Штамм бактерий еsснеriснiа coli
Использование: биотехнология, генетическая инженерия. Сущность изобретения: сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pSV11, содержащая детерминанту с геном аасС2а. Данной плазмидой трансформируют штамм-реципиент E.coli K12JM101, получен рекомбинантный штамм, задепонирован в коллекции ВНИИА под номером 2С75. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (. с (ъ
СО Î (21) 4854156/13 (22) 27.06.90 (46) 15.09.92. Бюл. N 34 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (72) С.Б.Вакуленко, Е,Г,Энтина, И.П,Фомина и С.М,Навашин (56) Allmansberger R, et al. Mol. Gen. Genet., 1985, N 198, 514-520.
Vliegenthart I, ес al. Antimicrob. Agents
Chemother, 1989, 33, N 8, 1153-1159. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA
COLI, СОДЕРЖАЩИЙ РЕКОМБИНАНТИзобретение относится к биотехногогии и, в частности к генетической инженерии, и представляет штамм, полученной методом генетической инженерии и содержащий в составе рекомбинантной плазмиды детерминанту резистентности к гентамицину, сизомицину, тобрамицину и нетилмицину, обусловливающую синтез 3
-аминогликозидацетилтрансферазы типа
l la.
3 -аминогликозидацетилтрансфераза типа lla — фермент, продуцируемый клиническими штаммами микроорганизмов и обусловливающий инактивацию таких клинически важных антибиотиков, как гентамицин, тобрамицин, сизомицин и нетилмицин, в результате чего продуцирующий этот фермент штамм микроорганизма приобретает резистентность к перечисленным антибиотикам.
» Ы» 1761807 А1 (я)з С 12 N 15/31, С 12 R 1: 19
НУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДН К PSV11, КОДИ РУЮЩУЮ 3 -АМИНОГЛИКОЗИДАЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ (57) Использование; биотехнология, генетическая инженерия. Сущность изобретения: сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pSV11, содержащая детерминанту с геном аасС2а. Данной плазмидой трансформируют штамм-реципиент Е,coli
K12J М101, получен рекомбинантный штамм, задепонирован в коллекции ВНИИА под номером 2С75. 1 табл.
Целью изобретения является создание генно-инженерного штамма, содержащего в своем составе ген аасС2а, и продуцирующего 3 -аминогликозидацетилтрансферазу типа lla.
Ген аасС2а, входящий в состав рекомбинантной плазмиды, может быть использован для конструирования ДНК-зонда, используемого при детекции гена аасС2а или близкородственных ему генов методом
ДНК-ДНК гибридизации, Для достижения поставленной цели была сконструирована рекомбинантная плазмида pSV11, состоящая из векторной плазмиды pUC19, в полилинкер которой встроен Hindlll фрагмент клонированной и секвенированной детерминанты резистентности, содержащей ген аасС2а. При помощи метода Сэнгера определена нуклеотидная последовательность этой детерминанты резистентности.
1761807
Нуклеотидная последовательность клонированного из клинического штамма Е.coli и секвенированного нами Н ndlil фрагмента
ДНК приведена в таблице.
Ген, входящий в состав секвенирован- 5 ной детерминанты резистентности, содержит открытую рамку считывания размером
856 п,н., кодирующую фермент ААС(3)-lla u локализованную между 819 и 1676 нуклеотидами, начиная от 5 конца. Показано, что 10 ген кодирует белок мол.м. 30,6 килодальтон.
При сравнении последовательности структурной части секвенированного гена с последовательностями структурных частей генов аасС2 плазмид pWP14a, pWP116a, 15
pJV03 и pWP113a обнаружено в общей сложности 43 нуклеотидные замены, определившие 20 аминокислотных замен в молекуле фермента, т,е, наблюдается 5,0 < различий в нуклеотидном составе и 7,37, — 20 в аминокислотном, Выявлено, что секвенированный ген содержит отличный от известных ранее промотор и ряд нуклеотидных замен в структурной части, На основании определе- 25 ния степени гомологии секвенированного гена с известными генами аасС2, секвенированный ген отнесен к типу аасС2а.
Сконструированной рекомбинантной плазмидой, имеющей в своем составе сек- 30 венированный ген аасС2, трансформируют лабораторный штамм Е.coli К 12 JM101.
Для достижения цели использован штамм Escherichia cali коллекция ВНИИА N
2075 — содержащий рекомбинантную плаз- 35 миду pSV11, содержащую в своем составе фрагмент с геном ассС2а, Штамм получен трансформацией штамма E.coll JМ101 плазмидой pSV11, Штамм Escherichia coli коллеция 40
ВНИИА N 2075 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки, Клетки прямые, палочковидной формы
1,2-1,6х2,0х6,0 мкм, подвижные, с перитри- 45 хиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные, Культуральные признаки.
