Способ приготовления питательной основы микробиологических сред

 

Использование: в области культивирования микроорганизмов, в частности для производства бактериальных сред различного назначения. Сущность способа: 0,5 л цельной крови животных стабилизируют 35 мл 10%-ным раствором лимоннокислого натрия . К 0,5 л стабилизированной крови добавляют0 .17л смеси растворов хлористоводородной и муравьиной кислот, взятых в концентрации 6н и соотношении 1:1. Смесь автоклавируют при 121°С и давлении 1 атм в течение 45 мин, получают гидролизат. К гидролизату добавляют равную часть водопроводной воды и активированный уголь в количестве 20 г/л, тщательно перемешивают смесь в течение 1 ч. Смесь фильтруют под вакуумом через бумажный фильтр. Доводят рН фильтрата ЮН р-ром гидроокиси калия до значения 6,5-6,8. Вновь добавляют 10 г активированного угля, смесь перемешивают и через 30 мин фильтруют. В полученный фильтрат вводят 10-12% осветленной молочной сыворотки, перемешивают смесь. Смесь упаривают на вакуум-выпарной установке до содержания сухих веществ 20- 25%. Сушеную смесь высушивают при температурах: 70± 5°С на выходе и 150± 5°С на входе распылительной сушилки до остаточного содержания влаги5 ± 1 %. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (l9) (l 1} (sl)s С 12 N 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4828500/13 (22) 22.05.90 (46) 23.11.92. Бюл. М 43 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт комплексного использования молочного сырья (72) Т.Е.Шиловская и E.Н.Литвинец (56) Денисова С.В., Лобова Е.А., Раскин Б.М.

"О возможности создания малоотходного сывороточного производства и рациональном использовании вторичного сырья". — Ж.

Гигиена и Санитария, 1988, М 12, стр. 24-26. (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД (57) Использование: в области культивирования микроорганизмов, в частности для производства бактериальных сред различного назначения. Сущность способа: 0,5 л цельной крови животных стабилизируют 35 мл 10%-ным раствором лимоннокислого натрия. К 0,5 л стабилизированной крови доИзобретение относится к микробиологии и касается получения питательной основы микробиологических сред.

Существует достаточно большое коли- чество рецептур питательных сред, однако число белковых основ и видов сырья для их получения ограничено.

Известны способы приготовления белковых основ для питательных сред путем гидролиза исходного сырья животного происхождения.

В качестве сырья применяют полноценные белковые продукты, В условиях обострившегося дефицита актуальна задача о выборе сырья для приготовления основ пибавляют0,17л смеси растворов хлористоводородной и муравьиной кислот, взятых в концентрации 6н и соотношении 1:1. Смесь автоклавируют при 121 С и давлении 1 атм в течение 45 мин, получают гидролизат, К гидролизату добавляют равную часть водопроводной воды и активированный уголь в количестве 20 г/л, тщательно перемешивают смесь в течение 1 ч. Смесь фильтруют под вакуумом через бумажный фильтр. Доводят рН фильтрата 10 Н р-ром гидроокиси калия до значения 6,5-6,8. Вновь добавляют 10 г активированного угля, смесь перемешивают и через 30 мин фильтруют. В полученный фильтрат вводят 10-12% осветленной молочной сыворотки, перемешивают смесь.

Смесь упаривают на вакуум-выпарной установке до содержания сухих веществ 2025 ..Ñóøeíóþ смесь высушивают при температурах: 70й 5 С на выходе и 150 5 С на. входе распылительной сушилки до остаточного содержания влаги 5 +. 1%. тательных сред и замена дорогостоящего и дефицитного пищевого сырья на менее до- 4 рогостоящее вторичное сырье. сь о

Известен способ приготовления пита- () тельной основы для выявления и учета мо- С) лочнокислых бактерий в молоке и молочных продуктах, предусматривающий гидролиз исходного сырья панкреатином в присутствии хлороформа, отличающийся тем, что с целью повышения-степени выявления молочнокислых бактерий и улучшения ростовых свойств основы, в качестве исходного сырья используют смесь подсырной сыворотки, мелассы и кормового витамин- B ц, взятых в следующем соотношении, м,".с.",,.,:

1776690

Подсырная сыворотка 65,0-75,0

Меласса 24.7-34,5

Кормовой витамин В)2 0,3-0,5 а гидрализ смеси ведут до содержания аминного азота 85-100 мг% и редуцирующих сахаров 9-10% (1).

