внутрибрюшинно с интервалом. в семь дней. Через 10 дней после последней иммунизации мышам вводили летальную дозу вируса Ласса в мозг. Жи25 вотных наблюдали в течение 21 дня после введения разрешающей дозы вируса Ласса. В течение этого периода гибели животных не наблюдалось. Штамм

МЛ-29 обеспечивал 1003 защиту мышей от летальной дозы вируса Ласса.

Таким образом, поставленная цель достигнута. Впервые удалось получить реассортантный штамм вирусов Ласса и

Мопейя для получения иммунобиологических препаратов.

35 формула изобретения

Птамм-реассортант аренавирусов Ла40 сса и Мопейя П(0 Р 907 для получения иммунобиологических препаратов.