Клетки хорошо растут на простых питательных средах. 50
При росте на мясо-пептонном агаре, питательном агаре "Дифко" — колонии гладкие, круглые, прижаты, блестящие, серые, край ровн ы й, мутн ые.
При росте в жидких средах; мясо-пеп- 55 тон ном бульоне, L-бульоне образуют ровную, интенсивную муть, Физиолого-биохимические признаки, Клетки растут в пределах 4 — 45 С при оптимуме рН 6,8 — 7,5, Проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием гена Ыа в векторной части плазмиды pSV11, а также резистентность к гентамицину, сизомизину, тобрамицину и нетилмицину, обусловленную геном аасС2, входящим в состав рекомбинантной плазмиды pSV11.
Пример. Клетки клинического штамма
E.coli 164, резистентного к гентамицину, тобрамицину, сизомицину, нетилмицину, и продуцирующего фермент ААС(3)-lia, выращивают в 1=бульоне в течение ночи при
37 С, Иэ бактериальной суспензии изолируют ДН К R-плазмиды, имеющую мол.м. 70 Мд и содержащую детерминанту резистентности к гентамицину, тобрамицину, сизомицину и нетилмицину. Выделенную ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции
Hindi ll и лигируют с ДН К векторной плазмиды pUC19, гидролизованной эндонуклеазой
Hindi ll, Смесью, содержащей лигированные молекулы, трансформируют реципиентный штамм Е,coli JM101. Трансформанты, содержащие рекомбинантные плазмиды, оТбирают на агаризованных средах, содержащих гентамицин в концентрации
10 мкг/мл, Отобранные трансформанты рассевают до отдельных колоний на агаризованной среде LB, содержащей 10 мкг/мл гентамицина. Отдельную колонию выращивают в жидкой питательной среде LB в течение ночи и выделяют ДНК щелочным методом. Проводят в стандартных условиях гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции Hindlll и в присутствии маркеров молекулярной массы устанавливают, что детерминанта реэистентности к гентамицину, сизомицину, тобрамицину и нетилмицину находится в составе Hindlll фрагмента размером 2,3 т.п.н.
Таким образом, плазмида рЯИ 1, полученная в результате встраивания Hindlll фрагмента R- плазмиды клинического штамма Escherichia coli размером 2,3 т.п,н. в полилинкер векторной плаэмиды pUC19, содержит в своем составе ген резистентности к гентамицину, сизомицину, тобрамицину и нетилмицину, При трансформации рекомбинантной плазмидой реципиентного штамма Е.coli
К12 JM101, получают штамм, содержащий ген аасС2а и продуцирующий 3 аминогликозидацетилтрансфераэу типа lla.
Штамм Escherichia cali, содержащий рекомбинантную плазмиду, культивируют в 1бульоне в течение ночи в присутствии гентамицина в концентрации 5 мкг/мл. Из
200 мл ростовой среды, когда концентрация клеток достигнет стационарной фазы, щелочным методом выделяют плазмидную l 761807
4i1
110
90 (.! ((((10
1 0(i
1 TTTGGTACТС TCAGAATACC СТТТ(бйБТТ CGÒÒÒÒÒGÒG ССййСЙЬЙЙ: ДБСССЬТЙББ ТЙЙЯТСТСББ йБСЙТТТСЙБ BAACTGTCTB TGTGAGTTGA йтстбйдтбб
111 Сйзттййтйт ТТТЙЕТ)ЬЬТС йй ЬТС.ТЙЕ Б. ЙБТТЕ(A .ЕСЙЕБ= Ей ССТСБТ, Т, ТЕЬСйЕЕС:Ь ТТТ7АСААСА БЕЙЕБЕЙЕЙД СТЙТТ ТСТС ЙЙСЙССТТСБ
221»гб(БС(ббйй TCATGGTTCC ЙТСЙ(СБгй.т ЙД.Д(БЙС(6 AT ÉAÑÁòéò ::3CAAGATò Ббй TTCACC ЙтС(бстсйт БНЙ»БСБДСт ББТ!Дбтттй СбгБСтгСЙД
511 йТТСйБСЙЙЙ ЙЙСЙССЬСТй ЙЙТ6ТСССТТ СЬ! ЕббтйЬ Тт Тг ЙТ»д(»BA,) Ей
" .41 СБтБтббт5Й СБЙТЙССЙЙБ TTCAG !Tiò (БСЙЙ ййддб GCH ATL A;,ЙЬСЬСЙЬСB Б.сйбгйббй G
55!