Однако при гидролизе белка в присутствии углеводов разрушается значительное количество аминокислот, в том числе незаменимых (2).

В качестве прототипа можно считать способ приготовления питательной основы путем гидролиэа отходов сывороточного производства при переработке крови— эритроцитов(3).

Способ предусматривает гидролиз сырья крепкой соляной кислотой до содержания аминного азота 495 мг%, осветление полученного гидролизата активированным углем, сгущение и сушку до содержания сухих веществ 96%. Однако использование этого способа возможно лишь на предприятиях, имеющих цеха и оборудование по переработке крови, Применение крепкой соляной кислоты при гидролизе эритроцитов приводит к разрушению ряда аминокислот. Кроме того, в процессе осветления, полученный гидролиэат довольно обедняется витаминами и минеральными веществами.

Цель изобретения — упрощение способа и расширение спектра культивируемых микроорганизмов.

Поставленная цель достигается применением в качестве сырья для приготовления питательной основы цельной крови животных и молочной сыворотки, которые содержат все необходимые для питания микроорганизмов ингредиенты: азотистые и углеродсодержащие вещества; углеводные компоненты, фосфорные соединения и витамины.

Белковые вещества крови по своему аминокислотному составу относятся к полноценным белкам.

Применение вторичного сырья мясной и молочной промышленности позволит решить ряд проблем по рациональному использованию имеющихся ресурсов пищевого сырья, внедрение в производство безотходных технологических процессов, предотвращение загрязнения окружающей среды, что имеет экологическое значение, а масштабы производства позволяют получать большое количество такого сырья.

Среди отходов молочной и мясной промышленности обращают внимание кровь и молочная сыворотка, характеристика которых представлена в табл. 1, 20

30

35 ной основы необходима ее стабилизация, в

45

55 роточных белков

Кровь содержит в значительном количестве белки почти без углеводов; в то же время молочная сыворотка содержит много углеводов, особенно, дисахарид, лактозу и мало белков.

Основной состав крови постоянен, чему способствует деятельность выделительных систем органйзма животных, идет постоянное обогащение ее гормонами, ферментами и другими биологически активными веществами, Кровь и молочная сыворотка полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к сырью при приготовлении основ и сред в производственном масштабе: высокая питательная полноценность, доступнЬсть, низкая стоимость.

Исследования отходов мясной и молочной промышленности, в частности сыворотки и крови животных, показали, что их окисляемость достигает 440000 мг/л и биохимическое потребление кислорода до 1580 м/л в сутки.

Такие отходы перед сбросом в канализацию нуждаются в разведении не менее чем в 400 раз, что связано с потреблением значительного количества пресных вод.

Следовательно, остро стоит проблема утилизации указанного сырья. В то же время увеличение переработки скота на мясокомбинатах приводит к значительному росту ресурсов крови.

При использовании крови животных как одного из основных компонентов питательрезультате чего увеличивается количество белковых веществ за. счет остающегося в ней фибриногена и эритроцитов.

Способ производства питательной основы осуществляется следующим образом

Стабилизированная 10%-ным раствором лимоннокислого натрия кровь животных нагревается с 6н раствором смеси

° соляной и муравьиной кислот в соотношении 1: 1 автоклавированием при температуре121 С,давлением1 атм, втечение45 мин.

В полученный гидролизат добавляют активированный уголь из расчета 20 г/л и равную часть водопроводной воды.

Смесь перемешивают в течение 60 мин, после чего фильтруют под вакуумом.

Фильтрат оттитровывают с помощью раствора щелочи до рН 6,5, повторно добавляют активированный уголь и снова фильтруют.

Молочная сыворотка подвергается тепловой обработке с целью коагуляции сывоОптимальный режим коагуляции сывороточных белков можно принять следую1776690 ся с целью обесцвечивания гидролиэата и частичного удаления кислот адсорбцией древесным углем.

При проведении исследований выяснилось, что основным условием фильтрования полученных гидролизатов является 2-х кратное разведение их водопроводной водой.

Затем вносят активированный уголь.

Недостаток витаминов и минеральных веществ,-удаленных из гидролизата вследствие его очистки активированным углем будет восполнен при внесении 10-12 осветленной молочной сыворотки, которая по набору и абсолютному содержанйю витаминов является биологически полноценным продуктом. Количество отдельных аитаминов в сыворотке несколько выше, чем в молоке в результате молочнокеслого процесса.

50 щий: нагревание до температуры 92,5й

2,5"С; подкисление до рН 4.5ч 0,1, что соответствует 30-35 Т; выдержка при данной температуре 5 мин; раскисление до рН

6,25"= 0,25 (10-150Т); выдержка не менее 15 5 мин, фильтрация.

Затем кислотный гидролиэат крови смешивается с осветленной молочной сывороткой.

Приготовленную по предлагаемому 10 способу смесь сгущают на вакуум-выпарной установке до содержания сухих веществ 20.25 и высушивают на распылительной сушилке до остаточного содержания влаги

5-6 . 15

Обычно гидролиз животных белков осуществляют 6н раствором соляной кислоты.

Однако применение сильных кислот способствует более глубокому распаду белков, 20

- тем самым ухудшая качество гидролиэата. В связи с изложенным, для проведения гидролиза нами была опробована муравьиная кислота, которая по сравнению с соляной считается более мягкой. Но применение од- 25 ной муравьиной кислоты для гидролиза крови при укаэанных режимах не дало должного эффекта. Отрабатывались различные соотношения соляной и муравьиной кислот: 2:1; 1:1; 1:2. Оптимальным по амин- 30 ному азоту оказалось соотношение кислот

1: 1. При проведении кислотного гидролиэа немаловажным фактором является гидромодуль. Оптимальным принят гидромодуль

1 35 —, так как при более низких концентрациях

3 кислоты получаются гидролиэаты, не поддающиеся фильтрации.

Последующие операции осуществляютПри коагуляции белка под действием температуры и изменений рН в сыворотке осуществляется некоторый распад углевода — лактоэы. Таким образом, питательная основа в своем составе содержит как дисахарид, так и моносахарид, и, следовательно, ее можно использовать при выращивании различных групп микроорганизмов.

Кроме того, добавление 10-12$ осветленной сывсротки в питательной основе является оптимальным, поскольку общее содержание углеводов будет в пределах

0,45-0,53, что вполне обеспечивает энергетический обмен микроорганизмов.

Полученные питательные основы с 89 и 13-14 молочной сыворотки при испытании в средах показали несколько меньший рост микроорганизмов, например, стафилококков.

Полученная основа является достаточно полноценной. Содержание аминного азота 620-800 мг f „общего азота 1000-1200 мг, Степень расщепления белка 0,63+ 0,1.

На полученной основе можно готовить общепринятые питательные среды для выращивания широкого спектра микроорганизмов. В питательную основу добавляют агар-агар микробиологический 2-5 . другие компоненты в зависимости от питательных потребностей микроорганизмов и автоклавируют при 1210С в течение 15 мин.

Питательные среды с использованием предлагаемой основы не уступают общепринятым по биологическим показателям, что показано в таблице.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что состав основы отличается от известных питательных сред в результате использования нового совмещенного компонентного состава сырья мясной и молочной промышленности, полученного в результате гидролиза белковых молекул крови и последующего обогащения ее витаминным и углеводным составом молочной сыворотки, что соответствует. критерию "новизна"..

Существенными признаками изобретения являются:

1) Использование в качестве исходного сырья цельной крови животных вместо эритроцитов крови лошади по прототипу.