-10 Тдтййт
-.-,5 ттбйсд
b6l CCGTTB)!TG ЙЬйййй(6(БС ТТДЙТБТЙБТ НТТСД(Ь ТБ 7НЬЙТЬ 4 ЬТЬТТ!БЕТТ ТДЬДДБСТСЙ ТТТТЙЙ йТС iA :ййС;ТТТ Ттсйййй(нйт ЬТ(й йдбб!Сдйтдд СББЙЬБСЬСТ ТСййнййстС БЕЙБТССйнй СС66(БЙСС!
721 ССТБТТТБТБ ЬйбТТТТБСй ЙБТ(ЬСС7СЕЙ ТТТЙЬЙЬЬЙЬ Aт(ЙТСЬ:Е ЬСЙ:й:.Ь 66
991 AC(7iATCBTB ббнССбнТ:A CCC.AÛB:. ЙЬЙ г! Ь Йй Е(сес с 6 !(2СЙТ:AC((днйсССО CB (Йсс!Ььсс(7 CiG .i((нТС (. »ÉA).6!.-I Сй)(нст,д. .
1101 СБТ5ББТТСБ БССТБСТБЙЙ ТСйБТТТС! ЕТТСЙНЬ»СС ССЕЕСЕ.БСЬ БС!ЬСДБСССБ СЙССССбй(Ь Сйт!Сбйт(5(БТ СБССЬТ(66Т ССЙСТЕЬ 1G йййЛТБЙ
1211 ббйбССТСй ййбстс БТС ЙСБСС. 666 -ЬЙЙЬ = Сб ССЕ. ЕЙЕ ЕЬТ >СЕ С ТЕЬС666 ййЬЕСС»СТЬС TЕTT ЕБТБС Ес Б;.ЙЙЙС,ССБТТ CЕB
ЙСтнтйбсйй Й BC. )йССТ :-ЙЙЕСТСБЬт СБССЙТСБЙЬ ЙЙБЕтбтСЬт
)4;11 TACGATTCAA ЙСБЬСЙТ C СЕЙТТЕСТТ! ЕС! -. СЕЙЙ.= ..ЙЙЙЕССЬЕн
1541 БББСТТТ6СТ СЙБ16СТЙСС 7611CCI;CBC -Сд!Ьбн-й(5(гЬЙСЕ-7CL БС57CA :CTA ТС7ТБЙЕЙЙБ СЙТТ.CGЬAA ССЙС7ССЬЙ(СЬТЕССЙ(1251 СБТТССЙЙНТ СЕСTGA(i;Т ТЕ))(.С!(Ейб .Йййг =
1571 СЙЙЙЙЙСТ5С ССйЬйййЬТТ ййтй!"1».ТЙ. : ДЙТТ: 11;» CT, BAB"ATT йДЬЬЙД".Т ТСTAATAAAT Т(ЙТТСЙНБ ЙйййтйййСй ATCTA 1СНД НДЙБТТЬЙНЕ
l96l AAATATTACA (йССйТййтй ССТЕГтсй(1(й . ЙДЕ T(C!»AAAA !БДЙ 091 GAAGeAGAAA ТТДТТСЙЙ55 БГНД.ДС(- Й l)Д)й- БТТНЬ ТН(ЬЙГ(751СТ ДС7ЙЬЙЙC ЙД TT
221(1 CAATTTCTTA ЙЙБТТСТЙЕТ йбТС(С!".! " "С .=С г76 Й()й 7 гйй A Т:СССЙгй СССТGCTTTТ;Дй
ДНК. При этом выделяется приблизительно
50-80 мкг плазмидной ДНК со 100 мл бульона, Проводят рестрикцию 10 мкг плазмидной ДН К эндонуклеазой рестрикции Есо RV.
Фрагмент размером 537 п.н. вырезают из геля, проводят его электроэлюцию в диализный мешок, очищают двукратной экстракцией фенолом, двукратным осаждением этанолом, Радиоактивное мечение фрагмента проводят реакцией ник-трансляции.
Радиоактивно меченый фрагмент используют в качестве зонда в экспериментах по
ДН К-ДН К гибридизации.
Таким образом при использовании полученного нами штамма Escherichia cali коллекция ВНИИА N 2075, содержащего рекомбинантную плазмиду с геном аасС2а, можно сконструировать ДНК-зонд, специфичный для гена аасС2а. Этот ДНК-зонд может применяться для детекции
5 резистентных к гентамицину клинических штаммов, содержащих ген аасС2а, и вследствие этого, наиболее рационального выбора антибиотика при химиотерапии гнойно-септических и особо опасных инфек10 ций.
Формула изобретения
Штамм бактерий Escherichia coli
ВНИИА М 2075, содержащий рекомбинант15 ную плазмидную ДНК pSV11, кодирующую
3 - аминогликозидацетилтрансферазу. и ll- .- Е ! Сд(ЕС Е(7 Сб B ббдбй C,A:CA!:I:-н!: Cl Al:Al B(йй! AAIC