Это упрощает способ (нет необходимости выделять эритроциты и вести длительный гидролиз при высокой температуре), обогащает основу (эа счет использования белка плазмы крови), дает воэможность расширить границы определения различных групп микроорганизмов (на основе по прототипу растут только патогенные микроорганизмы, в то время как на предлагаемой

1776690

55 основе, кроме патогенных, растут молочнокислые и др. микроорганизмы), экономит энергию и материалы (за счет сокращения длительности гидролиза, более низкой температуры и меньшего расхода кислоты);

2) Проведение кислотного. гидролиза 6 н раствором смеси соляной и муравьиной кислот в соотношении 1:1, вместо 0,66 н соляной кислоты (что обеспечивает менее жесткий гидролиз и сохраняет необходимые для роста различных групп микроорганизмов вещества в основе).

3) Количество вносимой кислоты: 5,3 объема кислоты на 1 объем эритроцитов по прототипу и 0,34 объема кислоты на 1 объем крови по предлагаемому способу (повышает экономичность способа).

4) Добавление 10-12% осветленной молочной сыворотки (обогащает основу углеводами и сывороточными белками, что способствует расширению границ определения различных групп микроорганизмов).

Значения рН в предлагаемом способе в пределах 6 5-6,8 вместо 4,7-4,8 по прототипу предполагают большую возможность варьирования в зависимости от вида микроорганизмов, для которых готовится основа, 8ыаокая температура и длительность автоклавирования в прототипе необходимы для гидролиэа эритроцитов. При более низкой температуре процесс не пойдет, в то время, как гидролиз крови идет значительно быстрее и при более низкой температуре.

В табл. 4 показана зависимость роста микроорганизмов от соотношения кислот при гидролизе основы и значения рН. Оптимальным является соотношение 1:1.

Анализ известных составов питательных сред, используемых в микробиологии показал, что для приготовления сред используется сырье мясного производства.

Однако по способу обработки и химическому составу эти среды существенно отличаются от предлагаемого, что придает новые свойства средам, приготовленным на предлагаемой питательной основе. Это позволяет сделать -вывод о соответствии заявляемого решения критерию "существенные отличия".

Осуществление заявляемого способа поясняется с помощью примеров:

Пример 1. Берут 0,5 л цельной крови животных, смешивают с 35 мл. 10%-ного раствора лимоннокислого натрия. Стабилизированную кровь смешивают с 0,17 л смеси (1:1) 6 н растворов соляной и муравьиной кислот. Смесь тщательно перемешивают и автоклавируют при 121 С и давлении 1 атмосферы в течение 45 мин. По окончании гидропиза к полученному гидролизату в Ко5

45 личестве 0,5 л добавляется такое же количе ство водопроводной воды и 20 г активированного угля, тщательно перемешивают в течение 1 ч, после чего фильтруют под вакуумом через бумажный фильтр.

Активную кислотность фильтрата доводят с помощью 10 н раствора КОН до рН

6,5-6,8 и добавляют еще раз 10 r активированного угля. Смесь перемешивают и через

30 минут фильтруют.

Параллельно с проводимой работой подготавливают молочную сыворотку, С целью коагуляции.сывороточных белков подсырную сыворотку подкисляют до рН 54,5, нагревают до температуры 95 С и выдерживают 5 мин, а затем фильтруют.

Полученный гидролизат крови в количестве 1 л смешивают со 100 мл осветленной молочной сыворотки.

Подготовленную смесь сгущают на вакуум-выпарной установке при температуре не выше 65 С до содержания сухих веществ

20-25% и высушивают на распылительной сушилке до остаточного содержания влаги

4-6%. Допустимая температура нагрева в процессе сушки 130 С.

Питательная основа, приготовленная по предлагаемому способу, может использоваться при приготовлении сред для выявления и учета молочнокислых бактерий, кишечной палочки, стафилококков.

Примеры 2, 3, 4 осуществляются по примеру 1. Данные приводятся в таблице.

Изучен рост различных видов микроорганизмов (молочнокислых бактерий $сг.

lactfs, Str. dlafetffactfs, l cb, bufgaricum; колиформных бактерий Е. cofi; патогенных

Staphifococcus aureus) на опытной питательной основе с различным процентным содержанием молочной сыворотки.

Максимальный рост молочнокислых бактерий отмечен на среде, приготовленной на питательной основе с содержанием молочной сыворотки 12-13 ; максимальный рост патогенной микрофлоры на средах, приготовленных на питательной основе с

9-10 молочной сыворотки.

Использование заявляемого технического решения в качестве основы для питательных сред позволяет: а) увеличить границы определения различных групп микроорганизмов; б) увеличить высеваемость живых клеток микроорганизмов; в) максимально использовать вторичное сырье мясной и молочной промышленности, что имеет экологическое значение в масштабах страФормула изобретения

Способ приготовления пи а ..»,qьной основы микробиологиями.ск г:,i v,,1н. ак1

1776690

Табл и ца1

Физико-химические показатели крови и молочной сыворотки

Таблица2

Таблица щий добавление к исходному сырью хлористоводородной кислоты. автоклавирование, фильтрацию полученного гидролизата, нейтрализацию его, осветление нейтрализата с помощью активированного угля и сушку целевого продукта при температуре 150ОС на входе и 75 С на выходе сушильной установки, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и расширения спектра культивируемых микроорганизмов, в качестве исходного сырья используют стабилизированную кровь животных, к которой добавляют в соотношении 1: 0,34 смесь 6 н растворов хлористоводородной кислоты и муравьиной кислоты, взятых в соотношении

1:1, автоклавирование проводят при 121 С в течение 45 мин, после автоклавирования

5 полученный гидролизат разводят водопроводной водой в соотношении 1:1 и добавляют активированный уголь, полученную смесь фильтруют, а фильтрат нейтрализуют гидроокисью калия до рН 6,5-6,8, к освет10 ленному нейтрализату добавляют 10-12 (, осветленной молочной сыворотки, перед сушкой смесь сгущают до массовой доли сухих веществ 20-25, .%.

1776690

Таблица 4!!ятател ная olla>a . Среднее количество колоний на чашках пря посеве культур: ! ! !

Ю z iгй г.г NMgu/w. 4Ъм г - Ж

4ет и е

4,0хХ07

Х2,0х108

2,9хПР

3,5xI07

2,7хЛ!8 п,апР

Таблица 5. Соотноиение !соляной !Массовая доля Количество микроорганнэмов и муревищой «долот !Е среди !аминногд аэо-

У молочнокислнх бактерий!коащлаэсполокителыщх ! ! стафилококков

2:I

5, ТхПР

7,2xl0 . 4,8xI06

I:2

Табяица,6!

Соотноаение!Количество Массовая доля Количество, KGE ! 6 н вносимой

ПРи"еР растворов !молочной l awaora l углеводов, !витещнов, !молочно- !коагулеэополоаи-! оиворотки,!!! аэота, Я $ . мг кг .. !кисин@акт.! тельных стафял.

0,40 0,05

0,490,(Ь

0,54х0,05

0,56 0,05

Составитель Е.Литвинец

Техред М.Моргентал . Корректор Н. Ревская

Редактор

Тираж Подписное

Заказ 4100 ниям и отк ытиям при ГКНТ СССР

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и р

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент,, р

" Г, УжГО Од, ул.Гяа1 ; ц. 101

Предлагаемая основа с добавлением araya

Агар о гядролиэованюн молока! лел точно-cîmåâoé агар

Среда Keoeiay агаровая

6,040, I

6, Ф0, I

7,ФО, I

l0

I2 тз

0,42-0,45

0,60-0,80

0,40-0,43

0,6-0,8

0,6-0,8

0,6-0,8

0,6-0,8

6,9xIO

6,ахт08

0,94х0,2

1,05"0,2

" 1,26х0,2

I,37х0,2

3,2т04

5,8хПР

5xIO5

9,4xIO

9,2xI0

6,Ы08

7,2хЗР

5,8xIO

5,8хП!8

7,4xI07

7,2xI07